Name: Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a utilizar carcasas de grafeno para microscopía electrónica de fase líquida en células de mamífero fijadas químicamente. Este método permite imaginar proteínas de membrana en su entorno nativo sin deshidratación.

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Agradecemos a D. B. Peckys por ayuda con el protocolo de cultivo celular, F. Weinberg por revisar el manuscrito, T. Trampert por ayuda con los experimentos y las figuras, S. Smolka para ayudar con las figuras, y E. Arzt por su apoyo a través de INM. Esta investigación está financiada por Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung.

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22The+Transmission+Electron+Microscope%22">The Transmission Electron Microscope</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones and Barlett Publishers. (1999).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+cells%3A+connecting+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694(2014).</li>
<li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li>
<li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li>
<li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+%28ASEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li>
<li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665(2018).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-Based+Fibers%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li>
<li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+on+gas+impermeability+of+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li>
<li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li>
<li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li>
<li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165(2015).</li>
<li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li>
<li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li>
<li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16(2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186(2015).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li>
<li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKohl%2C+H+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture%3A+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%3A+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+radiation+damage+in+the+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li>
<li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384(2015).</li>
<li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756(2018).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. (2014).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%2C+2+edn%22">Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn</a>. , Springer. (1995).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para comprender mejor la función proteica, es importante obtener información sobre las ubicaciones de proteínas en la membrana plasmática de las células intactas. Los métodos para obtener esta información incluyen la microscopía de fluorescencia de superconorción1,2. Aunque la microscopía de superresor resolución se ha desarrollado aún más en los últimos años, su resolución todavía está limitada a unos 20 nm para condiciones prácticas de experimentos celulares, mientras que las proteínas receptoras típicas tienen tamaños en el rango de 1-10 nm. La imagen de proteínas en un solo nivel de célula y molécula única con resolución suficiente para visualizar proteínas es posible con EM. Pero debido al corte, los métodos EM convencionales normalmente no dejan la célula intacta26,lo que conduce a la pérdida de información importante sobre el contexto y la distribución espacial de proteínas en la membrana plasmática. Métodos para células enteras con crio-TEM se han desarrollado6,es factible combinar el etiquetado de proteínas con crio-EM27,también crio-STEM se ha demostrado28. Sin embargo, los flujos de trabajo crio-EM están optimizados para estudiar la ultraestructura celular y la estructura de proteínas, y no tanto para analizar las distribuciones espaciales de proteínas de membrana. El secado de punto crítico es otro método de preparación de células enteras, pero las muestras se someten a varios pasos de secado, y la técnica consume mucho tiempo29. Las proteínas de membrana también se han examinado a través de la fractura por congelación7. En este método, las células se fijan, congelan y se fracturan. Las partes fracturadas se replican por capas de carbono y platino, y se elimina la muestra biológica. Las réplicas se pueden analizar con EM30. El análisis celular completo es imposible con la fracción de congelación porque se pierde información sobre la distribución de proteínas en la membrana dentro del contexto de toda la célula.
El método presentado aquí permite estudiar la membrana celular sin necesidad de cortar la muestra9,,31. Las células se mantienen intactas para que la localización de las proteínas de membrana sea visible a partir de las imágenes de fluorescencia, que están correlacionadas con las imágenes EM. El estudio de proteínas a nivel de célula única y molécula única dentro de células intactas en estado hidratado ha demostrado ser posible con una resolución de 2 nm utilizando STEM de proteínas etiquetadas con QD utilizando este método de grafeno9. Mantener las células en su estado nativo es crucial, ya que preserva la distribución espacial de las proteínas de membrana de tal manera que los análisis son posibles a nivel de célula única y molécula única, que es importante para entender las funciones proteicas, y el desarrollo de nuevos fármacos para los enfoques terapéuticos.
Otro aspecto crítico de la toma de imágenes de muestras biológicas con EM es el daño por radiación de las muestras causado por el haz de electrones. Las soluciones a menudo incluyen la reducción de la dosis de electrones tanto como sea posible o varios métodos de recubrimiento, tales como encapsular la muestra entre capas delgadas de carbono32. Nuestro método muestra que el recubrimiento de grafeno reduce los artefactos inducidos por el haz que emergen en la superficie de la célula para muestras no recubiertas. El examen de las muestras biológicas fijas químicamente y recubiertas de grafeno es posible bajo irradiación de haz de electrones a 200 keV de energía de haz hasta D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/a2 sin daños por radiación, como puntos brillantes, que aparecen en la muestra. En comparación con otros métodos EM que implican una preparación elaborada de la muestra, por ejemplo, tinción, incrustación, sección (crio-), fracturación, etc., el método descrito aquí consume menos tiempo. El etiquetado de las proteínas se realiza en pocas horas, y el recubrimiento de grafeno sólo requiere unos 15 minutos para investigadores capacitados. La preparación de la muestra es comparable con los procedimientos necesarios para la microscopía de fluorescencia.
El protocolo se puede modificar en algunos pasos. El grafeno en el microchip también se puede secar al aire para asegurarse de que el grafeno no se mueve cuando se borra con un papel de filtro. Si el grafeno está contaminado con sal, es posible dejarlo flotar en la superficie del agua durante aproximadamente una hora para disolver la sal y así minimizar la contaminación. La contaminación por cobre o PMMA en el grafeno se puede reducir extendiendo los pasos de grabado correspondientes en el protocolo. Se han descrito otros métodos de recubrimiento de grafeno en los que, por ejemplo, el grafeno-PMMA se depositó directamente en las células, y el PMMA se eliminó lavando en acetona despuésde 33. En nuestro método, PMMA fue removido antes del recubrimiento para evitar cualquier posible daño a las células causado por pasos adicionales de lavado de acetona. NaCl fue elegido como sustrato aquí porque es plano, por lo que no arruga el grafeno, y se disuelve en agua para liberar elgrafeno 9. Además, se puede cortar en el tamaño deseado y no quedan residuos de sustrato en el grafeno. Pero teniendo en cuenta esos criterios, otros sustratos como el cloruro de potasio posiblemente se pueden utilizar también.
Para reducir la posibilidad de un posible agrupamiento inducido por etiquetas, el paso de fijación de GA se puede implementar directamente después de la fijación de FA, después de lo cual todas las proteínas de membrana se inmovilizan. El primer paso de fijación con FA ya fija la estructura biológica, pero un nivel reducido de difusión de proteína de membrana todavía puede ocurrir34,lo que posiblemente conduce a la agrupación inducida por etiquetas debido a la presencia de múltiples Streptavidin por QD. La fijación con GA puede conducir a una señal de autofluorescencia durante LM, y por lo tanto, se realiza después de LM en el protocolo descrito, pero se puede reducir como se describe en otro lugar34. El tampón de cacodilato es bastante tóxico, y otros fijadores también se pueden utilizar, pero el cacodilato se utiliza aquí ya que es un tampón comúnmente utilizado para los protocolos EM, evita los precipitados, previene el crecimiento de bacterias y hongos, y es compatible con los iones de calcio que se necesitan para preservar la integridad ultraestructural de las membranas lipídicas35. Si es necesario, el tetróxido de osmio se puede utilizar como fijación adicional para estabilizar los lípidos. Esto ayudaría a mejorar el contraste de la estructura celular, pero también añadir otro metal al sistema y reducir el contraste obtenido en los QD.
El protocolo descrito aquí contiene muchos pasos que requieren una buena instrucción. Se requiere cierto entrenamiento antes de manipular microchips para evitar rayar la superficie del SiN de los microchips y para evitar roturas. Como se mencionó anteriormente, se recomienda preparar microchips en duplicados ya que la ventana siN puede romperse de vez en cuando. Obtener el número requerido de células en un microchip también requiere cierta experiencia. Recubrir las células con grafeno necesita un poco de entrenamiento, ya que puede ser difícil encontrar el ángulo de inclinación correcto para flotar el grafeno en el agua. Al capturar el grafeno del agua, también puede ser difícil ver el grafeno delgado. Tan pronto como el grafeno está en el microchip, el exceso de agua necesita ser borrado con un papel de filtro. Esto sólo debe hacerse con la punta de un papel de filtro para evitar la eliminación del grafeno del microchip.
El recubrimiento de grafeno impidió que aparecieran artefactos en la muestra. Pero para D < 4 x 102 e-/-2 tampoco surgieron artefactos para la muestra no recubierta, y los artefactos aparecieron solo para 2 muestras no recubiertas. Por lo tanto, los exámenes de células no recubiertas también parecen posibles, aunque sería mejor utilizar grafeno y evitar el riesgo de formación de artefactos. La composición de esos artefactos se puede analizar en el futuro para dar pistas sobre cómo prevenir su formación. En cuanto a la estabilidad estructural de las células sólo se observó una pequeña mejora del recubrimiento de grafeno. Las células fijas fueron aparentemente estabilizadas en las áreas delgadas examinadas, donde su estructura estaba cerca de la membrana SiN. Lo que no examinamos aquí, sin embargo, fueron artefactos de secado que se sabe que ocurren para muestras celulares cuando se exponen al vacío4. El secado de las células llevaría a la contracción de las células para que también las distancias QD cambiarían como consecuencia. Para la dosis de electrones utilizada aquí, la distancia de QD de muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas se mantuvo estable. Se necesitan más estudios para examinar el efecto del recubrimiento de grafeno en las células para EM.
Una limitación de este método es que la fijación química de las células es necesaria; por lo tanto, no se pueden realizar experimentos de células vivas. Pero en caso de que el etiquetado no sea necesario y se utilicen células con una mayor estabilidad estructural, por ejemplo bacterias, entonces las células no fijas se pueden encerrar en grafeno para EM36 aunque con una tolerancia de dosis de electrones diferente. Además, las proteínas no son detectables directamente, por lo que se necesitan QD para visualizar las proteínas. El método se beneficiaría de etiquetas más pequeñas. Un punto de discusión es si es bueno o malo que la ultraestructura no sea claramente visible. Nuestro método es similar al de la microscopía de fluorescencia donde sólo las proteínas seleccionadas son visibles37. Aumentar la visibilidad de la ultraestructura también añadiría mucha más información a la imagen, y luego en algún momento evitaría la detección de las posiciones de etiqueta individuales. Además, el método descrito aquí es para una especie de proteína, y se necesitan adiciones del protocolo para poder etiquetar múltiples proteínas. Por último, el método funciona cuando una pequeña molécula de unión de alta afinidad específicamente como anticuerpos miméticos21 o nanobody38 está disponible. Los anticuerpos de uso común son mucho más grandes y evitarían la detección del estado funcional de las subunidades de proteínas en oligómeros.
Nuestro método es útil para estudiar la función proteica en células enteras usando EM mientras mantiene las células en estado hidratado. Es fácilmente posible examinar series de células. También se pueden estudiar otros tipos de células y proteínas. Si no se necesita el etiquetado de proteínas, se puede utilizar un subconjunto del protocolo para el recubrimiento de grafeno de una amplia variedad de muestras biológicas. La capacidad de estudiar células enteras es relevante en la investigación celular para entender las correlaciones de la función de la proteína de membrana a nivel molecular.

El análisis de la función de la proteína de membrana es esencial para la investigación biológica celular y para el desarrollo de fármacos. Una clase de experimentos importantes implica el examen de las posiciones de las proteínas de membrana en las células. Esta información se puede utilizar para deducir conclusiones sobre el ensamblaje de proteínas en complejos proteicos y sus ubicaciones específicas en la membrana plasmática, que, a través del montaje dinámico y el desmontaje, impulsa una amplia variedad de funciones celulares. Entre otras técnicas, la microscopía de luz (LM) y la microscopía electrónica (EM) se utilizan para estudiar las funciones proteicas en las células. LM permite el análisis de células enteras en líquido; sin embargo, la resolución está restringida a 200-300 nm para convencional y hasta 20 nm para microscopía de fluorescencia de super resolución en condiciones prácticas1,,2. EM proporciona alrededor de 1 resoluciones3, pero la preparación convencional de muestras requiere deshidratación, tinción de metal para mejorar el contraste de la imagen, e incrustación en una sustancia de montaje, como resina, para la microscopía electrónica de transmisión (TEM)4. Para preservar las muestras biológicas en un entorno más nativo, se pueden utilizar técnicas crio-EM5,,6. Las muestras se congelan rápidamente en hielo amorfo y, si es necesario, se seccionan. Otra opción es la congelación EM7.
Las técnicas EM para el estudio de proteínas de membrana dentro de células intactas en su estado nativo, líquido han surgido en la última década8,9,10,11. Se logró una resolución espacial de 2 nm en proteínas de membrana etiquetadas por puntos cuánticos (QD) en células enteras cultivadas en una membrana SiN y encerradas por una capa degrafeno 9.
Aquí, se describen los detalles de un protocolo para el etiquetado de proteínas y el recubrimientode grafeno 9,12. El objetivo de este protocolo es analizar la distribución espacial de HER2 en la membrana de células enteras y fijas, preservando las células en estado hidratado. El recubrimiento con grafeno evita el secado de las células al vacío, y también reduce el daño por radiación13. Este método proporciona información sobre las proteínas de membrana etiquetadas dentro de la membrana plasmática intacta, pero el método no es útil para estudiar la ultraestructura celular como se hace generalmente con EM.
El grafeno es el nanomaterial más delgado conocido, y consiste en una sola lámina cristalina de espesor de átomo de carbono dispuesta en una celosía de panal14. Tiene propiedades únicas que incluyen alta flexibilidad y resistencia mecánica. Investigaciones recientes han demostrado que el grafeno libre de defectos es impermeable a los gases y líquidos, pero los defectos permiten la permeación del hidrógeno15. Esta fuga se puede reducir mediante el uso de grafeno multicapa como se utiliza aquí. El grafeno bicapa ha demostrado recientemente ser útil como soporte para muestras crio-EM, mejorando la homogeneidad de la capa de hielo delgada en comparación con el óxido de grafeno donde sólo se pueden formar capas no uniformes16. También se demostró que el grafeno reduce el daño del haz de muestras biológicas durante la microscopía electrónica de transmisión en fase líquida13,17. Como un experimento ejemplar, HER2 expresado en la línea de células de cáncer de mama de mamífero SKBR3 fue etiquetado con QDs18 y su distribución espacial registrada usando STEM. Las células se sembraron en un microchip Si con una membrana SiN transparente de electrones19. Los microchips fueron elegidos como soporte, ya que son robustos, compatibles con LM y EM, y todo el procedimiento de etiquetado se puede realizar directamente en el microchip19. Después de la fijación de celda, HER2 fue etiquetado con un protocolo de etiquetado de dos pasos20. En primer lugar, se adjuntó un compuesto mimético anti-HER2 anticuerpo biotinilado21 a HER2. Las células se fijaron químicamente para evitar la agrupación en clústeres de receptores inducidos por etiquetas, y para aumentar la estabilidad de la ultraestructura celular. Los QD recubiertos con Streptavidin se vincularon posteriormente al complejo mimético her2-anticuerpo. La señal de fluorescencia brillante y el núcleo densa de electrones de los QD permitieron la fluorescencia correlativa y la microscopía electrónica (CLEM)20. CLEM es especialmente útil porque las regiones celulares de interés para el análisis STEM se pueden seleccionar de las imágenes de microscopía de fluorescencia general que resaltan la localización de HER2 en las células. Las células fueron analizadas por microscopía de fluorescencia para identificar regiones celulares con altos niveles de HER2. A partir de entonces, una lámina de grafeno de 3-5 capas de espesor fue transferida a las celdas para el recubrimiento9,,22. Posteriormente, la muestra se montó en un soporte de muestra EM. Los datos STEM se adquirieron utilizando el detector de campo oscuro anular (ADF), proporcionando información sobre la distribución espacial de HER2 en la superficie celular en relación con la ubicación de la superficie celular, pero sin dar información sobre la ultraestructura de la célula. Para determinar la estabilidad de la muestra bajo la irradiación de haz de electrones, las muestras se examinaron a una dosis creciente (D) en una serie de imágenes. Se investigó la diferencia entre las muestras recubiertas de grafeno y las no recubiertas. Se evaluaron varios tipos de daño por radiación.
El protocolo descrito aquí utiliza la línea de células de cáncer de mama DE MAMÍFEROs SKBR3 como un sistema modelo para apuntar a HER223. El protocolo incluye la preparación de una muestra recubierta de grafeno, y una muestra similar, pero sin recubrimiento de grafeno para la comparación. El experimento se prepara por duplicado, ya que la ventana de SiN puede romperse una vez cada vez, y para obtener un duplicado experimental en la mayoría de los casos. El rendimiento general del método es alto, lo que significa que los microchips con células cubiertas de grafeno generalmente se obtienen con un error excepcional, aunque no toda la ventana de SiN puede estar cubierta con grafeno en todos los casos. Los duplicados no se describen en el protocolo.
El protocolo de etiquetado (pasos 1-5) es comparable al protocolo del etiquetado del receptor del factor de crecimiento epidérmico en las células de fibroblastos COS7 publicadas anteriormente24; detalles en ese papel se refieren a la manipulación de los microchips, y el uso de las placas de pozo. El siguiente protocolo está optimizado para etiquetar HER2, recubrimientode grafeno 9y examinar la tolerancia a la radiación de la muestra.

<table><tbody><tr><td>Acetona para HPLC (mín. 99,8 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica AL54</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Alemania</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Fracción V de albúmina, sin biotina, &ge; 98 %, para biología molecular</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de afinidad anti-HER2, biotina conjugada 20 y micro; M</td><td>Affibody, Solna, Suecia</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr><tr><td>microscopio analítico de resolución atómica JEM-ARM200F</td><td>JEOL (Alemania) GmbH, Freising, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cacodílico sal sódica trihidrato &GE; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular, PS, tratados, estériles, Tapón de rosca de filtro 50ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular, PS, tratados, estériles, Tapón de rosca de filtro 250ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular multipocillo, tratadas, 24 pocillos</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipocillo para cultivo celular, tratadas, 96 pocillos</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular CELLSTAR tratados con TC, 250 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Placas multipocillos para cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga CELLSTAR 15 ml estériles</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular CELLview, PS, 35/10 mm, fondo de vidrio, 1 compartimento</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 ml estériles</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper solución de disociación celular no enzimática</td><td>Corning, NY, EE. UU</td><td>. 25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Sacarosa mín. 99,7 %, en polvo</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro desechable C-Chip Neubauer mejorado</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td></td><td></td>4430000018</tr><tr><td>pipetas Eppendorf Research plus variable, 0,1 - 2,5 y micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipeta variable, 2 -20 &micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipeta variable, 10 - 100 &micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipeta variable, 100 - 1000 &micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol para HPLC (mín. 99,9 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de ingeniería similar a la fibronectina*poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, EE. UU</td><td>. 31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, EE. UU</td><td>. 10099141</td><td>número de lote: 1751893</td></tr><tr><td>Gibco Goat Serum, origen neozelandés</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, EE. UU</td><td>. 16210064</td><td>número de lote: 1788320</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Gibco, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Galaxy 48R CO2</td><td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan Modelo 950 Solarus&mdash; Limpiador de plasma</td><td>Gatan GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído de grado I, 25% en H2O, especialmente purificada para su uso como fijador de microscopía electrónica</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine &ge; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de laboratorio invertido Leica DM IL LED</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Alemania</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales (NEAAs) 100x sin L-Glutamina</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Francia</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio 76 mm x 26 mm</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Tubos principales</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1,5 ml, 2 ml) no estériles</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>1,5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td><td></td></tr><tr><td>MSc-Advantage&mdash; Cabina de seguridad biológica de clase II</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Ocean Microchips SiN ventana 400x150 &micro; m, espaciador de 200 nm</td><td>DENSsolutions, Delft, Países Bajos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Jeringa de un solo uso Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td><td>comprado a través de Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Alemania</td><td>VO 200</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>#291-0057</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16 %, grado EM</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica, Hatfield, PA, EE. UU</td><td>. 15710</td><td></td></tr><tr><td>Perfekt-Kescher con mango</td><td>Plano GmbH, Wetzlar, Alemania</td><td>T5112</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles en gradillas, no estériles</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>2-200&micro; l: 7695892</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles en gradillas, estériles</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>0.1-10 &micro; l: 7695880 2-100 y micro; l: 7695883 100-1000 y micro; l: 7695886 1250 y micro; l XL: 7695887</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina 0,01 % solución mol. WT.70.000 - 150.000</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Estreptavidina conjugada 1 &micro; M</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar, Gem Uncoated 3 facetas, Steel Back, Desengrasado</td><td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td><td>94-0451</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro redondo, sin cenizas, Grado 589/3 cinta azul, diámetro 150mm</td><td>Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania</td><td>300212</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de rutina Leica M60</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas ROTILABO, estériles (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas, estériles, (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>1 ml: 7695550 2 ml: 7695551 10 ml: 7695553</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas, estériles, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Alemania</td><td>5 mL: 7695552 25 ml: 7695554 50 ml: 7695555</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitable SW22</td><td>Julabo GmbH, Seelbach, Alemania</td><td>9550322</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>HN00.1</td><td></td></tr><tr><td>Cristales de cloruro de sodio, hendidos 12 mm x 12 mm x 0,5-1 mm</td><td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td><td>9750</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio decahidratado, reactivo ACS, &ge; 99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de sodio</td><td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>4365.2</td><td></td></tr><tr><td>filtros de jeringa ROTILABO PES, estériles 0,22 y micro; m</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Grafeno de transferencia trivial de 3-5 capas, 1 cm x 1 cm</td><td>Material ACS, Pasadena, CA, EE. UU</td>. <td>Pinzas TTG30011</td><td></td></tr><tr><td>Dumoxel 03</td><td>Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Suiza</td><td>0103-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Inox 02</td><td>Fabrica D' Outils Dumont SA, Montignez, Suiza</td><td>0102-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, punta reemplazable</td><td>de plástico Ideal-tek SA, Balerna, Suiza</td><td>5SVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>Agua ROTISOLV HPLC grado gradiente</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>A511.2</td><td></td></tr></tbody></table>

carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Se describe un protocolo para investigar el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) en la membrana plasmática intacta de las células de cáncer de mama mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM). Las células de la línea celular de cáncer de mama de mamífero SKBR3 se cultivaron en microchips de silicio con ventanas de nitruro de silicio (SiN). Las células se fijaron químicamente, y las proteínas HER2 fueron etiquetadas con nanopartículas de puntos cuánticos (QD), utilizando un protocolo de unión de biotina-estreptavidina de dos pasos. Las células fueron recubiertas con grafeno multicapa para mantener un estado hidratado, y para protegerlas del daño del haz de electrones durante STEM. Para examinar la estabilidad de las muestras bajo la irradiación de haz de electrones, se realizó un experimento de serie de dosis. Se compararon muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas. El daño inducido por el haz, en forma de artefactos brillantes, apareció para algunas muestras no recubiertas a la dosis de electrones Daumentada, mientras que no aparecieron artefactos en las muestras recubiertas.

La Figura 1A muestra las celdas sembradas de tal manera que la ventana está cubierta pero con espacio suficiente para permitirles aplanarse y adherirse, lo que lleva a una confluencia de aproximadamente 2/3rd (Figura 1B). En caso de que se se se seban demasiadas células en un microchip (Figura 1C), no hay suficiente espacio para que todas las células se adhieran al microchip. La Figura 1D muestra el mismo microchip después de 24 h. Más de la mitad de las células no se aplanó. Por otro lado, si se siembran muy pocas celdas(Figura 1E),la ventana SiN terminará con un gran espacio vacío después de 24 h como se ve en la Figura 1F. El cuadro 1G muestra la imagen DIC de las células en el cuadro 1A y el cuadro 1B. La Figura 1H muestra la imagen de fluorescencia correspondiente de color falso en amarillo que indica el etiquetado correcto de HER2.
Los datos REPRESENTATIVOs STEM se muestran en la Figura 4. Se investigaron las celdas SKBR3 recubiertas de grafeno (columna izquierda) y no recubiertas (columna derecha). Figura 4A,B muestra las imágenes de visión general de M a 800x de las celdas en la ventana. Las áreas mostradas como insertos se visualizaron en M a 80.000x durante la serie de dosis, véase la Figura 4C,D. Los QD son visibles como puntos brillantes aquí. La Figura 4E y la Figura 4F muestran M a 50.000 imágenes magnificadas adquiridas en las ubicaciones de los rectángulos de la Figura 4C,D. Ambas imágenes se registraron después de la adquisición de una serie de dosis con D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/-2. La serie de dosis se registró en M a 80.000x. Las áreas expuestas se pueden reconocer como rectángulos, por lo que el rectángulo era claramente visible para la muestra no recubierta (Figura 4F).
Para verificar la presencia de grafeno, se adquirieron patrones de difracción de áreas sin células, pero con o sin grafeno en la ventana de SiN. La estructura hexagonal del grafeno se observó en el patrón de difracción de la muestra recubierta de grafeno (Figura 4G), mientras que estaba ausente para la muestra no recubierta (Figura 4H). El patrón de difracción del grafeno de cristal único tendrá seis veces la simetría debido a la estructura hexagonal altamente ordenada del grafeno. Por lo tanto, la estructura hexagonal indica la presencia de grafeno en las muestras.
Para investigar el efecto de la iluminación de haz de electrones en la muestra, se adquirieron imágenes STEM en una serie de imágenes con una dosis de electrones acumulada. Los resultados representativos de las muestras no recubiertas y recubiertas de grafeno se muestran en la Figura 5A-D y en la Figura 5E-G,respectivamente. Todos los datos fueron adquiridos en el borde de la célula, donde la célula es la más plana, y la estructura observada es por lo tanto la más cercana a la membrana SiN. La exposición de una muestra no recubierta dio lugar a estructuras brillantes que aparecen en las superficies celulares en D á (1,9 x 0,1) x 103 e-/a2 (Figura 5B). Estas estructuras se hicieron más grandes con dosis más altas, por lo que fueron claramente visibles en la última imagen de la serie en D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/-2 (Figura 5C,D). Estas manchas no aparecieron en ninguna de las muestras recubiertas de grafeno(Figura 5E-G).
Se prepararon y examinaron microchips adicionales utilizando el protocolo descrito en lo anterior. Se investigaron en total seis muestras recubiertas y siete no recubiertas. Dos de cada siete muestras no recubiertas mostraron estos artefactos. Ninguna de las muestras recubiertas mostró puntos brillantes adicionales.
Como otra medida del daño por radiación, se examinó la distancia entre los QD. Si se produjeran daños estructurales, se esperaría que las distancias entre los QD cambiaran. Los cambios en las distancias se midieron para diferentes pares de QD con la acumulación de D para un rango de distancias de par. La Figura 5H muestra que el cambio relativo de las partículas para las muestras no recubiertas se mantuvo por debajo del 1,3% en promedio, mientras que la distancia relativa media se mantuvo por debajo del 0,8% para las muestras recubiertas. Por lo tanto, se puede concluir que el recubrimiento de grafeno estabilizó la muestra, pero las muestras secas sin recubrimiento de grafeno también eran notablemente estables.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Figura 1: Siembra celular en una ventana SiN de un microchip de silicio y HER2 etiquetado. (A) Imagen ejemplar de una región de ventana SiN con celdas SKBR3 5 minutos después de la siembra en el microchip. (B) Las mismas celdas se extienden en la misma ventana de SiN después de 24 h. (C) SKBR3 células en un Microchip Si 5 min después de la siembra. (D) Las mismas células que en (C) después de 24 h. Las células no se aplanaron correctamente, ya que había demasiadas células en las virutas al sembrar. (E) Cells en un microchip 5 min después de la siembra. (F) Sólo unas pocas celdas eran visibles en la ventana porque muy pocas células se sembraron en el microchip. (G) Imagen DIC de las mismas celdas SKBR3 después del etiquetado QD de HER2. (H) Superponga la imagen de DIC y la imagen de fluorescencia correspondiente de las celdas SKBR3 etiquetadas con HER2-QD655 (color falso en amarillo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Figura 2: Limpieza y transferencia de grafeno a cristales NaCl. (A) PMMA-grafeno-sobre-polímero se sumerge en agua pura para liberar grafeno PMMA. El PMMA-grafeno se puede atrapar con un portaobjetos de vidrio. (B) Las contaminaciones a base de cobre se grabaron utilizando solución de persulfato sódico. Para limpiar el grafeno, se transfirió a un vaso de precipitados que contenía agua desionizada. Estos pasos se repitieron 3 veces. El PMMA-grafeno se transfirió entonces a la solución saturada de NaCl en agua pura. Se utilizó un cristal NaCl para recoger el grafeno de la solución salina. (C) El PMMA-grafeno en cristal NaCl se secó durante 30 minutos a temperatura ambiente. PMMA se eliminó incubando el bloque en acetona durante 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Figura 3: Recubrimiento de grafeno de las células sembradas en un microchip Si. (A) Procedimiento de recubrimiento de grafeno. El grafeno en el cristal naCl se libera sobre la superficie del agua. La pieza de grafeno es capturada con un lazo metálico y transferida al microchip Si. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) con una ventana SiN de dimensiones 400 x 160 m sin grafeno. Las células SKBR3 eran visibles como manchas oscuras. (C) Grafeno (círculo rojo) flotando en la superficie de un vaso de precipitados lleno de agua. (D) Grafeno atrapado con un lazo metálico. (E) El microchip unido a la gota de agua de modo que el grafeno estaba en la parte superior de la ventana del SiN. (F) Microchip después del recubrimiento de grafeno. El grafeno era visible como un brillo púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Figura 4: STEM de celdas SKBR3 recubiertas y no recubiertas de grafeno en la ventana de SiN. (A) Imagen STEM de una muestra recubierta de grafeno adquirida en una imagen STEM M a 800x. (B) de una muestra no recubierta adquirida en M a 800x. (C) M a 80.000x imagen grabada en la posición del rectángulo azul en A. Las líneas amarillas representan ejemplos de distancias medidas dentro de la partícula. (D) M a 80.000x imagen grabada en la posición del rectángulo azul en B. La línea amarilla representa ejemplos de distancias medidas dentro de partículas. (E) M a 50.000x imagen de la misma región que C expuesta a D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. (F) M a 50.000x imagen de la misma región que D y expuesta a D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. El área expuesta fue claramente vista. (G) Patrón de difracción de una muestra recubierta de grafeno de un área sin células. La simetría de seis veces del grafeno es visible como puntos brillantes. (H) Patrón de difracción de una muestra sin grafeno que no muestra 6 puntos brillantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Figura 5: Artefactos que surgen en muestras sin recubrimiento de grafeno. (A) Primeras imágenes de regiones en muestras sin recubrimiento de grafeno adquiridas a 80.000x, y expuestas a D á (0,39 a 0,02) x 102 e-/o2. M (B) Imágenes con los primeros artefactos que surjan en D á (1,94 x 0,1) x 103 e-/o2 (flechas amarillas). (C, D) La última imagen de la serie adquirida con D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. Los artefactos eran visibles como puntos brillantes. (E-G) Muestras recubiertas de grafeno sin artefactos. (E) D á (0,39 a 0,02) x 102 e-/a2 (F) D á (1,94 a 0,1) x 103 e-/o2 (G) D á (7,8 a 0,4) x 103 e-/o2. (H) Cambio relativo en las distancias de partículas para muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas. Se analizaron dos de las muestras no recubiertas que muestran artefactos, una de las cuales se muestra en (A-C), y la última imagen de la segunda muestra en D, así como tres muestras recubiertas (una se muestra en E-G). En total, se examinaron diez pares de QD por muestra con distancias que oscilaban entre 250 nm y 3 m. El cambio relativo refleja el promedio de todas las mediciones en un grupo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Recetas para soluciones y buffers. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí se presenta un protocolo para etiquetar proteínas de membrana en células de mamíferos y recubrir la muestra con grafeno para microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida. La estabilidad de las muestras contra el daño causado por la radiación también se puede estudiar con este protocolo.

Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Este método mantiene muestras biológicas en un entorno nativo y reduce el artefacto inducido por haz de electrones. La principal ventaja es que esta técnica es aplicable a células enteras. Por lo tanto, las células no necesitan deshidratarse, mancharse o seccionarse antes de la microscopía electrónica.La capacidad de imaginar receptores en las células cancerosas en el contexto de toda la membrana plasmática intacta es un aspecto importante que puede conducir a nuevos enfoques terapéuticos y el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer. Demostraré el trabajo con células, revestimiento de grafeno y microscopía, y Sercan Keskin mostrará cómo preparar el grafeno. Para empezar, añada 100 microlitros de suspensión celular a dos pocillos de una placa de 96 pozos que contenga microchips recubiertos de PLL y FLP con la membrana de nitruro de silicio hacia arriba y 50 microlitros de medio libre de suero.Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos para permitir que las células se adhieran al microchip. Compruebe la densidad de las células del microchip con un microscopio invertido y asegúrese de que las células cubran la ventana con suficiente espacio para aplanarse y adherirse. Para etiquetar HER2 en las células, coloque los microchips en los pocillos de la primera fila de la placa de etiquetado.Luego, lave los microchips con PBS BSA. Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo mimético, incubar los microchips con PBS BSA GS durante cinco minutos. Luego con 200 anticuerpos nanomolares miméticos durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono.Para eliminar el grafeno PMMA del polímero, pipetee unas gotas de agua en el polímero alrededor del grafeno PMMA. Luego, sumérgelo en agua con un ángulo de 30 a 45 grados para liberar el grafeno PMMA. Para grabar contaminantes a base de cobre, anteponga una solución de 50 mililitros de persulfato sódico molar de 0,42 molares en agua.Utilice una corredera de vidrio estándar para transferir el grafeno PMMA a la solución de persulfato de sodio con el lado del grafeno hacia abajo. El grafeno PMMA flotará hasta la parte superior de la solución. Déjalo ahí toda la noche.Al día siguiente, transfiera el grafeno PMMA de la solución de persulfato sódico a agua limpia. Déjalo flotar en el agua durante media hora. Repita el lavado un total de tres veces para eliminar todos los residuos de persulfato de sodio del grafeno PMMA.A continuación, transfiera el grafeno PMMA a un cristal de cloruro de sodio. Preparar una solución saturada de cloruro de sodio en agua en una placa Petri y transferir el grafeno PMMA en la parte superior de la solución con el lado del grafeno hacia abajo. Sostenga el cristal de cloruro de sodio con pinzas y recoja el grafeno PMMA flotante.Luego, sostén lo sostenga verticalmente durante dos minutos para dejar que el exceso de agua fluya. Dejar secar a temperatura ambiente durante 30 minutos y hornearlo en un horno a 100 grados Celsius durante 20 minutos. Retire completamente el agua.Precaliente la acetona en un plato de Petri de vidrio a aproximadamente 50 grados Celsius en una placa caliente en la campana de humo. Observe la temperatura cuidadosamente para evitar el fuego. Sumerja el grafeno PMMA sobre sal en el plato de Petri lleno de acetona y déjelo disolver el PMMA durante 30 minutos.Deje que el grafeno en sal se seque a fondo antes de usarlo para la preparación de la muestra. Lave un microchip preparado y etiquetado en agua pura para eliminar los residuos de sal del tampón y colóquelo en el papel de filtro. Las células deben ser visibles como manchas oscuras.Utilice una cuchilla de afeitar para cortar el grafeno multicapa en el cristal de cloruro de sodio en una pieza que se ajuste a la ventana de nitruro de silicio de un microchip. Retire el grafeno del cristal de cloruro de sodio sumergiéndolo en un vaso de agua, inclinando el cristal en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie. Atrapa el grafeno con un lazo metálico de la superficie del agua, luego toca la superficie superior del microchip con la superficie del lazo inferior, haciendo que el microchip se pegue al lazo metálico.El grafeno se puede ver en la parte superior del microchip. Bajo un estereomicroscopio, utilice papel de filtro para eliminar el agua restante del microchip de modo que el grafeno cubra todas las celdas de la ventana de nitruro de silicio. Coloque el microchip sobre un papel de filtro con pinzas.El grafeno es visible como un brillo púrpura en el microchip. Transfiera el microchip del papel a un compartimento De Petri. Pipetear una gota de agua en uno de los compartimentos libres y cerrar la tapa para proporcionar una atmósfera saturada de agua.A continuación, selle el plato del compartimiento con película de parafina y guárdelo en la nevera a cuatro grados centígrados. Ajuste el STEM a 200 kilovoltas de energía utilizando una muestra de alineación para un tamaño de sonda de al menos 0,2 nanómetros ajustando las lentes del condensador. Establezca una corriente de sonda de 180 Picoampere y un semiángulo de convergencia de haz de 13,2 milradios insertando una abertura.Ajuste el rango de semiángulo de apertura del detector ADF STEM en 68 a 280 milándirios ajustando la configuración de la lente del proyector. A continuación, establezca el tamaño de la imagen STEM en 2048 por 2048 píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles en seis microsegundos. Cargue el microchip con células recubiertas de grafeno en un soporte de muestra estándar para tem de tal manera que las células estén mirando hacia arriba y cargue el soporte en el microscopio electrónico.Adquiera una imagen general con un aumento de 800 X. A continuación, identifique una región de interés e imagen de las nanopartículas de puntos cuánticos a 80.000 X con un tamaño de píxel de 1,3 nanómetros. Las células de semillas óptimas se muestran aquí.La ventana está cubierta, pero hay suficiente espacio para permitirles aplanarse y adherirse. Cuando se sembraron demasiadas células en un microchip, no había suficiente espacio para que todas las células se adhieran. Después de 24 horas, más de la mitad de las células no se aplanó.Si se siembran muy pocas celdas, la ventana de nitruro de silicio terminará con un gran espacio vacío después de 24 horas. Las imágenes DIC y fluorescencia de las células de semilla óptima se muestran aquí, lo que demuestra el etiquetado exitoso de HER2. STEM se realizó en células SKBR3 recubiertas de grafeno y no recubiertas.Los recuadros de las imágenes de aumento de 800 X se imáron a 80.000 X.Las nanopartículas de puntos cuánticos son visibles como puntos brillantes con un aumento de 50.000 X. Para investigar el efecto de la iluminación de haz de electrones en la muestra, se adquirieron imágenes STEM en una serie de imágenes con una dosis de electrones acumulada. Aquí se muestran resultados representativos de muestras no recubiertas y recubiertas de grafeno.La exposición de muestras no recubiertas dio lugar a estructuras brillantes que aparecieron en las superficies celulares, lo que no se produjo con ninguna de las muestras recubiertas de grafeno. El cambio de distancia relativa promedio de los pares de partículas se mantuvo por debajo del 1,3% para las muestras no recubiertas y por debajo del 0,8% para las muestras recubiertas. Después de este procedimiento, se pueden obtener diferentes tipos de proteínas de membrana en células enteras utilizando otros métodos de microscopía.Esta técnica permite la imagen de proteínas en la membrana plasmática intacta para obtener más información sobre la organización de la membrana plasmática y la interacción entre proteínas.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

El líquido de la célula la microscopia electrónica puede utilizarse para observar dinámicas de nanocristales en un medio líquido con una mayor resolución espacial de otras técnicas de microscopía electrónica del líquido celular. Grabado premade nanocristales y siguiendo su forma utilizando grafeno líquido celular microscopia electrónica de transmisión puede dar importante información mecanicista sobre transformaciones de nanopartículas.

Usando el líquido celular microscopia electrónica de transmisión para estudiar in Situ el aguafuerte de Nanocrystal

Se presenta un protocolo para la preparación de células líquidas de micropozo compatibles con grafeno para microscopía electrónica in situ de nanocristales de oro de la solución precursora HAuCl4. Además, se presenta una rutina de análisis para cuantificar la dinámica observada de grabado y crecimiento.

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Aquí, describimos un protocolo para aplicar una sola monocapa de grafeno a rejillas de microscopía electrónica y cómo prepararlas para su uso en la determinación de la estructura crioEM.

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La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Un método de observación de moléculas individuales de ADN en células vivas se describe. La técnica se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia represor lac a sitios de unión ingeniería genética en el ADN de interés. Este método puede ser adaptado para seguir muchos ADNs recombinantes en células vivas en el tiempo.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Los niveles alterados de hemo intracelular se asocian con enfermedades comunes como el cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad de medir los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método rápido y sensible para medir y comparar los niveles de síntesis de hemo en diferentes células.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Obtener imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta calidad es un desafío, especialmente en el caso de las células vegetales, que tienen abundantes vacuolas grandes llenas de agua y espacios aireados. La congelación a alta presión en tándem y la sustitución rápida por congelación reducen en gran medida el tiempo de preparación de las muestras de plantas para TEM, al tiempo que producen muestras con una excelente conservación ultraestructural.

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

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Aprende a utilizar carcasas de grafeno para microscopía electrónica de fase líquida en células de mamífero fijadas químicamente. Este método permite imaginar proteínas de membrana en su entorno nativo sin deshidratación.

Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

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