Name: Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende un protocolo optimizado de disociación tisular para análisis de células individuales en vejiga de ratón tras lesión medular. Este método genera suspensiones celulares con alta viabilidad para citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A y D.R.B). Reconocemos valiosas aportaciones del Dr. Stuart Orkin en la División de Hematología/Oncología, el Hospital infantil de Boston, el Departamento de Pediatría, la Escuela de Medicina de Harvard y el Dana-Farber Cancer Institute. También reconocemos el apoyo de Kyle Costa en la atención postoperatoria de ratones, Mary Taglienti y el Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Laboratorio Dr. Yang Shi, Departamento de Pediatría, División de Medicina del Recién Nacido, Departamento de Pediatría, División de Medicina del Recién Nacido, Hospital infantil de Boston, Escuela de Medicina de Harvard) para asistencia técnica y discusiones útiles.

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</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El modelo de lesión de la médula espinal del ratón descrito aquí proporciona un método reproducible para crear una obstrucción funcional de la salida de la vejiga debido a la pérdida de coordinación entre la contracción de la vejiga y la relajación del esfínter uretral externo. Esto a su vez evoca una profunda remodelación de la pared de la vejiga tan pronto como 2 semanas después de la lesión caracterizada por la expansión de los compartimentos musculares uroteliales y lisos. Los pasos críticos en la implementación del modelo SCI en roedores incluyen (i) una atención rigurosa a la expresión manual de la vejiga durante el período de choque espinal que se produce durante 10\u201214 días después de la lesión; (ii) enriquecimiento nutricional para minimizar la pérdida de peso; y (iii) mitigación del potencial de escaldado de orina, particularmente para experimentos que se extienden más allá del retorno de la anulación de reflejos. Las limitaciones del modelo incluyen el potencial de oclusión uretral en ratones a partir de coágulos sanguíneos durante el período de hematuria transitoria, y adicionalmente en ratones machos de coagulum de semen después de la eyaculación retrógrada después de la cirugía.
El enfoque de disociación de tejidos descrito aquí ilustra la importancia de considerar los cambios estructurales en los tejidos que surgen del insulto experimental, en este caso la remodelación significativa de tejidos después de SCI que puede influir en los análisis posteriores. Con el aumento de los análisis unicelulares es fundamental garantizar que las diferencias observadas en la expresión génica no sean simplemente el resultado de perturbaciones inducidas por la disociación, sino que sean verdaderamente representativas de los cambios biológicos subyacentes relevantes para el modelo de enfermedad. El uso de datos de expresión disponibles públicamente nos permitió modificar la formulación de búferes de digestión para garantizar una digestión eficaz de la matriz extracelular al tiempo que maximizamos la viabilidad. Las modificaciones adicionales que podrían considerarse en futuras aplicaciones incluyen la adición de actinomicina D, para detener la transcripción de genes tempranos inmediatos que son sensibles al protocolo de disociación15.
La técnica de pipeteo es crucial a la hora de disociar tejido o transferir células que ya están en suspensión. Para reducir el daño físico a las células de las fuerzas de cizallamiento, es importante pipetear suavemente y lentamente durante la resuspensión celular. Por lo general, se recomienda utilizar puntas de pipeta de diámetro ancho. Si se utilizan puntas estándar, es particularmente importante pipetear las suspensiones celulares suavemente para evitar fuerzas de cizallaje que de otro modo dañarían las células. El uso de coladores celulares es inevitable en este protocolo, sin embargo, la concentración celular puede disminuir en un 20% o más, acompañada de una pérdida de volumen de 100 μL o más. Recomendamos que se determine la concentración celular después del esfuerzo para garantizar un recuento preciso de células.
En la citometría de flujo, los controles FMO proporcionan una medida de fondo debido al sangrado de la señal de los picos de emisión superpuestos. No son una medida de unión de anticuerpos inespecífico, o tinción de fondo que puede estar presente cuando un anticuerpo se incluye en ese canal. Para tener en cuenta el enlace de anticuerpos no específicos, hay que incluir controles de isotipo adecuados; para la tinción de fondo, uno necesita incluir controles negativos. En conjunto, estos controles garantizan una medición precisa de las poblaciones celulares.

Perturbaciones de la función normal de la vejiga urinaria pueden conducir a una disminución de la calidad de vida para muchas personas. Con el fin de obtener una mejor comprensión de cómo la lesión o enfermedad descarrila la función normal de la vejiga, es importante sondear el estado biológico normal de las células dentro de la vejiga y cómo cambian bajo perturbación experimental. Hasta la fecha, sin embargo, las poblaciones celulares específicas que residen dentro de la vejiga urinaria, y cómo cambian con lesiones, se han caracterizado incompletamente.
Los métodos de generación de perfiles de células únicas, como la citometría de flujo o la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), tienen el potencial de arrojar luz sobre tipos de células específicos dentro de la vejiga. Sin embargo, para que estos enfoques sean tejidos informativos deben digerirse de una manera que no afecte la viabilidad, la expresión génica y los porcentajes representativos de población celular del tejido cosechado. Los protocolos que emplean la desagregación enzimática pueden afectar la expresión de marcadores superficiales a través de la actividad de proteasa indiscriminada1,afectando así a la identificación celular por citometría de flujo, mientras que el propio proceso de disociación puede conducir a la inducción de genes tempranos inmediatos, como describieron recientemente Van den Brink y sus colegas2. Los autores mostraron que aunque la subpoblación afectada por la disociación era pequeña, podría desencadenar una fuerte señal contaminante en estudios de expresión a granel debido a los altos niveles de expresión de los genes tempranos inmediatos. Además, la duración del protocolo de disociación afectado detectó niveles de expresión masiva de genes que se demostró que son únicos para algunas subpoblaciones. Por lo tanto, los conjuntos de datos unicelulares generados sin tener en cuenta el impacto del protocolo de disociación pueden producir cambios en la expresión génica derivados del método de disociación, en lugar de la biología subyacente. Estas observaciones sugieren que los datos de transcriptómica de una sola célula publicados deben interpretarse con precaución, y que los resultados deben ser validados por métodos independientes.
Aunque, los métodos de disociación duros y largos pueden alterar la expresión génica en las células2; el aislamiento efectivo de las células es esencial para obtener una representación precisa de los tipos de células presentes. Dado que la vejiga es un órgano complejo que comprende múltiples tipos de células, algunas poblaciones como las células uroteliales o estromales pueden estar relativamente infrarrepresentadas, mientras que otros tipos celulares como los fibroblastos existen dentro de la matriz extracelular y pueden ser difíciles de aislar. La disociación se vuelve aún más difícil si la vejiga ha sido sometida a una remodelación significativa y fibrosis como la observada en la lesión de la médula espinal3,4 u obstrucción de salida de la vejiga5,6.
Aquí, describimos un método de disociación de tejido optimizado para el análisis de células individuales aguas abajo en la vejiga del ratón lesionada de la médula espinal. Usando citometría de flujo, comparamos cuatro protocolos de digestión enzimática por su capacidad para producir una sola suspensión celular, apoyar la viabilidad celular y mantener la proporción correcta de poblaciones celulares. Sobre la base de este análisis, llegamos a la conclusión de que minimizar la muerte celular, agregados celulares, ácidos nucleicos no celulares e inhibidores potenciales del análisis posterior son críticos para lograr datos de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>2.5 X Lupas de aumento</td> 7-0 Sutura <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl, aguja de 6.5mm 3/8 círculo</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro de celdas</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase en BPBS, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de aerosol Puntas de pipeta de orificio ancho (1000 &micro; L)</td> <td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de aerosol Puntas de pipeta de orificio ancho (1000 y micro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-ratón CD326 (Ep-CAM), monoclonal para ratas, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, monoclonal para ratas, IgG2b, &kappa;, Clon 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección micro BERN, rectas, 1x2 dientes, 3,75" de longitud, ancho de punta de 0,3 mm, dientes de 0,12 mm</td><td>Compañía de instrumentos quirúrgicos ROBOZInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Micro Soporte de aguja, recto con bloqueo, 5.75" de longitud</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Kit de recuento de células, 30 portaobjetos de doble cámara, 60 recuentos, con azul de</td><td>tripano Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de tinción celular</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Colagenasa Tipo III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa, Tipo 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Apoptosis de Células Muertas con Anexina V Alexa Fluor 488 & Yoduro de propidio (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,NADA</td> <td># 140-913 Aprobado por la FDA. N.º de lote: AH01CGP</td><td>Solución inyectable al 2,27%</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos centrífugos cónicos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) Anticuerpo, monoclonal de rata, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa de testículos de oveja, Tipo II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Tijeras de resorte de microdisección, rectas, 4" de largo, 0,15 mm de ancho de punta</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 anticuerpo CD19 anti-ratón, monoclonal de rata, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Canal</td></tr> <tr><td>de descargaPE/Cy5 anti-ratón CD3 y épsilon; Anticuerpo, hámster armenio monoclonal, IgG, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Canal de descarga</td></tr> PE<tr><td>/Cy5 anti-ratón CD4 Anticuerpo, monoclonal de rata, IgG2b, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Canal</td></tr><tr><td>de descarga PE/Cy5 Anticuerpo CD8a anti-ratón, monoclonal de rata, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Canal</td></tr> <tr><td>de descargaPE/Cy5 anti-ratón NK-1.1 Anticuerpo, monoclonal de ratón, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Canal</td></tr><tr><td>de descarga PE/Cy5 anti-ratón TER-119/Anticuerpo de células eritroides, IgG2b, &kappa;, purificado por afinidad</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Canal de volcado</td></tr><tr><td>Purificado Rata Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block), rata monoclonal, IgG2b, &kappa;, clon 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis RBC (10X)</td><td></td><td>Tampón de</td> lisis de glóbulos rojos BioLegend 420301 <td></td></tr><tr><td>1x</td><td></td><td></td> Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca Biolegend 420201<td></td></tr>, <tr><td>1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica triple (neomicina/polimixina B/bacitracina)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>protector de la piel</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), rojo sin fenol</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin ungüento para los ojos</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Aprobado por la FDA.</td><td>Proteger los ojos durante la anestesia</td></tr></tbody></table>

un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Describimos la implementación de lesiones de la médula espinal en ratones para provocar disynergia de detrusor-esfínter, una obstrucción funcional de la salida de la vejiga y una posterior remodelación de la pared de la vejiga. Para facilitar la evaluación de la composición celular de la pared de la vejiga en ratones lesionados y de control no lesionados, desarrollamos un protocolo de disociación optimizado que apoya la alta viabilidad celular y permite la detección de subpoblación discreta por citometría de flujo.
La lesión de la médula espinal se crea mediante la transección completa de la médula espinal torácica. En el momento de la cosecha de tejidos, el animal se perfunde con solución salina tamponada por fosfato bajo anestesia profunda y las vejigas se cosechan en el tampón de Tyrode. Los tejidos se pican antes de la incubación en un búfer de digestión que se ha optimizado en función del contenido de colágeno de la vejiga del ratón, según lo determinado por el interrogatorio de bases de datos de expresión génica disponibles públicamente. Después de la generación de una sola suspensión celular, el material es analizado por la citometría de flujo para la evaluación de la viabilidad celular, el número de célula y las subpoblaciones específicas. Demostramos que el método produce poblaciones celulares con mayor viabilidad del 90%, y una sólida representación de células de origen mesenquimal y epitelial. Este método permitirá un análisis preciso aguas abajo de los tipos de células discretas en la vejiga del ratón y potencialmente otros órganos.

Procedimiento quirúrgico El éxito de la transección torácica de la médula espinal está determinado por la evaluación de una serie de parámetros, el más obvio de los cuales es la parálisis del hindlimb. El animal se mueve sólo usando sus extremidades delanteras, arrastrando sus extremidades posteriores. De lo contrario, los niveles de actividad, incluyendo alimentación, aseo y estado de alerta suelen ser normales. Además, los animales pierden el control volicional de la vejiga, lo que resulta en la necesidad de expresión manual de la vejiga por parte del investigador cada 12 h hasta que el anulamiento reflejo vuelve a los 10 a 14 días después de la lesión. Después de la eutanasia, los signos adicionales del éxito de la lesión se relacionan principalmente con el aumento en la relación vejiga-cuerpo de peso, indicativo de la remodelación de tejidos. El análisis histológico revela hiperplasia dentro de los compartimentos musculares uroteliales y lisos3.
Preparación de la suspensión de una sola célula Utilizando datos de expresión disponibles públicamente, se determinó el enriquecimiento del tejido vesical para proteínas de matriz extracelular(Figura 2)y se utilizó para informar la formulación de la mezcla de digestión. Dado que los colágenos son componentes clave de la pared de la vejiga11,12,primero buscamos determinar los colágenos más abundantes en la vejiga del ratón utilizando conjuntos de datos de perfilado de ARN generados por el proyecto Mouse ENCODE13. Nuestro análisis mostró que el colágeno 1A1, el colágeno 3A1, el colágeno 1A2 y el colágeno 6A1 son los tipos de colágeno más abundantes dentro de la vejiga del ratón (Figura 2A). También usamos el Tabula Muris (un compendio de datos de transcriptoma de una sola célula del ratón (Mus musculus))8 para determinar el nivel de expresión de ARNM de colágenos 1, 3, 6 e hialuronano. Los datos permiten una comparación directa y controlada de la expresión génica en los tipos celulares compartidos entre los tejidos. Este análisis reveló que la expresión de estos componentes de matriz extracelular es más frecuente en los tipos de células mesenquimales en lugar de urotelio (Figura 2B).
Efecto de la disociación sobre la viabilidad de las células aisladas de la vejiga El análisis de citometría de flujo demostró que la digestión enzimática utilizando los 4 protocolos diferentes produjo viabilidad del 83%, 86%, 93% o 90%, respectivamente. Por lo tanto, la sección 3 del protocolo se consideró más valiosa para la preservación de la viabilidad celular. También observamos que aproximadamente el 4% de las células eran necróticas (PI+/Annexin V-) (Figura 4A). Estas observaciones enfatizan la eficiencia del protocolo de digestión y el consiguiente beneficio en la viabilidad celular.
Efecto de la lesión de la médula espinal en diferentes poblaciones de células de la vejiga Observamos un aumento significativo en el número total de células en vejigas de ratones SCI en comparación con los controles. El patrón de las gráficas de puntos obtenidos de las vejigas SCI también fue ligeramente diferente consistente con la remodelación continua del órgano debido a una lesión de la médula espinal(Figura 4B: primera columna). En comparación con los controles, las vejigas de los animales SCI mostraron un aumento significativo en las células CD45 positivas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figura 1: Finalización representativa de perfusión con color aligerado del hígado. (A) Muestra el color del hígado al principio de la perfusión. (B) Muestra el color del hígado aligerado al final de la perfusión. El ratón en (A) tuvo transección de la médula espinal dos semanas antes de la perfusión, lo que resultó en hipertrofia vesical y su protuberancia fuera de la pelvis a diferencia del ratón en (B) que no tenía lesión de la médula espinal; en este caso la vejiga es pequeña y oculta en la pelvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figura 2: Expresión transcriptómica de componentes de matriz extracelular (ECM) en la vejiga del ratón. (A) Gráfico de barras de 43 tipos diferentes de colágeno. La expresión es indicada por Lecturas por kilobase de transcripción, por millón de lecturas mapeadas (RPKM) (los datos se recopilan de BioProject: PRJNA66167)14. (B) Tramas de violín de expresión génica en los tipos celulares obtenidos a partir de gotas microfluídicas basadas en 3'-end contando en un grupo de muestras de vejiga urinaria disociadas masculinas y femeninas (machos y hembras). Los recuentos se normalizaron de registro para cada celda utilizando el logaritmo natural de más de 1 cuenta por millón de ln(CPM+1)8. Se agregó un pseudoconteo de 1 CPM antes de tomar logaritmos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figura 3: Estrategia de Gating y controles FMO para determinar la propagación de la fluorescencia. (A) Selección de la población celular. (B) Estrategia de Gating para singletes. (C) Gating para células apoptóticas tempranas y tardías utilizando anticuerpo PI y Annexin V. (D\u2012F) Una gráfica esquemática de citometría de flujo multicolor (por ejemplo, anticuerpos conjugados con A, B, C, D fluorochromes + (Annexin V y PI). Esto muestra la fluorescencia extendida en el anticuerpo con el canal fluorocromo A mostrado por el control FMO en comparación con un control sin manchar. La línea punteada naranja representa el límite de gating FMO en comparación con el contorno sin manchar en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figura 4: Ciclometría de flujo de diferentes tipos celulares en la vejiga. (A) Anexo gráfico de flujo de tinción doble V/PI. Las diferentes combinaciones de enzimas y productos químicos utilizados para cada protocolo se representan frente a la parcela de viabilidad correspondiente. Estos datos demuestran que la mayor viabilidad se obtuvo con la sección 3 del protocolo. B) Histogramas representativos que ilustran la intensidad de Ly-6A/E (Sca-1) y CD326 (Ep-CAM) detectados en canales individuales. (C) Efecto de SCI en la población celular de la vejiga del ratón. El panel superior muestra los resultados de la tinción en tres vejigas disociadas obtenidas de ratones no quirúrgicos de control y el panel inferior muestra los resultados de la tinción en tres animales con SCI. La primera columna es la población celular total. La segunda columna muestra la selección de gating singlet. La tercera columna muestra la subpoblación de células vivas que son negativas para las células B, las células T y las células NK. La cuarta columna muestra la tinción de las células vivas positivas para CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Importe (por 500 mL)</td>
			<td>Molaridad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucosa</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Componentes para la preparación de la solución de Tyrode. Los componentes indicados son para la preparación de la solución de 500 mL Tyrode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td>Protocolo sección 1</td>
			<td>Protocolo sección 2</td>
			<td>Protocolo sección 3</td>
			<td>Protocolo sección 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno tipo I</td>
			<td>132.5 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno Tipo III</td>
			<td>96.4 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno Tipo VI</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adnsa</td>
			<td>10 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaína</td>
			<td>115 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Colágenonase</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidasa</td>
			<td>10.5 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Disipar II</td>
			<td>1.25 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de disociación celular</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima recombinante</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Componentes para la preparación del búfer de digestión. Los componentes indicados son para la preparación de una mezcla de digestión de 2,5 ml (1 U cataliza la hidrólisis de 1 μmol un sustrato por minuto a 37 °C. Consulte la hoja de datos del producto para la definición de unidad de cada enzima).

El objetivo de este protocolo es aplicar un protocolo de disociación de tejido optimizado a un modelo de ratón de lesión de la médula espinal y validar el enfoque para el análisis de células individuales por citometría de flujo.

Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Este protocolo es importante porque utiliza información biológica para facilitar la generación de una suspensión unicelular con una alta viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar suspensiones unicelulares que conservan una alta viabilidad celular y una representación adecuada de los tipos de células aisladas. Hussein Atta, un miembro de mi laboratorio, hará la demostración del procedimiento quirúrgico.La demostración del procedimiento de disociación tisular estará a cargo de Ali Hashemi, y el análisis FACS, Yaser Heshmati. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo pedal en un ratón adulto anestesiado, palpar la apófisis espinosa más prominente de la columna torácica. Se administran analgesia y antibióticos antes de la cirugía.Afeita un rectángulo longitudinal en la parte posterior del ratón desde la parte inferior del cuello hasta justo debajo de la apófisis espinosa más prominente y un centímetro a cada lado de la línea media. Desinfecte la piel expuesta tres veces con toallitas secuenciales de povidona yodada al 10 % y etanol al 70 % de forma circular, comenzando desde el sitio de la incisión y trabajando hacia afuera. Después de la última limpieza, cubra el ratón con un trozo estéril de esponja de gasa de cuatro por cuatro pulgadas con una ventana sobre el campo quirúrgico.Para inducir la lesión de la médula espinal, primero haga una incisión de 1,5 centímetros en el centro de la espalda y use una disección roma afilada para separar los músculos de las apófisis espinosas y las láminas de las vértebras T9, T10 y T11. Utilice unas tijeras finas para dividir bruscamente los ligamentos interespinosos entre T9 y T10 y T10 y T11 antes de realizar una laminectomía bilateral de la apófisis espinosa T10. Cuando las láminas se hayan extirpado por completo, use las tijeras para seccionar la médula espinal.Para cortar completamente las columnas laterales, barra delicadamente la punta de las tijeras finas por ambos lados. Use una aplicación de punta de algodón estéril para comprimir el sangrado. Después de lograr la homeostasis, cerrar la piel con suturas continuas 7-0 polyglactin910 y administrar subcutáneamente un mililitro de solución salina para prevenir la deshidratación postoperatoria, luego devolver al animal a una jaula fresca con monitoreo hasta la decúbito completo.Cada 12 horas, sujetando al animal con una mano y masajeando la parte inferior del abdomen con la otra, utilice el dedo índice y el pulgar para localizar y comprimir suavemente la vejiga urinaria distendida para estimular la expresión manual de la vejiga hasta que el animal sea capaz de orinar por sí mismo. Para el análisis posterior de los tipos de células vesicales de interés, en el momento experimental apropiado y una vez que el animal esté adecuadamente anestesiado, se realizará una laparotomía de línea media desde la pelvis hasta el diafragma y se cortará el diafragma de las costillas. Siguiendo el borde del cartílago óseo paralelo al esternón, abra el tórax a lo largo de las costillas a ambos lados del animal, comenzando en el diafragma y continuando hasta la primera costilla.Después de fijar la pared torácica anterior sobre la cabeza del animal, use unas tijeras finas para cortar el pericardio y conecte una aguja de calibre 23 al aparato de perfusión. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y avance lentamente la aguja hacia la aorta sin perforar el tejido. Cuando la aguja esté en su lugar, comience a infundir el tejido con PBS a un flujo de 15 mililitros por minuto y use las puntas de unas tijeras finas para hacer rápidamente un pequeño corte en la aurícula derecha.Cuando el drenaje esté claro y se pueda observar un color hepático aclarado, detenga la perfusión y libere la vejiga de los pedículos vasculares y la uretra, luego coloque la vejiga en un tubo de microcentrífuga que contiene una solución de Tyrode helada. Para preparar una suspensión de una sola célula, cuando se hayan recogido todas las vejigas, rasgue un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de solución de Tyrode. Después de pesar, pique las vejigas en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga 100 microlitros de solución de Tyrode y use una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir los fragmentos de tejido a 2,5 mililitros de tampón de digestión por vejiga.Incubar el tejido durante 40 minutos a 37 grados centígrados en una batidora Nutator y utilizar una pipeta de cinco mililitros para triturar la muestra durante un minuto antes de recoger las células y tejidos disociados por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de desprendimiento de células y coloque las células en el mezclador Nutator durante 10 minutos más. Al final de la incubación, recoja las células con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos.Después de un minuto, detenga la lisis con la adición de nueve mililitros de PBS y filtre las células a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros, luego centrifugue las células nuevamente y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de tinción complementado con bloque FC. Después de una incubación de 10 minutos en hielo, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de mezcla maestra de anticuerpos conjugados con fluoróforos durante 20 minutos en hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lavar las células con un mililitro de tampón de tinción celular y volver a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón de tinción de células frescas suplementado con cinco microlitros de anexina V de FITC y un microlitro de yoduro de propidio.Después de 15 minutos a temperatura ambiente, agregue 400 microlitros de tampón de unión de anexina a las celdas y mezcle por inversión. Para analizar las células mediante citometría de flujo, primero use una muestra de células sin teñir para establecer los parámetros de dispersión lateral y frontal de las células, luego mida la emisión de fluorescencia a 530 nanómetros y más de 575 nanómetros para excluir las células muertas. Utilice las cuadrículas de cada mancha de puntos para definir la población negativa en la primera desintegración y utilice los controles de fluorescencia menos uno para corregir la superposición espectral hasta que los medios de población negativos y positivos estén alineados.A continuación, mida 100.000 eventos de las células con los marcadores específicos de interés, creando puertas para las poblaciones de células de interés según sea necesario. Cuando se hayan ejecutado todas las muestras, analice los datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo adecuado. El colágeno 1A1, el colágeno 3A1, el colágeno 1A2 y el colágeno 6A1 son los tipos de colágeno más abundantes que se encuentran en la vejiga del ratón.El análisis para determinar los niveles de expresión de ARNm de los colágenos uno, tres, seis e hialurónico revela que la expresión de estos componentes de la matriz extracelular es más prevalente en las poblaciones de células mesenquimales que en el urotelio. El análisis de citometría de flujo indica que múltiples protocolos de digestión enzimática diferentes producen poblaciones celulares altamente viables, y se determinó que el tercer protocolo de digestión utilizado en este análisis es el más efectivo para la preservación celular. Con este método, se puede obtener un aumento significativo en el número total de células aisladas de las vejigas de ratones con lesión medular para compararlo con las vejigas de control.En comparación con los controles, las vejigas de los animales con lesiones de la médula espinal también muestran un aumento significativo de células CD45 positivas. El paso 7.1 es importante para la identificación en la población cardíaca. La estrategia de compuerta debe estar informada por las celdas de interés.Las vejigas de los animales con LME tienen una población celular distinta. Este protocolo se puede utilizar para la clasificación de células, el cultivo de células primarias, la secuenciación de células individuales y otros procedimientos posteriores de moléculas y células que requieren células individuales viables. Este protocolo proporciona una alta viabilidad y, por lo tanto, una baja pérdida de población celular, que es un punto clave para las técnicas de análisis de células individuales, como la secuenciación de ARN de células individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aislar las células madre adultas de músculo esquelético tejidos blandos sobre la base de la velocidad de la adhesión de las células para matraz.

Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

Siguiendo un procedimiento optimizado para purificar la cresta neural, derivados progenitores neuronales a partir de tejidos fetales de ratón se ha descrito. Este método aprovecha de expresión de alelos reportero fluorescentes para aislar poblaciones discretas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La técnica se puede aplicar para aislar las subpoblaciones neuronales en todo el desarrollo o de tejidos adultos.

Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

Fuente: Yang, E., et al. Aislamiento de comunidades bacterianas intracelulares individuales generadas a partir de un modelo murino de infección urinaria para análisis de células individuales posteriores. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el aislamiento manual de células epiteliales individuales que contienen comunidades bacterianas intracelulares de la vejiga de ratón infectada mediante micropipeteo oral, permitiendo el análisis posterior de poblaciones viables de E. coli asociadas al...

Aislamiento de células epiteliales de la vejiga del ratón que contienen comunidades bacterianas intracelulares

El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.

Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima

Este protocolo describe un método sencillo de aislar a las células epiteliales individuales, vejiga infectada de un modelo murino de infección del tracto urinario.

Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular

Este protocolo intenta establecer un protocolo repetible para las neuronas primarias y el aislamiento de glia de la vejiga de rata para experimentos celulares posteriores.

Aislamiento y cultura de las neuronas primarias y Glia de la vejiga urinaria de rata adulta

Este protocolo de disociación de células neuronales está destinado a muestras con una baja cantidad de material de partida y produce una suspensión unicelular altamente viable para el análisis posterior, con pasos opcionales de fijación y tinción.

Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Este estudio presenta dos técnicas experimentales cruciales: la construcción de un modelo de herida murina para evaluar el cierre de la herida y la preparación de suspensiones unicelulares de piel murina para preservar la viabilidad celular.

Modelos de heridas en ratones y preparación de suspensiones de células únicas

Aprende un protocolo optimizado de disociación tisular para análisis de células individuales en vejiga de ratón tras lesión medular. Este método genera suspensiones celulares con alta viabilidad para citometría de flujo.

Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal (Video) | JoVE Journal

Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

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