Name: Análisis del metabolismo celular natural humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a medir el metabolismo de células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular automatizado. Este protocolo permite evaluar glucólisis y respiración mitocondrial en tiempo real con alta capacidad de procesamiento.

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Los autores agradecen al Dr. Michael N. Sack (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre) el apoyo y la discusión. Este estudio fue apoyado por los Programas de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Instituto Nacional del Corazón, pulmón y sangre. JT cuenta con el apoyo del programa Ramón y Cajal (beca RYC2018-026050-I) de MICINN (España).

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<li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

En este artículo, hemos establecido un protocolo para aislar y cultivar eficientemente células NK humanas primarias y viables a partir de sangre periférica. También hemos optimizado las condiciones para la medición de la actividad metabólica de estas células NK evaluadas por la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular mediante el uso de un analizador de flujo extracelular. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular es rápido, requiere un pequeño número ...

Las células de Natural Killer (NK) son linfocitos innatos que median las respuestas antitumorales y antivirales. Las células NK comprenden entre el 5 y el 15% de todos los linfocitos en la sangre periférica humana, y también se pueden encontrar en el bazo, el hígado, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Las células NK no expresan receptores clonotípicos polimórficos, como los receptores de células T (TCR) o los receptores de células B (BCR). Por el contrario, la activación de sus funciones citolíticas se debe a la realización de receptores que reconocen ligandos invariables en la superficie de una célula diana1,2.
Células NK humanas en reposo aisladas de la sangre periférica pueden sobrevivir durante varios días en medio de cultivo complementado con suero humano. La activación de las células NK por citoquinas como IL-15 o IL-2 impulsa las células a la proliferación y a un aumento de su capacidad de matar, entre otros efectos3,,4,,5. Varios estudios han demostrado una correlación directa entre la activación de la célula NK y los cambios en su actividad metabólica6. Estos cambios metabólicos están destinados a satisfacer los requisitos particulares de las células en términos de energía y biosíntesis.
Las células y organismos aeróbicos obtienen energía a través de una serie de reacciones químicas que implican el catabolismo y la oxidación de carbohidratos, grasas y proteínas. A través de una combinación de glucólisis, el ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, las células eucariotas satisfacen la mayoría de su demanda de ATP y obtienen los intermedios necesarios como bloques de construcción para macromoléculas esenciales para el crecimiento celular y la proliferación. El proceso de glucólisis (Figura 1A) comienza con la entrada de glucosa en la célula. En el citosol, la glucosa se fosforila y se transforma en piruvato (con una producción neta de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa), que se puede reducir a lactato o transportarse en las mitocondrias para transformarse en acetil-coa y entrar en el ciclo TCA. El ciclo TCA continúa en bicicleta alimentado con más moléculas de acetil-CoA y produce CO2 (que eventualmente se difunderá fuera de la célula y, al reaccionar con H2O en el medio, generará ácido carbónico que conducirá a la acidificación del medio) y NADH, la molécula encargada de donar electrones a la cadena de transporte de electrones (ETC). Los electrones viajan a través de diferentes complejos proteicos y finalmente son aceptados por el oxígeno. Estos complejos (I, III y IV) también bombean H+ desde la matriz mitocondrial en el espacio intermembrano. Como consecuencia del gradiente electroquímico generado, el H + entraráde nuevo en la matriz a través del complejo V (ATP-sintasa), invirtiendo la energía potencial acumulada en la generación de ATP.
Tanto la glucólisis como la respiración mitocondrial se pueden bloquear en diferentes puntos mediante el uso de inhibidores. El conocimiento y uso de estos inhibidores fue la base para el desarrollo del ensayo de flujo extracelular. Mediante la medición de dos parámetros simples en tiempo real como el pH y el oxígeno, el analizador de flujo extracelular infiere la tasa de glucólisis y respiración mitocondrial en una placa de 96 pozos. La prueba de esfuerzo de glucólisis se realiza en un medio basal sin glucosa (Figura 1B)7. Las primeras mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) son indicativas de acidificación independiente de la glucólisis. Se conoce como acidificación no glucolítica y se correlaciona con elCO2 producido por el TCA que, como se explicó anteriormente, se combina con H2O en el medio para generar H+ (ECAR ligado a TCA). La primera inyección es glucosa para inducir la utilización de glucosa y aumentar la glucólisis. La segunda inyección combina tanto la rotenona, un inhibidor del Complejo I, y la antimicina A, un inhibidor del Complejo III juntos, para bloquear el ETC. Las células responden a esta disminución dramática en la producción de ATP mitocondrial mediante la activación de la glucólisis para mantener los niveles celulares de ATP, y esto representa la cantidad de glucólisis que no es utilizada por la célula en el estado basal, pero podría ser potencialmente reclutada en respuesta a aumentos en la demanda de ATP (glicólisis). La tercera inyección es la glucosa análoga 2-Deoxyglucosa (DG), que compite con la glucosa como sustrato de la enzima hexoquinasa. El producto de esta fosforilación, 2-desoxiglucosa-6-fosfato no se puede transformar en piruvato, y por lo tanto se bloquea la glucólisis, lo que reduce el ECAR al mínimo. El ECAR medido en este punto incluye otras fuentes de acidificación extracelular que no se atribuyen a la glucólisis o actividad respiratoria, así como cualquier glucólisis residual no inhibida completamente por 2-DG (post 2-DG-acidificación).
La prueba de esfuerzo mitocondrial se realiza en un medio con glucosa (Figura 1C)8. Las primeras mediciones de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) corresponden a la línea base de la respiración mitocondrial (respiración basal). La primera inyección es la oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través de la ATP sintasa (complejo V), bloqueando la síntesis de ATP y por lo tanto hiperpolarizar rápidamente la membrana mitocondrial, que evita el bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y conduce a una disminución en el OCR. La comparación entre la respiración de línea de base y el valor dado por la adición de oligomicina representa la respiración vinculada a ATP. La tasa restante de consumo de oxígeno que no tiene en cuenta la oligomicina se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de la bicapía lipídica o proteínas en la membrana mitocondrial interna, como el translocase nucleótido de adenina9. La segunda inyección es el desacoplador 2,4-dinitrofenol (DNP), un ionóforo que induce una entrada masiva de H+ en la matriz mitocondrial, que conduce a la despolarización de la membrana mitocondrial y la interrupción de la síntesis de ATP mitocondrial. Las células responden a la disipación de la fuerza de protones-motivo aumentando la tasa de transporte de electrones y el consumo de oxígeno a niveles máximos en un intento inútil de recuperar el potencial de la membrana (capacidad respiratoria máxima). La diferencia entre la capacidad respiratoria máxima y la respiración basal es la capacidad respiratoria de repuesto de la célula, que representa la cantidad de respiración que no es utilizada por la célula para generar ATP en estado basal, pero podría ser potencialmente reclutado en respuesta a aumentos en la demanda de ATP o en condiciones de estrés8. La tercera inyección es una combinación de rotenona y antimicina A. Esta inyección detiene completamente el ETC y el OCR disminuye a su nivel más bajo, siendo el consumo restante de oxígeno no mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Los cambios en las vías metabólicas podrían predecir de alguna manera el funcionamiento de las células NK, ya que se ha sugerido que la activación continua de células NK con citoquinas in vitro podría conducir al agotamiento de las células NK mediante el estudio de diferentes vías metabólicas10,,11. La correlación entre el estado metabólico de las células NK y la función es muy importante desde el punto de vista de la inmunoterapia contra el cáncer. En este campo, se ha probado la activación de células NK con perfusión de IL-15, solas o en combinación con anticuerpos terapéuticos monoclonales con el fin de mejorar la matanza de células tumorales12,,13,,14. El conocimiento del estado metabólico de las células NK en respuesta a estas estrategias de tratamiento proporcionaría un valioso predictor del estado de activación de la célula NK y la función de matar.
El estudio de las vías metabólicas en otras células mieloides y linfoides como monocitos, células T y B se ha descrito15 y se han publicado métodos optimizados16. En este protocolo proporcionamos un método que combina un protocolo de aislamiento NK que produce un gran número de células NK puras y viables y un protocolo optimizado para medir la actividad metabólica utilizando un analizador de flujo extracelular. Aquí mostramos que este es un método válido para el estudio de los cambios metabólicos en el reposo y las células NK humanas activadas IL-15. Para el ensayo de flujo extracelular, se han probado y optimizado parámetros como el número de células y las concentraciones de fármacos. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular está totalmente automatizado y es capaz de probar en tiempo real, con cantidades muy bajas de células, hasta 92 muestras simultáneamente, y por lo tanto permite exámenes de alto rendimiento (con múltiples muestras y réplicas) de una manera relativamente rápida17.
Este método puede ser utilizado por investigadores interesados en evaluar la función celular NK mediante el estudio del metabolismo de las células NK. Se podría aplicar también a las células activadas por otras citoquinas, anticuerpos o estímulos solubles.

<table><tbody><tr><td>2-Desoxi-D-glucosa (2-DG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D8375-5G Compuesto inyector de prueba de</td><td>esfuerzo de glucólisis</td></tr><tr><td>2,4-Dinotrofenol (2,4-DNP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D198501</td><td>ETC desacoplador / compuesto inyector de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos/ Fondo redondo con tapa</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>Cultivo celular NK</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Inhibidor del complejo III / Compuesto inyector de prueba de glucólisis y esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences Adquisición de</td><td></td><td>datos de flujo</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences Adquisición de</td><td></td><td>datos de flujo</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Adhesivo celular</td></tr><tr><td>CyQUANT ensayo de proliferación celular ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>C7026</td><td>Ensayo de proliferación celular para la cuantificación de ADN. Contiene tampón de lisis celular y colorante CyQUANT GR</td></tr><tr><td>Kit de selección positiva CD3 humano EasySep II</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>17851</td><td>Aislamiento de células NK de PBMC</td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células NK humanas EasySep Tecnologías</td> de <td>células madre</td><td>19055</td><td>Aislamiento de células NK de PBMC Tecnologías de</td></tr><tr><td>células madre</td> magnéticas<td>EasySep 18001</td><td></td><td>Aislamiento de células NK de PBMC</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8</td><td>Calidad Biológico</td><td>10128-446</td><td>NK vender tampón</td></tr><tr><td>de separación Tubos FACS</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Experimento de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubos cónicos</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Separación de células NK</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>Tampón de separación de células NK</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Análisis de datos de flujo</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Componente del medio de prueba de esfuerzo mitocondrial. Prueba de glucólisis compuesto inyector de prueba</td></tr> de <tr><td>estrés Cóctel de inhibidores de proteasa Halt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Inhibidor de la proteasa 100X. Uso en tampón de lisis RIPA</td></tr><tr><td>IL-15 humano Peprotech</td><td></td><td>200-15-50ug</td><td>Estimulación celular NK</td></tr><tr><td>Suero humano (HS)</td><td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>NK suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>célula NK medio de cultivo</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Componente de los medios de prueba de esfuerzo</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua reparable</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Colorante de viabilidad para tinción por citometría de flujo</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>Separación de PBMCs de la sangre humana</td></tr><tr><td>Ratón anti-humano CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>Tinción con citometría de flujo de células T Tinción</td></tr><tr>con citometría de flujo<td>de ratón CD56 PE</td><td>BD de Pharmingen</td><td>555516</td><td>NK Tinción con citometría de flujo NK</td></tr><tr><td>de ratón antihumana NKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>tinción con citometría de flujo NK</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Inhibidor del complejo V / compuesto inyector de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Célula NK tampón de separación</td></tr><tr><td>Pierce BCA kit de ensayo de proteínas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Para la determinación de la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Tampón RIPA Boston</td><td>BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Lisis celular</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Inhibidor del complejo II / glucólisis y prueba de estrés mitocondrial compuesto inyector</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Controlador para el analizador Seahorse XFe96</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Software de escritorio</td><td>Agilent</td><td></td><td>Para el análisis de datos</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Extracellular Flux base medium</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Analizador de flujo extracelular</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Incluye 20 placas de cultivo celular XF96, 18 cartuchos de sensor XFe96, guías de carga para transferir compuestos al cartucho de ensayo y 1 frasco de solución calibrante (500 ml).</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Para preparar la solución de Cell-Tak</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Componente del medio de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr></tbody></table>

análisis del metabolismo celular natural humano

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Las células de Natural Killer (NK) median principalmente las respuestas inmunitarias antitumorales y antivirales innatas y responden a una variedad de citoquinas y otros estímulos para promover la supervivencia, la proliferación celular, la producción de citoquinas como la gamma de interferón (IFN) y/o los programas de citotoxicidad. La activación de células NK por estimulación de la citoquina requiere una remodelación sustancial de las vías metabólicas para apoyar sus requisitos bioenergéticos y biosintéticos. Hay un gran cuerpo de evidencia que sugiere que el metabolismo de células NK deteriorado está asociado con una serie de enfermedades crónicas incluyendo la obesidad y el cáncer, que destaca la importancia clínica de la disponibilidad de un método para determinar el metabolismo de las células NK. Aquí describimos el uso de un analizador de flujo extracelular, una plataforma que permite mediciones en tiempo real de la glucólisis y el consumo de oxígeno mitocondrial, como una herramienta para monitorear los cambios en el metabolismo energético de las células NK humanas. El método descrito aquí también permite el seguimiento de los cambios metabólicos después de la estimulación de las células NK con citoquinas como IL-15, un sistema que actualmente se está investigando en una amplia gama de ensayos clínicos.

El aislamiento de las células NK de la sangre periférica proporciona una población pura y viable
El ensayo de flujo extracelular se basa en la medición de la concentración de H+ y O2 en el pozo y no distinguirá entre diferentes poblaciones de células o su viabilidad. Por esta razón, la obtención de una población altamente pura y viable de la célula de interés fue el paso clave para tener éxito en estos experimentos.
El aislamie...

En este artículo, describimos un método para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en células humanas primarias de Asesino Natural (NK) aisladas de sangre periférica, en reposo o después de la activación inducida por IL15. El protocolo descrito podría extenderse fácilmente a las células NK humanas primarias activadas por otras citoquinas o estímulos solubles.

Análisis del metabolismo celular natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Este método permite la determinación del metabolismo natural de las células asesinas. Un parámetro clave en la activación midiendo el consumo de oxígeno y los cambios de pH en el medio extracelular. La ventaja del analizador de flujo extracelular es que está totalmente automatizado y es capaz de probar hasta 92 muestras en tiempo real con bajas cantidades de células.Permitiendo así pantallas de alto rendimiento. Un método válido para determinar la glucólisis y la respiración en las células de la inocuidad es muy importante en la clínica. Dado que hay muchas enfermedades incluyendo la obesidad y el cáncer donde el metabolismo celular se deteriora.Comience por pipetear 20 mililitros de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mililitros. Mientras mantiene el tubo en un ángulo de 30 grados, pipetee suavemente 20 mililitros de sangre sobre el medio. Creación de una interfaz visible y bien definida entre los dos fluidos.Centrifugar los tubos durante 25 minutos a 1000 veces G.Then cuidadosamente tomar los tubos fuera de la centrífuga y colocarlos en un bastidor. Compruebe la presencia de una capa visible de células en la interfaz entre LSM y plasma. Aspirar suavemente la capa de celda mononuclear con una pipeta de plástico de 10 mililitros y colóquela en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Lave las células mononucleares dos veces con 45 mililitros de PBS. Y centrifugarlos a 800 veces G durante cinco minutos. Para aislar las células o engaves asesinos naturales, cuente los mares de PVM y resuspútelos en el búfer de separación NK en un tiempo de 10 a las octavas células por mililitro.A continuación, transfiera 10 mililitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de 50 mililitros. Añadir 500 microlitros de mezcla de anticuerpos de aislamiento de células NK. Y 10 microlitros de anti CD tres mezcla de anticuerpos de aislamiento positivo a los PBMC.Y incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Cuentas magnéticas de vórtice y añadir un mililitro a los PBMC y anticuerpos. Luego incubar el MIGS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.Agregue 35 mililitros de tampón de aislamiento NK y coloque el tubo en el imán durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de plástico de 50 mililitros sin tocar los lados o la parte inferior del tubo. Cuente las células y centrifúquelas a 800 veces G durante cinco minutos.Para estimular las células NK con pasillo soluble 15, resuspender 750,000 células en 100 microlitros de IMDM que contienen 10%HS en un pozo de una placa de 96 pozos. Diluir el pasillo humano de 15 a un microgramo por mililitro en el IMDM y el 10%HS. Y añadir 100 microlitros del pasillo humano diluido 15 a las células.Repare una muestra de control con células no estimuladas y coloque ambas muestras en la incubadora a 37 grados centígrados. Estimular las células durante 48 horas y luego realizar el ensayo de flujo extracelular. El día antes del experimento, encienda el analizador y deje que se caliente hasta 37 grados centígrados.Abra el paquete del cartucho de censura y separe el cartucho de la placa de utilidad. A continuación, añada 200 microlitros de la solución calibrante a cada pozo de la placa de utilidad. Y vuelva a colocar el cartucho central para asegurarse de que los sensores estén completamente sumergidos.Para obtener resultados óptimos, incuba el cartucho durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora libre de dióxido de carbono. Que debidamente humidificado. Para preparar una hoja recubierta adhesiva, pipetee 25 microlitros de la solución adhesiva celular a cada pozo de la placa.E incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire la solución y lave la placa dos veces con 200 microlitros de agua estéril por pozo. Mantenga la placa abierta durante 15 minutos dentro de la capucha de cultivo celular para permitir que los pozos se sequen.Centrifugar las células NK previamente aisladas añaden 200 veces G durante cinco minutos. Luego retire los sobrenadantes y lave las células en el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial calentado o en el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis. Pele las células de nuevo y resusppend a la concentración celular preferida en el mismo medio.Coloca 180 microlitros de suspensión celular por pozo en la placa de ensayo. Utilice pozos A uno, A 12 H uno y H 12 como pozos de control para la corrección de fondo. Añadiendo 180 microlitros del medio de ensayo a estos Pozos Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora libre de dióxido de carbono.Centrifugar la placa a 200 veces G durante cinco minutos. Luego observe las células bajo el microscopio para comprobar que forman una capa de mano en la parte inferior del pozo. Incubar las células durante otros 25 minutos.Soluciones de trabajo cálidas a 37 grados centígrados. Y reajuste su pH a 7.4 si es necesario. Cargue los compuestos previamente preparados para una prueba de esfuerzo mitocondrial o para una prueba de esfuerzo de glucólisis en las placas A, B y C del cartucho de censura hidratado Vuelva a colocar el cartucho de censura cargado en la incubadora mientras configura el programa.Para configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular, abra el software y utilice Definiciones de grupo para definir las condiciones de pretratamiento. Utilice la pestaña Mapa de placas para indicar los grupos de pozos que tienen condiciones similares Indicar también la corrección de fondo y los pozos vacíos. A continuación, establezca el programa en la pestaña de protocolos.Inicie el programa y coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad en la bandeja. Después del paso de calibración, sustituya la placa calibrante de la placa de ensayo por las celdas conectadas. Una vez completada la ejecución, recupere los datos y analícelos.Con el fin de evaluar la pureza y viabilidad de las células NK. Los pequeños alec Watts de los mares PVM y la población aislada de células NK fueron manchados y analizados por citometría de flujo. La pureza de la población de células NK se estableció por doble permanencia contra CD tres y CD 56 o NKP 46.Aquí se muestra una gran tasa de consumo de oxígeno mitocondrial para las células NK humanas. Como era de esperar, los números de celda I mostraban valores de OCR más altos. Los números celulares también se correlacionan linealmente con la cantidad de ADN o proteína en el pozo.Por otro lado, los números de celda más altos no eran óptimos. Porque tras la adición de DNP, la concentración de oxígeno en el pozo se agotó totalmente en cada ciclo. Lo que impidió el cálculo preciso del OCR.En las células NK humanas, 100 micromolar DNP fue encontrado para ser la dosis óptima. Aquí se muestra un experimento típico de prueba de esfuerzo mitocondrial con 750.000 células NK por pozo. En esta prueba la oligomicina conduce a una disminución dramática en el consumo de oxígeno.Y un aumento en ECAR. Lo que representa un cambio a la glucólisis y un esfuerzo para mantener los niveles celulares de ATP. La activación de las células NK por el pasillo 15 causó un aumento tanto en el consumo de oxígeno mitocondrial como en la acidificación extracelular.La respiración basal máxima y la respiración vinculada a ATP aumentaron, pero no la fuga de protones o la respiración no mitocondrial. Además, la tasa de OCR/ECA disminuyó Indicando un cambio a un metabolismo glucolítico después de la estimulación IL 15. Al realizar este protocolo, es muy importante obtener una población celular pura y saludable para determinar el número de célula óptimo y valorar la concentración de nocabadores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el método para analizar el metabolismo energético en células NK humanas activadas utilizando un analizador de flujo extracelular. Diferentes inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones influyen en la síntesis de ATP, que se mide a través de la tasa de consumo de oxígeno u OCR, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y la bioenergética.

Monitorización en tiempo real del metabolismo energético en células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

La evasión de la erradicación mediada por células mortales por asesinos naturales (NK) por las células cancerosas es importante para la iniciación y progresión del cáncer. Aquí, presentamos dos protocolos no basados en la radiactividad para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK hacia las células tumorales hepáticas. Además, se presenta un tercer protocolo para analizar la migración de células NK.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Este protocolo describe un método sin etiquetas para el análisis rápido de células individuales del recuento y la actividad de las células asesinas naturales (NK) utilizando tecnología de imágenes de sombra sin lentes. Este método cuantifica los cambios morfológicos en células NK individuales mediante el análisis computarizado de sus patrones de difracción.

Plataforma de imágenes sin lentes desplegable en campo para un análisis rápido sin etiquetas de la activación de células asesinas naturales

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a medir el metabolismo de células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular automatizado. Este protocolo permite evaluar glucólisis y respiración mitocondrial en tiempo real con alta capacidad de procesamiento.

Análisis del metabolismo celular natural humano

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