Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

Este protocolo es importante porque utiliza información biológica para facilitar la generación de una suspensión unicelular con una alta viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar suspensiones unicelulares que conservan una alta viabilidad celular y una representación adecuada de los tipos de células aisladas. Hussein Atta, un miembro de mi laboratorio, hará la demostración del procedimiento quirúrgico.

La demostración del procedimiento de disociación tisular estará a cargo de Ali Hashemi, y el análisis FACS, Yaser Heshmati. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo pedal en un ratón adulto anestesiado, palpar la apófisis espinosa más prominente de la columna torácica. Se administran analgesia y antibióticos antes de la cirugía.

Afeita un rectángulo longitudinal en la parte posterior del ratón desde la parte inferior del cuello hasta justo debajo de la apófisis espinosa más prominente y un centímetro a cada lado de la línea media. Desinfecte la piel expuesta tres veces con toallitas secuenciales de povidona yodada al 10 % y etanol al 70 % de forma circular, comenzando desde el sitio de la incisión y trabajando hacia afuera. Después de la última limpieza, cubra el ratón con un trozo estéril de esponja de gasa de cuatro por cuatro pulgadas con una ventana sobre el campo quirúrgico.

Para inducir la lesión de la médula espinal, primero haga una incisión de 1,5 centímetros en el centro de la espalda y use una disección roma afilada para separar los músculos de las apófisis espinosas y las láminas de las vértebras T9, T10 y T11. Utilice unas tijeras finas para dividir bruscamente los ligamentos interespinosos entre T9 y T10 y T10 y T11 antes de realizar una laminectomía bilateral de la apófisis espinosa T10. Cuando las láminas se hayan extirpado por completo, use las tijeras para seccionar la médula espinal.

Para cortar completamente las columnas laterales, barra delicadamente la punta de las tijeras finas por ambos lados. Use una aplicación de punta de algodón estéril para comprimir el sangrado. Después de lograr la homeostasis, cerrar la piel con suturas continuas 7-0 polyglactin910 y administrar subcutáneamente un mililitro de solución salina para prevenir la deshidratación postoperatoria, luego devolver al animal a una jaula fresca con monitoreo hasta la decúbito completo.

Cada 12 horas, sujetando al animal con una mano y masajeando la parte inferior del abdomen con la otra, utilice el dedo índice y el pulgar para localizar y comprimir suavemente la vejiga urinaria distendida para estimular la expresión manual de la vejiga hasta que el animal sea capaz de orinar por sí mismo. Para el análisis posterior de los tipos de células vesicales de interés, en el momento experimental apropiado y una vez que el animal esté adecuadamente anestesiado, se realizará una laparotomía de línea media desde la pelvis hasta el diafragma y se cortará el diafragma de las costillas. Siguiendo el borde del cartílago óseo paralelo al esternón, abra el tórax a lo largo de las costillas a ambos lados del animal, comenzando en el diafragma y continuando hasta la primera costilla.

Después de fijar la pared torácica anterior sobre la cabeza del animal, use unas tijeras finas para cortar el pericardio y conecte una aguja de calibre 23 al aparato de perfusión. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y avance lentamente la aguja hacia la aorta sin perforar el tejido. Cuando la aguja esté en su lugar, comience a infundir el tejido con PBS a un flujo de 15 mililitros por minuto y use las puntas de unas tijeras finas para hacer rápidamente un pequeño corte en la aurícula derecha.

Cuando el drenaje esté claro y se pueda observar un color hepático aclarado, detenga la perfusión y libere la vejiga de los pedículos vasculares y la uretra, luego coloque la vejiga en un tubo de microcentrífuga que contiene una solución de Tyrode helada. Para preparar una suspensión de una sola célula, cuando se hayan recogido todas las vejigas, rasgue un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de solución de Tyrode. Después de pesar, pique las vejigas en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga 100 microlitros de solución de Tyrode y use una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir los fragmentos de tejido a 2,5 mililitros de tampón de digestión por vejiga.

Incubar el tejido durante 40 minutos a 37 grados centígrados en una batidora Nutator y utilizar una pipeta de cinco mililitros para triturar la muestra durante un minuto antes de recoger las células y tejidos disociados por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de desprendimiento de células y coloque las células en el mezclador Nutator durante 10 minutos más. Al final de la incubación, recoja las células con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos.

Después de un minuto, detenga la lisis con la adición de nueve mililitros de PBS y filtre las células a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros, luego centrifugue las células nuevamente y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de tinción complementado con bloque FC. Después de una incubación de 10 minutos en hielo, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de mezcla maestra de anticuerpos conjugados con fluoróforos durante 20 minutos en hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lavar las células con un mililitro de tampón de tinción celular y volver a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón de tinción de células frescas suplementado con cinco microlitros de anexina V de FITC y un microlitro de yoduro de propidio.

Después de 15 minutos a temperatura ambiente, agregue 400 microlitros de tampón de unión de anexina a las celdas y mezcle por inversión. Para analizar las células mediante citometría de flujo, primero use una muestra de células sin teñir para establecer los parámetros de dispersión lateral y frontal de las células, luego mida la emisión de fluorescencia a 530 nanómetros y más de 575 nanómetros para excluir las células muertas. Utilice las cuadrículas de cada mancha de puntos para definir la población negativa en la primera desintegración y utilice los controles de fluorescencia menos uno para corregir la superposición espectral hasta que los medios de población negativos y positivos estén alineados.

A continuación, mida 100.000 eventos de las células con los marcadores específicos de interés, creando puertas para las poblaciones de células de interés según sea necesario. Cuando se hayan ejecutado todas las muestras, analice los datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo adecuado. El colágeno 1A1, el colágeno 3A1, el colágeno 1A2 y el colágeno 6A1 son los tipos de colágeno más abundantes que se encuentran en la vejiga del ratón.

El análisis para determinar los niveles de expresión de ARNm de los colágenos uno, tres, seis e hialurónico revela que la expresión de estos componentes de la matriz extracelular es más prevalente en las poblaciones de células mesenquimales que en el urotelio. El análisis de citometría de flujo indica que múltiples protocolos de digestión enzimática diferentes producen poblaciones celulares altamente viables, y se determinó que el tercer protocolo de digestión utilizado en este análisis es el más efectivo para la preservación celular. Con este método, se puede obtener un aumento significativo en el número total de células aisladas de las vejigas de ratones con lesión medular para compararlo con las vejigas de control.

En comparación con los controles, las vejigas de los animales con lesiones de la médula espinal también muestran un aumento significativo de células CD45 positivas. El paso 7.1 es importante para la identificación en la población cardíaca. La estrategia de compuerta debe estar informada por las celdas de interés.

Las vejigas de los animales con LME tienen una población celular distinta. Este protocolo se puede utilizar para la clasificación de células, el cultivo de células primarias, la secuenciación de células individuales y otros procedimientos posteriores de moléculas y células que requieren células individuales viables. Este protocolo proporciona una alta viabilidad y, por lo tanto, una baja pérdida de población celular, que es un punto clave para las técnicas de análisis de células individuales, como la secuenciación de ARN de células individuales.