Name: Contribución de la bomba Na+/ K+ a la explosión rítmica, explorada con modelado y análisis dinámicos de abrazadera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Explore la contribución de la bomba Na+/K+ a la explosión rítmica en interneuronas cardíacas de sanguijuela mediante técnicas de abrazadera dinámica. Este método permite controlar corrientes iónicas en tiempo real para estudiar la excitabilidad neuronal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Christian Erxleben por los experimentos preliminares de pinza dinámica en neuronas HN(7) que demostraron sus capacidades de estallido. Angela Wenning ayudó a los experimentos con el asesoramiento de expertos. Reconocemos a los NIH por financiar este trabajo a través de la Subvención 1 R21 NS111355 a GSC y RLC.

NOTA: Los sujetos experimentales de animales invertebrados no están regulados por los NIH ni por las Universidades Estatales de Emory y Georgia. Sin embargo, se tomaron todas las medidas para minimizar el sufrimiento de las sanguijuelas utilizadas en este trabajo.
1. Prepare el ganglio aislado 7 del cordón nervioso de la sanguijuela
<ol><li>Mantenga las sanguijuelas Hirudo verbana en agua artificial de estanque (que contiene 0,05% p/v de sal marina) diluidas en agua desionización a 16 °C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12.</li>
	<li>Prepare las sanguijuelas para la disección anestesiando en frío en un lecho de hielo picado durante &gt;10 minutos hasta que quede inmóvil.</li>
	<li>Llene un plato de disección negro forrado de resina a una profundidad de ~ 1 cm con solución salina refrigerada que contenga 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.7 mM CaCl2,10 mM D-glucosa y 10 mM HEPES en agua desionización; pH ajustado a 7,4 con 1 M de NaOH. Fije el lado dorsal de la sanguijuela hacia arriba en la cámara revestida de resina negra (al menos 20 cm x 10 cm con una profundidad de al menos 2 cm por encima de la resina que tiene al menos 2 cm de espesor).</li>
	<li>Bajo un esteromicroscopio a un aumento de 20x con iluminación de guía de luz oblicua, haga un corte longitudinal de al menos 3 cm de largo con tijeras de resorte de 5 mm a través de la pared del cuerpo en laparte rostral 1/3 del cuerpo. Use alfileres para apartar la pared del cuerpo y exponer los órganos internos. NOTA: Cualquier harina de sangre almacenada se puede eliminar por succión con una pipeta Pasteur pulida al fuego.</li>
	<li>Aislar un ganglio individual de la mitad del cuerpo 7 (séptimo ganglio segmentario libre caudal al cerebro).<ol>
<li>Abra el seno en el que reside el cordón nervioso con las tijeras de resorte de 5 mm. Asegúrese de dividir el seno dorsal y ventralmente dejando dos tiras de seno. Use pinzas afiladas # 5 para ayudar a guiar el corte y sostener el seno.</li>
		<li>Mantenga el seno unido a cada una de las dos raíces nerviosas bilaterales que emergen del ganglio (se adhiere firmemente a cada raíz) para usar estas tiras de seno para fijar el ganglio.</li>
		<li>Retire el ganglio del cuerpo cortando los haces nerviosos conectivos rostrales y caudales que unen los ganglios (lo más lejos posible del ganglio 7) y las tiras sinusales, yluego corte las raíces laterales a donde emergen del seno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fije el ganglio (usando viejas pinzas #5 embotadas) con alfileres de insectos minuten acortados, ventral hacia arriba, en placas de Petri claras y forradas de resina. Inserte alfileres en las tiras de senos paranasales y tejido suelto adheridos a las raíces y los conectivos rostrales y caudales, lo más lejos posible del ganglio. NOTA: La resina no debe tener un grosor superior a 3 mm si se quiere lograr una buena iluminación desde abajo durante la grabación. Asegúrese de que el ganglio esté tenso, tanto longitudinal como lateralmente.</li>
	<li>Aumente la ampliación del estereomiroscopio a 40 veces o más, y ajuste la iluminación oblicua para que los cuerpos celulares neuronales se puedan ver fácilmente en la superficie ventral del ganglio justo debajo del perineurio.</li>
	<li>Retire el perineurio del ganglio (desvainación) con microscisores.<ol>
<li>Comience el desenvainado cortando la funda suelta entre las raíces de un lado, y continúe el corte lateralmente hacia el otro lado, asegurándose de mantener las cuchillas de tijera superficiales y no dañar los cuerpos celulares neuronales directamente debajo de la funda.</li>
		<li>Haga un corte superficial similar caudalmente desde el corte lateral a lo largo de la línea media.</li>
		<li>Ahora agarre el colgajo caudolateral de la vaina de un lado con las finas pinzas # 5, aléjelo del ganglio y córtelo con las microescisoras.</li>
		<li>Repetir en el otro lado; este procedimiento expone ambas neuronas HN(7) para su registro con microelectrodos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el plato de preparación en la configuración de grabación y superfuse con solución salina a un caudal de 5 ml / min a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Identificar y registrar interneuronas cardíacas sanguijuelas con microelectrodos afilados
<ol><li>Durante la duración del registro de la neurona HN(7) (las grabaciones duran entre 30 y 60 min), adquirir y digitalizar las trazas de corriente y voltaje intracelulares de un electrómetro neurofisiológico de muestreo a una velocidad de 5 kHz con un sistema de adquisición de datos digitales (analógico a digital, A a D) y estimulación (digital a analógico, D a A), y mostrar en la pantalla de una computadora. NOTA: Cualquier software comercial o personalizado y placa de A a D/D a A se puede utilizar para la adquisición de datos (A a D). Se requiere de D a A y software personalizado para la abrazadera dinámica.</li>
	<li>Bajo un esterocroscopio a 50-100x con iluminación de campo oscuro desde abajo, identifique tentativamente una neurona HN(7) del par bilateral por su ubicación canónica en la posición posteriolateral en el ganglio de cuerpo medio siete.</li>
	<li>Ahora trate de penetrar en la neurona putativa HN(7) con un microelectrodo afilado lleno de 2 M de acetato de potasio y 20 mM KCl utilizando un micromanipulador.<ol>
<li>Coloque el microelectrodo muy cerca del cuerpo celular objetivo.</li>
		<li>Observe continuamente el potencial registrado con el electrómetro y establezca este potencial en cero mV antes de penetrar en la neurona.</li>
		<li>Penetrar en la neurona con el microelectrodo, impulsando lentamente el electrodo a lo largo de su eje largo con el manipulador. Usando la función de zumbido del electrómetro, ajustado a 100 ms de duración del zumbido, hasta que se observe un cambio negativo en el potencial de la membrana y una actividad de aumento vigoroso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configure el electrómetro en modo de abrazadera de corriente discontinua (DCC) ≥ 3 kHz para registrar simultáneamente el potencial de membrana y la corriente de paso con el microelectrodo único (compensación de capacidad establecida justo debajo del timbre y luego marcada de nuevo 10%).<ol>
<li>Monitoree la sedimentación del electrodo durante la DCC en un osciloscopio.</li>
		<li>Inyecte una corriente constante de -0.1 nA con el inyector de corriente constante del electrómetro durante uno o dos minutos para estabilizar la grabación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar definitivamente la neurona HN(7) por su característica forma de espiga y débil actividad de estallido (Figura 1Ci).</li>
	<li>Realice cualquier análisis de datos sin conexión una vez completado el experimento y guarde todos los datos en un disco.</li>
</ol>3. Construir una HN en tiempo real u otra neurona modelo
<ol><li>Cree software personalizado utilizando una placa de procesamiento de señal digital (DSB; D a A y A a D) en un ordenador de sobremesa para implementar en tiempo real las corrientes modelo descritas en2,4 o diferentes corrientes modelo para otras neuronas o experimentos.<ol>
<li>Utilice ecuaciones de estilo Hodgkin-Huxley, ya que son el método generalmente preferido para representar las corrientes del modelo.</li>
		<li>Consulte7 para obtener una descripción detallada de la implementación del modelo HN en tiempo real y la abrazadera dinámica antes de la adición de la corriente de la bomba. Consulte la sección de introducción para la descripción de las corrientes, la concentración intracelular de Na+ y las conductancias de la neurona HN(7) viva en el modelo HN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Implementar y variar las conductancias/corrientes dinámicas de la abrazadera
<ol><li>Utilice el software de abrazadera dinámica personalizado para el DSB para implementar y cambiar en tiempo real la abrazadera dinámica de cualquiera de las conductancias y corrientes programadas accesibles a la interfaz gráfica de usuario(Figura 3)(GUI) del modelo en tiempo real HN de la neurona HN(7). NOTA: Como recordatorio, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> y <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> son la conductancia máxima de la corriente persistenteNa+ (IP) y la corriente máxima de la bomba (bombaI), respectivamente.</li>
	<li>Utilice los cuadros de entrada de gui en el software para realizar cambios, a medida que se ejecuta el modelo, en el <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (cuadro PumpMaxL) y <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (cuadro GpinHNLive)(Figura 3). NOTA: Los cuadros de entrada de gui aceptan valores con tipo, y se recomiendan pasos de 0.1 nA <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> para y pasos de 1 nS para <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .<ol>
<li>Agregue pequeñas cantidades de <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> y <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> con abrazadera dinámica para estabilizar el estallido de la neurona HN(7), que se debilita por una fuga inducida por microelectrodos, como se muestra en la Figura 1Cii. NOTA: La penetración aguda de microelectrodos causa daños en la membrana que se expresan como un aumento de la conductancia de la fuga o una disminución de la resistencia de entrada.</li>
		<li>Comience agregando un valor <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> de 0.1-0.2 nA, que compensa la fuga inducida por microelectrodos, pero deprime la excitabilidad, y luego aumente <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> gradualmente, lo que aumenta la excitabilidad, hasta que se produzca un estallido regular, generalmente a <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ~ 1-4 nS(Figura 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>Co-variar sistemáticamente estas corrientes (incrementos de 0,1 nA para <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> y 1 nS para <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ) a la neurona HN(7) registrada con pinza dinámica ( Figura3), y evaluar sus efectos sobre las características de la ráfaga: frecuencia de pico (f: la recíproca del promedio del intervalo interspike durante una ráfaga), intervalo de interbursura (IBI: el tiempo entre el último pico en una ráfaga y el primer pico en la siguiente ráfaga), duración de la ráfaga (BD: el tiempo entre el primer pico en una ráfaga y el último pico en una ráfaga), y el período de ráfaga (T: el tiempo entre el primer pico en una ráfaga y el primer pico en la explosión posterior).<ol>
<li>Cambie los valores de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> y, como en la demostración en video, para familiarizarse con la técnica y luego aventurarse.<ol>
<li>Manténgase <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> en un valor fijo específico y barre en incrementos de 1 nS en un rango de actividad de ráfaga regular de <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> soporte.</li>
			<li>Ahora aumente el valor fijo de <img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 0.1 nA y nuevamente barre sobre un rango de actividad de ráfaga regular de <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> apoyo.</li>
			<li>Para cada par de parámetros implementado, recopile datos que contengan al menos 8 ráfagas para que se puedan realizar mediciones promedio confiables de f, IBI, BD y T.</li>
			<li>Continúe con barridos durante el tiempo que la neurona permanezca viable, según lo evaluado por un fuerte pico y un potencial de oscilación basal estable.</li>
			<li>Recopilar datos de varias neuronas (de diferentes animales) para generar un gráfico compuesto(Figura 5).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

El modelado, la pinza dinámica y los análisis resultantes que permiten son técnicas útiles para explorar cómo los individuos y los grupos de conductancia /corrientes iónicas contribuyen a la actividad eléctrica de las neuronas(Figura 1, Figura 2,Figura 4y Figura 5). El uso de estas técnicas muestra cómo la corriente de la bomba Na+/ K+ (bombaI)interactúa con las corrientes de voltaje, particularmente la corriente persistente de Na+ (IP),para promover un estallido robusto en las HN centrales del generador del patrón de latidos del corazón de la sanguijuela. Al combinar experimentos de abrazadera dinámica y modelado, es posible probar modelos más directamente de lo que es posible con el registro de voltaje ordinario y las técnicas de abrazadera de corriente. Los resultados obtenidos de los experimentos de abrazadera dinámica(Figura 5)se utilizarán para refinar aún más el modelo HN. El método básico de pinzamiento dinámico demostrado aquí se puede personalizar para reflejar las propiedades de cualquier neurona en estudio si se puede determinar un modelo matemático de corrientes neuronales con experimentos de pinza de voltaje.
La finalización exitosa de los experimentos del tipo que se muestra aquí requiere un empalamiento cuidadoso de un HN u otra neurona cuando se usa un microelectrodo afilado, porque el estallido fuerte se reduce por la penetración del electrodo1. (Las técnicas de registro de parches de células enteras, que minimizan las fugas introducidas, también son aplicables a otras neuronas, pero no funcionan bien en las neuronas sanguijuelas). Es fundamental que el empalamiento de la neurona HN cause un daño mínimo a la neurona (fuga añadida), y la resistencia de entrada debe ser monitoreada y debe estar en el rango de 60-100 MOhms para experimentos exitosos4.
La pinza dinámica es una técnica poderosa, pero tiene limitaciones impuestas por la geometría neuronal porque las conductancias artificiales se implementan en el sitio del electrodo de grabación -generalmente el cuerpo celular- no en el sitio donde las corrientes generadoras de ritmo generalmente se localizan5,6,10. En las neuronas HN sanguijuelas, el cuerpo celular está eléctricamente cerca de la zona de integración (neurita principal) de la neurona donde se localizan la mayoría de las corrientes activas y se inician picos.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Los latidos del corazón en las sanguijuelas son impulsados por una GPC que consiste en 9 pares bilaterales de interneuronas cardíacas (HN) distribuidas en la mayor cantidad de ganglios segmentarios de la mitad del cuerpo. En el núcleo de la GPC se encuentran pares mutuamente inhibitorios de interneuronas ubicadas en los ganglios segmentarios3º y4º que forman osciladores semicéntricos (HCO)(Figura 1A). Estas neuronas continúan estallando cuando se aíslan sinápticamente farmacológicamente usando bicucullina1. Otros, como el par en los ganglios segmentarios7 (el foco de este protocolo), también son ráfagas, capaces de producir actividad de estallido cuando se aíslan sinápticamente. No están mutuamente conectados y reciben solo entrada descendente, y por lo tanto se aíslan fácilmente al separar el ganglio del resto del cordón nervioso. Esta actividad de estallido independiente es sensible a la corriente de fuga introducida causada por la penetración con microelectrodos afilados para la grabación, pero estalla vigorosamente cuando se graba con métodos de parche suelto1.
Se han modelado tanto las neuronas HN individuales como las HN HNO HCOs (modelos de compartimento isopotencial único basados en Hodgkin-Huxley de neuronas HN que contienen todas las corrientes sinápticas y de voltaje identificadas experimentalmente), y todas las características de estallido del sistema vivo se han capturado con éxito2. La miomodulina, un neuropéptido endógeno en las sanguijuelas, disminuye notablemente el período (T) del ritmo de estallido de las neuronas HN aisladas y las HN HNo. Este modulador actúa para aumentar la corriente h (corriente interna activada por hiperpolarización, Ih)y para disminuir labombaI3. Esta observación llevó a la exploración de cómo labomba I interactúa con Ih,y cómo su co-modulación contribuye a la actividad rítmica de las neuronas HN. La activación de la bomba mediante el aumento de [Na+]i (utilizando el ionóforo monensina) acelera el ritmo de estallido de HN tanto en HN HCOs como en neuronas HN aisladas4. Esta aceleración dependía de Ih. Cuando Ih estaba bloqueado (2 mM Cs+),el período de ráfaga no se alteraba por este método de activación de la bomba; sin embargo, la duración de la ráfaga (BD) se redujo y el intervalo de interbursura (IBI) aumentó tanto en HN HCOs como en neuronas HN aisladas4.
Para este protocolo, todas las corrientes de una neurona HN(7) viva, incluida la corriente de bomba, I bomba,se incorporan en el modelo HN de la siguiente manera:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
donde C es la capacitancia de membrana (en nF), V es el potencial de membrana (en V), t es el tiempo (en s). Las descripciones y ecuaciones detalladas de la corriente iónica se han descrito en otra parte2,4. La neurona modelo HN completa se ejecuta en tiempo real (Figura 2). El software estará disponible en GitHub en el momento de su publicación y será adecuado para ejecutarse en la placa de procesamiento de señal digital descrita en la Tabla de materiales. Aquí, el foco de investigación es la corriente de la bomba Na+/ K+ (bombaI) y las corrientes de voltaje que contribuyen con un flujo significativo de Na+: una corriente rápida de Na+ (INa) y una corriente persistente de Na+ (IP). Las conductancias máximas de estas corrientes son <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> respectivamente. La bomba Na+/K+ intercambia tres iones intracelulares Na+ por dos iones K+ extracelulares, produciendo así una corriente neta hacia el exterior. Es importante destacar que bombea 3 veces más Na+ fuera de la neurona de lo que indica esta corriente, lo cual es importante para calcular la concentración intracelular de Na+.
La corriente de bomba Na+/K+ depende de las concentraciones intracelulares de Na+ y se expresa mediante la siguiente función sigmoidal:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
donde [Na]i es la concentración intracelular de Na+, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> es la corriente máxima de la bomba Na+/K+, [Na]ih es la concentración intracelular de Na+ para la media activación de la bomba Na+/K+, y [Na]es la sensibilidad de la bomba Na+/K+ a [Na]i. [Na]i se construye como resultado de las afluencias de Na+ transportadas por IP e INa y se ve disminuida por el eflujo na+ de la bomba Na+/ K+. La contribución de Ih e ILeak al flujo total deNa+ es pequeña y no se considera en el modelo en tiempo real.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
donde, v es el volumen (~6.7 pL) del reservorio intracelular de Na+, F es la constante de Faraday, y la concentración extracelular de Na+ se mantiene constante.
Se han diferenciado las conductancias dependientes de voltaje y fugas, que responden al potencial de membrana, de la corriente de la bomba, que está regulada por la concentración intracelular calculada de Na+ ([Na+]i). [Na+] i se construye a través de na+ entrada a través de la corriente rápida Na+ (INa) que produce potenciales de acción (picos) y la corriente persistente Na+ (IP) que proporciona la despolarización para soportar el aumento. [Na+] i es, a su vez, reducido por la acción de la bomba a través de la extrusión deNa+. Se han asumido valores basales de HN vivo de <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS) y <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> (150 nS), y tenemos en cuenta cualquier abrazadera dinámica <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> añadida.
El objetivo del protocolo descrito aquí es manipular la bomba de forma precisa y reversible en tiempo real para descubrir cómo interactúa con las corrientes de voltaje (corriente persistente de Na+ en el protocolo actual) para controlar el estallido rítmico en HNs individuales. Para lograr este objetivo, se utilizó una abrazadera dinámica, que introduce artificialmente, por orden, una cantidad precisa de cualquier corriente que se puede calcular a medida que se ejecuta el modelo. Este método tiene ventajas sobre la manipulación farmacológica de la bomba, que afecta a todo el tejido, puede tener efectos fuera del objetivo que a menudo son difíciles de revertir y no se pueden manipular con precisión. La abrazadera dinámica5,6 lee el voltaje de una neurona registrada en tiempo real(Figura 1B)y calcula e inyecta, en tiempo real, la cantidad de cualquier corriente basada en ecuaciones del modelo y los valores establecidos de <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> cualquiera o <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> . Métodos similares se pueden aplicar fácilmente a cualquier neurona que se pueda registrar intracelularmente. Sin embargo, los parámetros tendrán que ser reescalados a la neurona elegida, y la neurona debe aislarse de las entradas sinápticas, por ejemplo, farmacológicamente.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbana</td><td>Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>sanguijuelas vivas 2-3 gramos</td></tr><tr><td><fuerte>QUÍMICOS</FUERTE></td>AGUA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>DE <td>ESTANQUE ARTIFICIAL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1.8 mM agregar el último después de ajustar el pH</td></tr><tr><td></td><td>glucosa Sigma Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Instant Ocean (sal marina)</td> <td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0.05% (p/v) diluido en agua desionizada</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N Solución</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2105-50ML</td><td>Ajuste a pH 7.4 con NaOH</td></tr><<tr><td>MICROELECTRODOS fuertes></acetato ></td><td></td><td></td><td></td> K</tr> <tr><td></td><td>fuerte Sigma Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>2</td></tr><tr><td>M KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>SALINA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><EQUIPO>FUERTE</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina Dumont</td><td>11251-30 O 11251-20</td><td>Para la disección general de sanguijuelas</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B Electrómetro DCC</td><td>Axon Instruments Molecular Devices</td><td>2A/2B</td><td>Para el registro del potencial de la membrana neuronal y la pinza amperimétrica discontinua</td></tr><tr><td>Resina negra</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>Líneas generales plato de disección</td></tr><tr><td>Vidrio capilar de 1 mm de diámetro exterior, 0,75 mm de diámetro interior</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>Para la fabricación de microelectrodos afilados</td></tr><tr><td>Resina transparente</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>Líneas Placa de Petri utilizada para montar ganglios para electrofisiología</td></tr><tr><td>Condensador de campo oscuro</td><td>Nikon</td><td>Dry 0.95-0.80 MBL 1210</td><td>Para iluminar la preparación de ganglios durante el empalamiento de células</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>realiza de A a D y de D a A para la adquisición de datos y la estimulación durante la electrofisiología</td></tr><tr><td>Placa de procesamiento de señal digital</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>Nuestro software implementa todas las conductancias/corrientes en nuestro modelo de neurona HN en una placa controladora DS1103 dSPACE PPC en tiempo real a una velocidad de 20 kHz con una GUI de ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Alemania)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Para la fabricación de microelectrodos afilados</td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidad Fiber-Lite</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>170D</td><td>Para iluminar la disección general y para iluminar la preparación de los ganglios durante el empalamiento de la célula</td></tr><tr><td>Amplificador de cabecera para AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A Ganancia:0.1LU</td><td>Ahora forma parte de Molecular Devices para el registro del potencial de la membrana neuronal y la pinza amperimétrica discontinua Guía de</td></tr><tr><td>luz</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>Para iluminar la disección general y para iluminar la preparación de los ganglios durante el empalamiento celular</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>Micromanipulador para el empalamiento de células con microelectrodos</td></tr><tr><td>Micromanipulador controlador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>Controles micromanipuladores para el empalamiento de células con microelectrodos</td></tr><tr><td>Pines Minuten</td><td>BioQuip</td><td>0,15 mm de diámetro 1208SA</td><td>Debe acortarse mediante un corte a ~ 5 mm</td></tr><tr><td>Tablero de pruebas óptico 3' x 5' x 8"</td> <td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Con los 4 aisladores neumáticos a continuación utilizados para construir un espacio de trabajo libre de vibraciones para la electrofisiología</td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>Para controlar la sedimentación de los electrodos durante el DCC</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td></td><td>Suministrado por Fine Science Tools (Foster City, CA) catálogo # 15371-92</td></tr><tr><td>Software pClamp 9</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>Ahora parte de Moleculear Devices utiliza el Digidata 1440 para la adquisición de datos y la estimulación durante la electrofisiología</td></tr><tr><td>Aisladores neumáticos 28"</td><td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Con placa de pruebas óptica utilizada para construir un espacio de trabajo libre de vibraciones para electrofisiología</td></tr><tr><td>Software de Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (Obsoleto)</td><td>Implementa una abrazadera dinámica en la placa de procesamiento de señales digitales</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Piezas oculares utilizadas para diseccionar la sanguijuela y eliminar y desenvainar los ganglios</td></tr><tr><td>Esteromoscio</td><td>Piezas</td> oculares <td>Wild M5</td><td>20x utilizadas en la estación electrofisiológica para visualizar la neurona para la penetración de microelectrodos</td></tr><tr><td>Estudiante Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Para la disección general de sanguijuelas</td></tr></tbody></table>

contribución de la bomba na+/ k+ a la explosión rítmica, explorada con modelado y análisis dinámicos de abrazadera

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

La bomba Na+/ K+, a menudo considerada como una función de fondo en la actividad neuronal, contribuye con una corriente hacia afuera(bombaI)que responde a la concentración interna de Na+ ([Na+]i). En las neuronas en explosión, como las que se encuentran en las redes neuronales generadoras de patrones centrales (CPG) que producen movimientos rítmicos, se puede esperar que el [Na+]i y, por lo tanto, la bombaI , varíe a lo largo del ciclo de estallido. Esta capacidad de respuesta a la actividad eléctrica, combinada con la independencia del potencial de membrana, dota a la bomba I de propiedades dinámicas que no son comunes a las corrientes basadas en canales (por ejemplo, canales de voltaje o transmisores o fugas). Además, en muchas neuronas, la actividad de la bomba es modulada por una variedad de moduladores, ampliando aún más el papel potencial de la bomba I en la actividad de estallido rítmico. Este artículo muestra cómo utilizar una combinación de modelado y métodos de pinza dinámica para determinar cómo bombeo y su interacción con la corriente persistente de Na+ influyen en la actividad rítmica en una GPC. Específicamente, este artículo se centrará en un protocolo de pinza dinámica y métodos de modelado computacional en interneuronas cardíacas de sanguijuelas medicinales.

El modelado con la adición de la bombaI4 acercó los hallazgos experimentales presentados en la sección de introducción y comenzó a explicar el mecanismo de estallido asistido por bomba. El modelo en tiempo real que se muestra aquí se ha ajustado (y se <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> han elegido los parámetros) para que produzca una actividad rítmica regular que caiga dentro de los límites de la actividad normal como se observa en los experimentos - f, IBI, BD, T - y continúa produciendo dicha actividad cuando los parámetros modulados por miomodulina <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (la corriente de bomba máxima) y <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (la conductancia máxima de la corriente h) son variados o covariados en el modelo. Los valores de parámetros determinados se pueden utilizar como punto de referencia o conjunto canónico para experimentos de modelado. En estos casos de modelo, la bomba oscila a lo largo del ciclo de ráfaga como [Na+]i alrededor de un nivel de referencia. Labomba I contribuye a la terminación de la ráfaga durante la fase de ruptura, y la hiperpolarización que produce activa la I h durante el IBI; observe el nivel máximo de Ih cerca de la iniciación de ráfaga(Figura 2).
Aunque el modelo HN en tiempo real ha implementado todas las corrientes2,4 disponibles para la sujeción dinámica, el enfoque aquí estaba en y , que están disponibles para cambios mientras el modelo se ejecuta en la GUI de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> abrazadera dinámica(Figura 3). La abrazadera dinámica permite al experimentador agregar (o restar con un negativo <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> o <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> ) cualquier conductancia o corriente en una neurona artificialmente que imita el voltaje y la dependencia iónica de una conductancia o corriente real. Por lo tanto, es posible explorar completamente cómo una conductancia / corriente particular interactúa con las conductancias / corrientes endógenas dentro de las células (Figura 1). El modelo HN en tiempo real indica que la corriente persistente de Na+ (IP) en las neuronas HN contribuye con gran parte de la entrada de Na+ afectando fuertemente a [Na+]i (Figura 2) y por lo tanto, bombeo. Debido a que IP está activo a potenciales de membrana relativamente negativos, se opone a labomba I incluso durante el IBI.
Estas observaciones indican que es instructivo explorar las interacciones entre <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> y <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> en neuronas HN aisladas con pinza dinámica como se discutió anteriormente8,9,10. Estos experimentos (en curso) se realizan con registros de microelectrodos agudos en neuronas HN(7) aisladas sinápticamente (séptimo ganglio cortado del cordón nervioso). Hasta la fecha, estos experimentos muestran que el estallido robusto se restaura en las neuronas HN tonicamente activas (debido a la fuga introducida de penetración de microelectrodos) mediante la co-adición de IP y Ibomba con abrazadera dinámica(Figura 4). Esta es una observación importante que indica que hay un mecanismo de estallido disponible en estas neuronas (incluso cuando la fuga se ve comprometida) que resulta de la interacción de labomba I y la IP. Los resultados preliminares indican su fuerte interacción complicada, que puede ser explorada en el modelo y los experimentos (Figura 5).
En conclusión, bombeo en respuesta a aumentos periódicos en [Na+]i durante la actividad de estallido contribuye al ritmo de ráfaga a través de la terminación de ráfaga (disminución de BD). La interacción de la bomba IP e I constituye un mecanismo que es suficiente para soportar la actividad de estallido endógeno; este mecanismo puede restablecer el estallido robusto en las interneuronas HN registradas intracelularmente en el ganglio 7. La interacción entre IP y Ibombea a través de [Na+]i afecta el período de ráfaga HN de forma no monótona y garantiza la robustez de la ráfaga autónoma. Estas conclusiones están en línea con los experimentos y el modelado en sistemas de vertebrados11,12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> Figura 1: Actividad eléctrica interneurona del corazón de sanguijuela e implementación de la bomba I y la I P con pinza dinámica. (A) Actividad de estallido normal registrada simultáneamente, extracelularmente (arriba) e intracelularmente (abajo), en un latido de sanguijuela HCO de un tercer ganglio, un esquema de las neuronas registradas y sus conexiones sinápticas mutuamente inhibitorias a la derecha. (B) Esquema de pinza dinámica al registrar una interneurona HN(7) en un ganglio aislado 7; nótese que no hay interacción sináptica entre las dos interneuronas HN(7). (Ci) Estallido en una interneurona HN(7) comprometida por fugas. (Cii) Se puede producir una ráfaga más robusta agregando una bomba de pinza I dinámica ( <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 0.1 nA), que compensa la fuga inducida por microelectrodos, pero deprime la excitabilidad, y <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (1 nS), que aumenta la excitabilidad. Las líneas discontinuas negras indican los valores de referencia. Abreviaturas: HN = interneurona cardíaca; HCO = oscilador semicénrico; Bomba I = corriente hacia el exterior; IP = Na persistente+ corriente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na máximo+/K+ corriente de la bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductancia máxima de la corriente persistente de Na+; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentración interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> Figura 2: Modelo de interneurona HN único que muestra trazas para el potencial de membrana (Vm), I h, Ibomba,[Na+]ie IP. Las corrientes hiperpolarizantes externas son negativas, y las corrientes despolarizantes hacia adentro son positivas. Las líneas discontinuas negras indican los valores de referencia. Abreviaturas: HN = interneurona cardíaca; Bomba I = corriente hacia el exterior; IP = Na persistente+ corriente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na máximo+/K+ corriente de la bomba; Ih = corriente interna activada por hiperpolarización; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= conductancia máxima de la corriente persistente de Na+; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> = conductancia máxima de la corriente interna activada por hiperpolarización; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentración interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> Figura 3: Interfaz gráfica de usuario del modelo de interneurona cardíaca (HN) en tiempo real y abrazadera dinámica implementada en una placa de procesamiento de señal digital. Arriba a la izquierda: Los cuadros matemáticos rojos son cuadros de parámetros determinados por el usuario para el modelo en tiempo real, mientras que los cuadros Blue Live son cuadros de parámetros determinados por el usuario utilizados en la abrazadera dinámica. El = el potencial de inversión de la corriente de fuga; Gl = conductancia de fuga; Gh = conductancia máxima de corriente h; Gp = conductancia máxima de corriente P; GCaS = conductancia máxima de corriente de calcio lenta; PumpMax = corriente máxima de la bomba; [Conductancia sináptica máxima de GSyn2 a la neurona respectiva; Umbral de cruce de picos ThreshSyn2 para mediar un potencial sináptico: estos se utilizan para hacer un oscilador híbrido (vivo / modelo) de medio centro que no se ilustra aquí.]. Abajo a la izquierda para la abrazadera dinámica. A la izquierda hay 5 valores calculados de variables dinámicas de abrazadera: bomba I = corriente de bomba inyectada; Ih = h-corriente inyectada (no utilizada aquí); IP = corriente P inyectada; NaI = Na interno calculado+ concentración; ENa = potencial de reversión de sodio calculado. Abajo a la izquierda para la abrazadera dinámica. A la derecha de las variables calculadas hay 6 cuadros de parámetros determinados por el usuario: GNa = uso de conductancia máxima de sodio rápido endógeno supuesto para calcular Na+ flujo asociado con potenciales de acción; PumpMaxL = corriente máxima de la bomba que se inyectará mediante abrazadera dinámica; Naih ver ecuación (2); Gh = conductancia máxima para determinar la corriente h a inyectar por pinza dinámica; Gp = uso de conductancia máxima de corriente P endógena asumida para calcular el flujo de Na+ asociado con la corriente P endógena; GpinHNLive = conductancia máxima para determinar la corriente P a inyectar por pinza dinámica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> Figura 4: Análisis dinámico de la abrazadera de la explosión independiente de HN(7). La regulación ascendente <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> de (A) 4.0 nS a (B) 9.0 nS ralentiza el ritmo de ráfaga HN independiente. Los rastros experimentales muestran estallido rítmico en neuronaS HN(7) aisladas con pinza dinámica. Los rangos de oscilación de [Na+]i y Vm aumentan con la regulación al <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> alza. Trazas de arriba a abajo: Vm grabada, bombaIinyectada, calculada [Na+]i, e inyectada IP. Las líneas discontinuas negras indican los valores de referencia. Abreviaturas: HN = interneurona cardíaca; Bomba I = corriente hacia el exterior; IP = Na persistente+ corriente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na máximo+/K+ corriente de la bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductancia máxima de la corriente persistente de Na+; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentración interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> Figura 5: Análisis dinámico de abrazaderas de estallido independiente de HN(7). La regulación al alza de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> tiende a disminuir, seguida de un aumento del período de explosión de HN. En experimentos individuales (puntos conectados por líneas) utilizando abrazadera dinámica, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> los valores se barrieron mientras se <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> mantenían constantes. Los colores representan diferentes niveles constantes de acción <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> utilizados en diferentes experimentos. Abreviaturas: HN = interneurona cardíaca; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = Na máximo+/K+ corriente de la bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductancia máxima de la corriente persistente De Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un método para la investigación de los roles de la bomba Na+/ K+ y la corriente persistente de Na+ en interneuronas cardíacas de sanguijuela utilizando pinza dinámica.

Contribución de la bomba Na+/ K+ a la explosión rítmica, explorada con modelado y análisis dinámicos de abrazadera

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

El pinzamiento dinámico puede modificar o introducir cualquier corriente de membrana en una neurona. Introducimos y modificamos la bomba de sodio y potasio y la corriente de sodio persistente en una interneurona cardíaca viva de una sanguijuela. El uso de una lámpara dinámica permite un control completo con una pulsación de tecla de la dinámica y amplitud de cualquier corriente introducida en una neurona en tiempo real.El desarrollo de sistemas interactivos en tiempo real, como la abrazadera dinámica, sustenta toda la investigación del IMC. Todos los aspectos de los estudios celulares sobre la actividad eléctrica de las neuronas y las redes pueden beneficiarse potencialmente del uso de la pinza dinámica. Los principales retos de esta técnica son el desarrollo de los modelos en tiempo real en neurona y la calibración de los ajustes dinámicos de calambres a la neurona seleccionada para su estudio.Para el aislamiento del ganglio 7 de un cordón nervioso de sanguijuela, llene un plato de disección de línea de resina negra con aproximadamente un centímetro de solución salina refrigerada suplementada con cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, D-glucosa y HEPES en agua desionizada y fije un lado dorsal de sanguijuela anestesiado frío hacia arriba en la cámara. Use un microscopio estéreo con un aumento de 20X con iluminación de guía de luz oblicua y tijeras de resorte de cinco milímetros para hacer un corte longitudinal de al menos tres centímetros de largo a través de la pared del cuerpo en la tercera parte rostral del cuerpo. Use alfileres para separar el tejido de la pared del cuerpo para exponer los órganos internos y aspire la sangre para obtener una mejor vista.Aislar un ganglio individual de la mitad del cuerpo 7. Usando fórceps afilados número cinco para ayudar a guiar el corte y para sostener el seno, use las tijeras para abrir el seno en el que reside el cordón nervioso, teniendo cuidado de dividir el seno dorsal y ventralmente. Manteniendo el seno unido a cada una de las dos raíces nerviosas bilaterales que emergen del ganglio, corte los haces de nervios conectivos rostral y caudal para eliminar el ganglio del cuerpo y corte las raíces laterales a donde emergen del seno.Use fórceps viejos embotados número cinco para asegurar las tiras sinusales y el tejido suelto con alfileres de insecto Minutien acortados del lado ventral hacia arriba en placas de Petri forradas de resina transparente. Fije los conectivos rostrales y caudales lo más lejos posible del ganglio y fije las raíces de forma segura. Aumente la ampliación del microscopio estereoscópico a 40X o más y ajuste la iluminación oblicua de modo que los cuerpos celulares neuronales se puedan observar fácilmente en el lado ventral del ganglio justo debajo del perineurio.Usando micro tijeras, comience a cortar la funda peroneo suelta entre las raíces en un lado del ganglio, continuando el corte lateralmente hacia el otro lado y asegurándose de mantener la hoja de tijera superficial sin dañar los cuerpos celulares neuronales directamente debajo de la funda. Haga un corte superficial similar caudalmente desde el corte lateral a lo largo de la línea media y use fórceps finos número cinco para alejar un colgajo lateral caudal de la vaina del ganglio a la vez para permitir que cada uno sea extirpado. Cuando se han extraído ambos colgajos, ambas interneuronas cardíacas deben exponerse.Coloque el plato en la configuración de grabación y superfuse la muestra con solución salina a un caudal de cinco mililitros por minuto a temperatura ambiente. Para identificar las interneuronas en la configuración de grabación, seleccione un aumento de 50 a 100X con iluminación de campo oscuro debajo y ubique una neurona HN 7 del par bilateral por su ubicación canónica en la posición posteriolateral en el ganglio de cuerpo medio 7. A continuación, use un micro manipulador para colocar un microelectrodo afilado lleno de acetato de potasio molar y microelectrodo de cloruro de potasio milimolar de 20 muy cerca del cuerpo celular objetivo y use un electrómetro neurofisiológico para observar continuamente el potencial registrado.Ajuste este potencial a cero milivoltios y penetre en la neurona con el microelectrodo utilizando el manipulador para conducir lentamente el electrodo a lo largo de su eje largo. Utilice una función de zumbido de electrometro de 100 milisegundos hasta que se observe un cambio negativo en el potencial de membrana y una actividad de aumento vigorosa. Ajuste el electrómetro a al menos tres kilohercios en modo de abrazadera de corriente discontinua para registrar simultáneamente el potencial de membrana mientras pasa la corriente a la neurona.Use un osciloscopio para monitorear el ajuste del electrodo y use un inyector de corriente constante para inyectar una corriente constante de menos 0.1 nanoampes durante uno o dos minutos para estabilizar la grabación. La neurona HN 7 se puede identificar por su característica forma de espiga y su débil actividad de estallido. Para la conductancia dinámica de la abrazadera y la implementación actual, abra un programa de software de abrazadera dinámica personalizado para la placa de procesamiento de señal digital.Y mientras el modelo está funcionando, establezca la corriente máxima de la bomba en 0.1 a 0.2 nanoamps y aumente gradualmente la conductancia máxima de la corriente de sodio persistente hasta que se produzca un estallido regular. Co-variar sistemáticamente estas corrientes en incrementos de 0,1 nanoamp para la salida máxima de la corriente de la bomba e incrementos de un nanosiemens para la máxima conductancia de la corriente de sodio persistente y evaluar los efectos de estos aumentos en la frecuencia de pico, el intervalo entre ráfagas, la duración de la ráfaga y el período de ráfaga. Mantenga la conductancia máxima de la corriente de sodio en un valor fijo específico y barre en incrementos de un nanoamp sobre un rango de corrientes máximas de la bomba para apoyar la actividad de estallido regular antes de aumentar el valor fijo de la conductancia de sodio en un nanosiemens y barrer sobre un segundo rango de corrientes de bomba máximas.Para cada par de parámetros implementado, recopile datos que contengan al menos ocho ráfagas para que se puedan realizar mediciones promedio confiables de la frecuencia de pico, el intervalo entre ráfagas, la duración de la ráfaga y el período de ráfaga. Luego recopile datos de varias neuronas adicionales como se acaba de demostrar para generar un gráfico compuesto. Usando este modelo, la corriente de la bomba hacia afuera oscila a lo largo del ciclo de ruptura como la concentración interna de sodio alrededor de un nivel basal.Esta corriente de la bomba contribuye a la terminación de la ráfaga durante la fase de ruptura. La hiperpolarización producida por la corriente de la bomba activa la hiperpolarización activada por la corriente interna durante el intervalo entre ráfagas. El modelo de interneuronas cardíacas en tiempo real indica que la corriente de sodio persistente en las interneuronas cardíacas contribuye a gran parte de la entrada de sodio que afecta fuertemente la concentración interna del sodio y, por lo tanto, la corriente de la bomba.Debido a que la corriente de sodio persistente está activa a potenciales de membrana relativamente negativos, se opone a la corriente de la bomba durante los intervalos de ráfaga e interventa. Como se ilustra, el estallido robusto se restaura en las interneuronas cardíacas tonicamente activas mediante la coadición de corrientes persistentes de bomba de sodio y potasio de sodio con una abrazadera dinámica. Los resultados preliminares indican una fuerte interacción complicada entre las dos corrientes, que se puede explorar más a fondo utilizando el modelo.Un experimento exitoso depende de la buena desvainación del ganglio y de la conducción, penetración y zumbido cuidadosamente dirigidos del microelectrodo. Aumentamos la abrazadera dinámica mediante la implementación de una corriente de bomba dependiente de sodio que se calcula estimando la concentración intracelular de un ion. Tales estimaciones se pueden utilizar para inyectar cualquier corriente dependiente de iones en una neurona.

contribution-na-k-pump-to-rhythmic-bursting-explored-with-modeling

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Exacta cuantificación, basada en la causalidad de la función diastólica global ha sido alcanzado por el análisis basado en la modelización cinemática de flujo transmitral a través de la parametrizada llenado diastólico (PDF) formalismo. PDF genera rigidez, la relajación, y los parámetros de carga única y aclara "nuevo" fisiología mientras que proporciona índices de sensibilidad y especificidad de la disfunción.

La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

La voltamperometría cíclica de exploración rápida puede monitorizar la neurotransmisión in vivo de dopamina en el contexto de fármacos, enfermedades y otras manipulaciones experimentales. Este trabajo describe la implementación de QNsim1.0, un software para modelar las respuestas de dopamina eléctricamente estimuladas de acuerdo con el modelo neurobiológico cuantitativo para cuantificar las estimaciones de liberación de dopamina y la dinámica de recaptura.

Modelado de datos de voltametría cíclica de exploración rápida de datos de neurotransmisión de dopamina estimulada eléctricamente usando QNsim1.0

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca2 + reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Se propone una técnica rápida y fiable para controlar las oscilaciones de forma de una sola burbuja acústica atrapada que se basa en la técnica de coalescencia entre dos burbujas. Las oscilaciones en forma de burbuja controladas por simetría y estado estacionario permiten analizar el flujo de fluido generado en las proximidades de la interfaz de burbuja.

Inducción de microstreaming por oscilaciones de burbujas no esféricas en un sistema de levitación acústica

La relajación miocárdica y cardíaca rápida es esencial para la fisiología normal. Ahora se sabe que los mecanismos de relajación mecánica dependen de la velocidad de deformación. Este protocolo proporciona una visión general de la adquisición y el análisis de experimentos para estudiar más a fondo el control mecánico de la relajación.

Control mecánico de la relajación con trabéculas cardíacas intactas

El dispositivo de succión no nutritiva (NNS, por sus siglas en inglés) puede recopilar y cuantificar fácilmente las características de NNS utilizando un chupete conectado a un transductor de presión y registrado a través de un sistema de adquisición de datos y una computadora portátil. La cuantificación de los parámetros NNS puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo neurológico actual y futuro de un niño.

Mediciones de parámetros de succión no nutritivos mediante un sistema de transductor de presión personalizado

Este protocolo presenta una caja de comportamiento basada en un microcontrolador para evaluar la inhibición de prepulso (PPI) mediante la recopilación de datos de aceleración de un sensor debajo de la caja. Estos datos evalúan los déficits de activación sensorial en ratas socialmente aisladas, con un método adicional para sincronizar los datos con la actividad neuronal para avanzar en los estudios de neurofisiología sobre los trastornos del comportamiento.

Desarrollo de una caja conductual para evaluar la inhibición previa al pulso y la actividad neuronal en modelos animales psiquiátricos

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Explore la contribución de la bomba Na+/K+ a la explosión rítmica en interneuronas cardíacas de sanguijuela mediante técnicas de abrazadera dinámica. Este método permite controlar corrientes iónicas en tiempo real para estudiar la excitabilidad neuronal.

Contribución de la bomba Na⁺/ K⁺ a la explosión rítmica, explorada con modelado y análisis dinámicos de abrazadera

Explorar más videos