Name: Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a cultivar blastocistos humanos vitrificados durante la ventana de implantación para estudiar la diferenciación de trofoblastos. Este método permite analizar células individuales y comprender los mecanismos de la implantación temprana.

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Nos gustaría reconocer a los muchos pacientes del Centro de Medicina Reproductiva de Colorado (CCRM) que han donado amablemente sus embriones para la investigación. También queremos agradecer a Karen Maruniak y al laboratorio clínico de CCRM por su ayuda en el procesamiento de muestras de hCG, así como a Sue McCormick y su equipo clínico de embriología de FIV en CCRM por su ayuda con la recolección, almacenamiento, seguimiento y donación de embriones. La financiación fue proporcionada internamente por el CCRM.

Todos los embriones humanos han sido donados con consentimiento para su uso en la investigación. Los protocolos para el cultivo prolongado de embriones humanos han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional Occidental (estudio n.o 1179872) y siguen las directrices internacionales. Cualquier uso de embriones humanos debe ser revisado por los órganos de ética y de gobierno apropiados asociados con la institución de investigación que utilice este protocolo.
1. Preparación
<ol><li>Preparar los medios y las placas de recuperación un día antes del calentamiento del embrión en una campana de flujo laminar estéril.<ol>
<li>Preparar 2 ml de medios de cultivo de blastocisto (BM) con 10% v/v sustituto de proteína sérica (SPS). NOTA: Los medios de cultivo de Blastocyst pueden o no contener proteínas añadidas. Aquí, utilizamos un medio que debe complementarse con el 10% de la proteína de albúmina indicada. Consulte la guía del fabricante para la variación en esta suplementación. Todos los medios deben filtrarse utilizando un filtro estéril de 0,22 m unido a una jeringa estéril antes del equilibrio.</li>
		<li>Llene dos platos de lavado de cultivo de órganos de pozo central con 500 l de BM con 10% v/v SPS cubierto con 500 l de aceite de grado de cultivo embrionario.</li>
		<li>En un plato de cultivo de tejido de 60 mm, capa 8 mL de aceite de cultivo embrionario y luego anclaje 20 gotas de BM con 10% v/v SPS en la parte inferior de la placa de cultivo. Haga 1 gota por cada embrión calentado. NOTA: Se pueden hacer más medios, gotas y platos de lavado según sea necesario. También se pueden añadir gotas al plato antes de que el aceite esté en capas. Las gotas de anclaje debajo del aceite ayudarán a reducir la evaporación y cualquier cambio posterior en la osmolalidad.</li>
		<li>Equilibre BM con 10% v/v platos de lavado SPS y placa de recuperación en una incubadora a 37oC, 6% CO2, 5% O2 durante al menos 4 h.</li>
		<li>Descongelar un vial del primer paso de medios de cultivo extendidos (IVC1) en 4 oC o en la parte superior del banco.</li>
		<li>Prepare un plato de lavado de 500 l de IVC1 sin recubrimiento de aceite. Aliquot aproximadamente 4 ml de IVC1 en un tubo de tapa de presión de 5 ml.</li>
		<li>Plato de lavado Equilibrado IVC1 y pequeño tubo de tapa de presión de IVC1 en 37oC, 6% CO2 y atmosférico O2 durante al menos 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar placas de cultivo extendidas un día antes del calentamiento del embrión en una campana de flujo laminar estéril.<ol>
<li>Diluir la fibronectina del suero humano en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 30 g/ml. Se necesitarán 250 l de fibronectina de 30 g/ml por embrión para recubrir las cámaras.</li>
		<li>Abra el paquete de cubreobjetos de 8 bien acaneados debajo del capó mientras tiene cuidado de no tocar los pozos. Pipetear suavemente 250 l de fibronectina de 30 g/ml en cada pocópido.</li>
		<li>Vuelva a colocar la tapa en el cubreobjetos con cámara y colóquela a 4oC durante 20-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una placa de cultivo extendida en la mañana del calentamiento embrionario.<ol>
<li>Recupere el cubreobjetos con fibronectina y colóquelo en la campana de flujo laminar. Retire la mezcla de fibronectina con una pipeta de 1 ml y deseche en el contenedor de residuos.</li>
		<li>Recupere medios IVC1 calentados y equilibrados de un pequeño tubo de tapa de presión de 5 ml.</li>
		<li>Pipetear 300 l de IVC1 equilibrado en cada pocól. Tenga cuidado de no dejar que ningún líquido toque la tapa, ya que esto aumentará el riesgo de contaminación.</li>
		<li>Devolver el cubreobjetos con cámara con IVC1 para incubar en 37oC, 6% CO2 y atmosférico O2 hasta la eliminación de la zona pellucida en el paso 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Calentamiento de embriones humanos D5 vitrificados
NOTA: Otros fabricantes pueden tener protocolos ligeramente diferentes de acuerdo con su propia tecnología de vitrificación. Consulte las instrucciones de uso del fabricante cuando corresponda.
<ol><li>Caliente 3,0 ml de solución de descongelación (TS) en un plato de 35 mm a 37oC. Llevar 300 l de solución de dilución (DS) y dos pocillos de 300 l de solución de lavado (WS) en una placa de 6 pozos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con fórceps, retire cuidadosamente el manguito del dispositivo crio mientras se asegura de que el embrión vitrificificado permanezca siempre bajo nitrógeno líquido.</li>
	<li>Mueva rápidamente el dispositivo criollado de nitrógeno líquido y sumerja la punta del dispositivo crio en TS a 37 oC. Ajuste un temporizador durante 1 min y mantenga el dispositivo crio sumergido hasta que el embrión se desprenda en el TS. NOTA: Embriones calientes de uno en uno para realizar un seguimiento de las identidades de los embriones, ya que pueden relacionarse con la información demográfica del paciente en el análisis posterior.</li>
	<li>Durante la incubación de 1 min en TS, retire cuidadosamente el crio dispositivo y levante suavemente el embrión y muévase al lado opuesto de la placa TS. NOTA: Si se cultivan varios embriones, sea diligente en mantener los embriones separados para garantizar que se mantengan las identidades adecuadas.</li>
	<li>Después de 1 min, recoja suavemente el embrión con una pequeña cantidad de TS, aproximadamente 2 l. Mueva el embrión a la parte inferior del pozo DS de 300 l mientras cubre el embrión en una capa delgada de TS de la pipeta. Ajuste un temporizador durante 3 minutos y coloque la placa de 6 pozos en la parte superior del banco a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 3 min, recoja el embrión con una pequeña cantidad de DS, aproximadamente 2 oL, y mueva el embrión al fondo del siguiente pozo que contiene 300 l de WS. Una vez más, coloque suavemente una pequeña cantidad de DS de la pipeta sobre el embrión. Ajuste un temporizador durante 5 minutos y vuelva a la mesa de trabajo.</li>
	<li>Después de 5 min, recoja el embrión con un volumen mínimo de WS y muévase a la parte superior del pozo final de 300 l WS. El embrión caerá lentamente y se lavará a través del WS hasta el fondo. Expulse cualquier WS retenido de la pipeta a un pozo vacío.</li>
	<li>Recoger el embrión con un volumen mínimo y volver a la parte superior del mismo pozo de 300 l de WS. El embrión volverá a caer al fondo del pozo. Ajuste un temporizador durante 1 min y devuelva la placa de 6 pozos a la parte superior del banco.</li>
</ol>3. Recuperación de embriones calentados
<ol><li>Uno a la vez, mueva los embriones calentados a un plato de tejido de órganos de pozo central que contenga 500 l de BM equilibrado con 10% v/v SPS por debajo de 500 l de aceite de grado de cultivo de embriones equilibrado.</li>
	<li>Lave los embriones recogiendo cada embrión y moviéndolos a varias áreas del plato mientras sopla los medios antiguos entre movimientos. Recoger el embrión y moverlo a una caída de cultivo individual de 20 l de BM equilibrado con 10% v/v SPS bajo aceite.</li>
	<li>Deje que los embriones calentados se recuperen durante 2 h en una incubadora a 37oC, 6% CO2, 5% O2.
</li>
</ol>4. Eliminación de zonas
<ol><li>Después de una recuperación de 2 horas, evalúe los embriones para su re-expansión y tome fotografías de cada embrión.</li>
	<li>Mueva los embriones individualmente en 500 ml de un medio de manipulación con ácido proponámico (MOPS) de 3-(N-morpholino) con un medio de manipulación con búfer de ácido (MOPS) con un 5% (v/v) de suero de ternero fetal (FCS) antes del tratamiento con la solución ácida de Tyrode.</li>
	<li>Mueva un embrión rápidamente a través de 300 ml de solución de Tyrode ácido caliente mientras observa activamente a través del microscopio. La zona pellucida comenzará a disolverse visualmente. Esto tomará aproximadamente 5 s.</li>
	<li>Mueva inmediatamente el embrión con zona de disolución a 300 l de medio amortiguado MOPS calentado para apagar la solución del ácido Tyrode.</li>
	<li>Mueva el embrión con un volumen mínimo de medio tamponado MOPS en una placa de tejido de órganos de pozo central que contenga 500 ml de BM equilibrado con 10% v/v SPS por debajo de 500 l de aceite de grado de cultivo embrionario equilibrado para lavar.</li>
	<li>Devuelva el embrión a la caída de recuperación de 20 l del paso 3.2. NOTA: Tras el examen visual después de la eliminación de la zona, los embriones con zona pellucida retenida pueden ser tratados con la solución ácida de Tyrode si es necesario, repitiendo los pasos 4.2-4.6. Se desea minimizar la exposición a la solución de Tyrode.</li>
</ol>5. Blastocyst cultivo extendido
<ol><li>Mueva los embriones individualmente al plato de lavado con medios IVC1 equilibrados del paso 1.1.6. Mueva cuidadosamente un embrión a un pozo del cubreobjetos con cámara con IVC1 equilibrado y mantenga la identificación de embriones. NOTA: Este paso debe terminarse lo más rápido posible para minimizar la evaporación media.</li>
	<li>Volver encuesado cubreobjetos a una incubadora ajustada a 37oC, 6% CO2, O2 atmosférico durante 2 días. NOTA: Asegúrese de descongelar y equilibrar los medios en 37 oC, 6% CO2, O2 atmosférico para el intercambio de medios 4 h de antelación.</li>
	<li>En el crecimiento D2 (D7 post fertilización), examine cuidadosamente la unión de embriones bajo el microscopio y realice el intercambio de medios.<ol>
<li>Tenga en cuenta qué embrión se une al plato antes de intercambiar medios. Toque suavemente la placa y examine si un embrión se ha unido firmemente a la placa bajo el microscopio.</li>
		<li>Retire la tapa y retire cuidadosamente 150 ml de IVC1 y deseche mientras no moleste el embrión conectado. Si un embrión aún no se ha unido a la placa, no cambie el medio, ya que el suero de IVC1 ayudará en la fijación de embriones.</li>
		<li>Pipetear 150 l de medios de cultivo extendidos equilibrados, IVC2, lentamente en cada pocópta y devolver la tapa al cubreobjetos con cámara. NOTA: Asegúrese de que la extracción de la tapa del cubreobjetos con cámara se minimice para evitar la evaporación media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Devuelva cuidadosamente el cubreobjetos con cámara a la incubadora sin salpicar ningún medio en la tapa. Repita el intercambio de medios y la verificación de fijación todos los días del cultivo extendido hasta que los embriones estén listos para la fijación o la digestión de una sola célula.</li>
</ol>6. Colección opcional de medios gastados
<ol><li>Opcionalmente, recopile los medios gastados durante el intercambio de medios de cultivo después de D7 o cualquier día posterior. Durante el paso 5.3.2, en lugar de descartar el a presión medio, congelar los 150 ml de IVC1 eliminado en un tubo estéril de 0,5 ml de unión baja para su análisis futuro.</li>
</ol>7. Fijación opcional para inmunofluorescencia
<ol><li>Utilice una pipeta de 200 l para lavar embriones con 1/2 intercambios de medios de PBS durante 3x antes de la fijación para eliminar cualquier residula extracelular. Lavar el exceso de residuos y proteínas ayudará a optimizar la claridad y reducir el fondo en imágenes obtenidas con inmunofluorescencia.</li>
	<li>Retire todos los medios y agregue lentamente 200 l de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS al pozo. El embrión querrá adherirse a la superficie del fluido. Múltiples lavados de 150 l con 4% de PFA antes de extraer todo el líquido ayudará a minimizar cualquier daño al embrión.</li>
	<li>Incubar los embriones en 4% PFA durante 20 min para fijación.</li>
	<li>Lave los embriones 3x durante 10 minutos por lavado con 200 l de polisorbato 0,1% v/v 20 en PBS fresco.</li>
	<li>Almacene los embriones fijos en polisorbato de 0,1% v/v 20 en PBS a 4 oC antes de proceder con el protocolo de inmunofluorescencia.</li>
</ol>8. Digestión celular única con trippsina
NOTA: Los embriones frescos (no fijos) se utilizan para la digestión de una sola célula.
<ol><li>Lavar el embrión una vez con 200 ml de PBS y añadir 200 ml de solución de trippsina a cada pocero. Vuelva a colocar el cubreobjetos con cámara en la incubadora durante 5 min.</li>
	<li>Retire el cubreobjetos con cámara de la incubadora y examine los embriones bajo un estereoscopio. Las células de la periferia del embrión comenzarán a retraerse y MTB todavía debe estar unida a la placa donde se encuentran remotamente desde el embrión.</li>
	<li>Utilice una pipeta pequeña o una pipeta de boca finamente tirada para recoger MTB individual antes de romper todo el embrión. Vaya adelante al paso 9.1 para guardar MTB y volver al paso 8.4 después del paso 9.3.</li>
	<li>Utilice una pipeta de micromanipulación de mano o una pipeta de boca para disociar suavemente el embrión aspirando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Las células comenzarán a disociarse de todo el embrión. Continúe aspirando el embrión suavemente y repetidamente usando una punta de pipeta de menor diámetro o pipeta de boca hasta que el embrión haya sido incubado durante un total de 10 minutos en tripina.</li>
</ol>9. Selección de celda única y recolección de muestras
<ol><li>Con una tripina mínima, mueva las células disociadas a través de tres gotas de lavado de PBS de 20 l + 0,1% de polivinilpirrolidona (PVP) bajo aceite de cultivo embrionario con cuidado de no perder ninguna célula.</li>
	<li>Después de lavar las células, utilice una pipeta de vidrio finamente tirada para seleccionar una celda. Pipetee cuidadosamente la célula única en un tubo estéril de 0,2 ml de unión baja con un volumen mínimo de PBS+0,1% PVP.</li>
	<li>Enganche las células individuales en nitrógeno líquido (LN2)y guárdelos en -80 oC para su uso futuro.</li>
</ol>

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<li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El desarrollo del protocolo para el cultivo de embriones humanos a través de la implantación ha permitido a los científicos explorar un tiempo previamente desconocido en el desarrollo8,,9. Aquí, utilizamos un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos y estudiar la diferenciación temprana de trofobos antes de la formación de placenta villosa. Los métodos descritos aquí nos permiten recopilar diferentes sublineaciones de TB para su uso en el anál...

La implantación humana y la aparición de la placenta temprana son históricamente difíciles de investigar y permanecen en gran medida desconocidas porque los tejidos humanos son inaccesibles en esta etapa en la que el embarazo es clínicamente indetectable. Los modelos animales son inadecuados, ya que la placentación humana tiene sus propias características únicas en comparación con otros mamíferos euterianos. Por ejemplo, la placenta humana invade profundamente la decidua con algunas células trofoblastas que alcanzan al menos el tercio interno del miometrio uterino, mientras que otras células remodelan las arterias espirales uterinas. Incluso nuestros ancestros evolutivos más cercanos, los primates no humanos, muestran diferencias en la morfología placentaria y las interacciones trofoblastas con los tejidos deciduales maternos1,,2,,3. La obtención de embriones humanos preimplantacionales in vitro no fue posible hasta que en la década de 1980, cuando la fecundación in vitro humana clínica (FIV) comenzó como una práctica rutinaria para el tratamiento de la infertilidad4. Ahora, los blastocistos humanos se pueden cultivar in vitro para permitir la selección de embriones más viables para la transferencia, así como para permitir pruebas genéticas seguras. La mejora de las técnicas de cultivo de embriones, así como el uso cada vez mayor de la FIV ha producido muchos blastocistos excedentes que permanecen después de que se hayan completado los ciclos de tratamiento del paciente. Con el consentimiento del paciente, la aprobación del IRB, y con ciertas restricciones, estos blastocistos pueden ser utilizados para estudios de investigación. Se han convertido en un recurso invaluable que se utilizaron para la derivación de células madre embrionarias humanas5, la comprensión de la transición de la masa celular interna a las células madre embrionarias6,,7,y más recientemente, se han cultivado con éxito hasta el día (D) 13 para remodelar la implantación humana8,,9. Mediante la utilización de enfoques omics de células únicas desarrollados recientemente, el acceso a estos tejidos embrionarios humanos en etapas de implantación ha ofrecido oportunidades únicas para describir los mecanismos moleculares que regulan este proceso de diferenciación celular altamente dinámico, que antes eran imposibles de explorar10,,11,,12,,13.
Aquí, describimos los métodos utilizados en nuestra reciente publicación que caracteriza la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante la implantación humana12. Este protocolo incluye el calentamiento de blastocistos vitrificados, el cultivo de embriones extendido hasta D12 después de la FIV, la digestión enzimática del embrión en células individuales y la recolección celular para ensayos posteriores (Figura 1). Este sistema de cultivo extendido apoya el desarrollo embrionario humano en etapa periimplantacional sin aportes maternos y recapitula la diferenciación trofoblasta que parece coherente con las observaciones hechas de especímenes histológicos hace muchos años14,,15,,16,,17. Durante la implantación, la población de trofoblastos se compone de al menos dos tipos de células: el citotrofoblasto mononucleado similar a un progenitor (CTB) y el sintiotrofoboque multinucleado diferenciado terminalmente (STB). Tras la digestión de la trippsina, las CTB son células pequeñas y redondas que son morfológicamente indistinguibles de otros linajes celulares(Figura 2A,panel izquierdo). La separación de CTB de otros linajes celulares, como el epíblasto y el endodermo primitivo, se puede lograr mediante sus distintos perfiles transcriptómicos revelados por la secuenciación de ARN de una sola célula. Las células de sincitiotrofoblastos se pueden identificar fácilmente como estructuras de forma irregular que son significativamente más grandes que los otros tipos de células y se encuentran principalmente en la periferia del embrión (Figura 2A,panel medio; Figura 2B, panel izquierdo). Las células trofoblastas migratorias (MTB) son otro sublineaje trofoblasto encontrado durante el cultivo extendido embrionario y pueden reconocerse como aparentemente alejarse del cuerpo principal del embrión(Figura 2A,panel derecho, Figura 2B,panel derecho). El trofoblasto migratorio, aunque expresa muchos de los mismos marcadores que el trofoblasto villoso extra (EVT), no debe denominarse EVT, ya que las estructuras villosas de la placenta no han surgido en esta etapa muy temprana de desarrollo.
Experimentalmente, pudimos recoger pequeños CTB y STB grandes que son fácilmente distinguibles después de que los embriones se digieren en células individuales en D8, D10 y D12(Figura 2A,B). Los trofoblastos migratorios surgen en las etapas posteriores del cultivo embrionario prolongado y se pueden recoger en D12 antes de la digestión enzimática de todo el embrión (Figura 2A,B). Al separar fenotípicamente estos tres sublines trofoblastos antes del análisis de una sola célula, podemos identificar marcadores transcriptómicos específicos y definir el papel biológico de cada tipo de célula. Citotrofoblast son altamente proliferativos y actúan como células progenitoras en el suministro de los linajes diferenciados STB y MTB10,,11,12,,13. Syncytiotrophoblast está implicado en la producción de hormonas placentarias para mantener el embarazo y también puede ser responsable de los embriones que se entierran en el endometrio10,11,12,13. El trofoblasto migratorio tiene características aún más fuertes de un fenotipo invasor, migratorio y es probable que sea responsable de una colonización más profunda y extensa del endometrio uterino10,,11,,12,,13. Después de definir la firma transcriptómica de cada tipo de célula, los análisis de agrupación en clústeres también han revelado dos subconjuntos adicionales de células que eran morfológicamente indistinguibles de CTB y tenían transcriptomas con características de STB y MTB, respectivamente12. Es probable que estas células de estadio intermedio se dilecen de CTB a los sublineages MTB o STB y se habrían pasado por alto si los embriones se digieren ciegamente y las células estuvieran separadas por transcriptoma solo.
El protocolo descrito aquí utiliza un sistema de cultivo bidimensional (2D) y puede no ser óptimo para apoyar el desarrollo estructural tridimensional (3D), como sugiere una publicación reciente que describe un sistema de cultivo 3D recién desarrollado13. Sin embargo, en este sistema 2D la diferenciación del trofoblasto temprano parece ser consistente con las observaciones hechas de especímenes in vivo14,,15,,16,,17. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para su uso en el sistema de cultivo 3D13 recientemente descrito con cambios mínimos. Todos los pasos se llevan a cabo con una pipeta de micromanipulación de mano con puntas desechables disponibles comercialmente o una pipeta de boca de una pipeta de vidrio finamente tirada unida a tubos de goma, un filtro y una boquilla.

<table><tbody><tr><td>NORM JECT Luer Lock jeringa estéril</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Paquete de 100</td></tr><tr><td>3130 o 3110 Forma Serie II incubadora de CO2 con camisa de agua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Corning Primaria placa de cultivo de tejidos</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Caja de 500</td></tr><tr><td>tubos de 5 mL con tapón a presión</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Paquete de 25</td></tr><tr><td>pañuelos Corning Primaria de 60 mm plato de cultivo</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Caja de 200</td></tr><tr><td>platos de 6 pocillos</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Paquete de 1, 10 o 50</td></tr><tr><td>Solución de Ácido Tyrode</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro; Puntas de pipeta L</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Paquete de 960</td></tr><tr><td>Blast, medios de cultivo de blastocisto</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Solución de dilución</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato desechable Pasteur Pipets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5,75 pulg. (146 mm); 720/Cs</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de parafina para cultivo de embriones OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Tubos de PCR Eppendorf 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Paquete de 1.000</td></tr><tr><td>tubos de PCR Eppendorf 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Caja de 500</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano. Solución líquida al 1%</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 y micro; L Pipeman</td><td>Thermo Fisher Scientific F123602G</td><td></td><td>1 Pipetteman 2-20 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 y micro; L Pipeman</td><td>Thermo Fisher Scientific F123602G</td><td></td><td>1 Pipetteman 50-200 &micro; </td></tr><tr><td>L Medios de manipulación G-MOPS</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Medios de manipulación</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 cubreobjetos bien calibrados</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 portaobjetos por caja</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Sistemas de guiado de células</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5mL alícuotas</td></tr><tr><td>K System T47 Placa calefactora</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Filtros de jeringa estériles con membrana de PVFD Durapore</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>Pack de 50</td></tr><tr><td>Boquillas</td><td>Tienda FIV</td><td>MP-001-Y</td><td>100 piezas</td></tr><tr><td>Plato de pozo central Oosafe</td><td>Oosafe OOPW-CW05-1</td><td></td><td>Caja de 500</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Tubo de látex de goma para boquillas</td><td>Tienda de FIV</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 pies</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Puntas</td><td>Stripper Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro; m</td></tr><tr><td>Solución de descongelación</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>El Stripper Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific 12604013</td><td></td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>Frasco de 25 mL</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro; Puntas de pipeta en L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Paquete de 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 y micro; L puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Paquete de 960</td></tr><tr><td>solución de lavado</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

La implantación humana, la aposición y adhesión a la epitelia superficial uterina y la posterior invasión del blastocisto en la decidua materna, es un evento biológico crítico pero enigmático que ha sido históricamente difícil de estudiar debido a limitaciones técnicas y éticas. La implantación se inicia mediante el desarrollo del trofctodermo al trofoblasto temprano y la posterior diferenciación en sublineaciones de trofoblastos distintos. La diferenciación aberrante temprana de trofoboblastos puede conducir a insuficiencia de implantación, patologías placentarias, anomalías fetales y aborto espontáneo. Recientemente, se han desarrollado métodos para permitir que los embriones humanos crezcan hasta el día 13 después de la fertilización in vitro en ausencia de tejidos maternos, un período de tiempo que abarca el período de implantación en humanos. Esto ha dado a los investigadores la oportunidad de investigar la implantación humana y recapitular la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante este período crítico sin confundir las influencias maternas y evitando obstáculos inherentes para estudiar los primeros eventos de diferenciación embrionaria in vivo. Para caracterizar diferentes sublines de trofoblastos durante la implantación, hemos adoptado métodos de cultivo extendidos bidimensionales (2D) existentes y desarrollado un procedimiento para digerir y aislar enzimáticamente diferentes tipos de células trofoblastas para ensayos posteriores. Los embriones cultivados en condiciones 2D tienen una morfología relativamente aplanada y pueden ser subóptales en el modelado de arquitecturas embrionarias tridimensionales in vivo (3D). Sin embargo, la diferenciación de trofoblastos parece verse menos afectada como lo demuestran los cambios previstos en la morfología y la expresión génica a lo largo de la cultura extendida. Diferentes sublineages de trofoblastos, incluyendo citotroblasto, sincitiotrofobia y trofoblasto migratorio pueden separarse por tamaño, ubicación y emergencia temporal, y utilizarse para una mayor caracterización o experimentación. La investigación de estas células trofoblastas tempranas puede ser fundamental para comprender la implantación humana, tratar patologías placentarias comunes y mitigar la incidencia de pérdida del embarazo.

Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo extendido(Figura 2B). Los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse (Figura 2C). Según nuestra experiencia, aproximadamente el 75% de los embriones se unieron a la parte inferior del plato recubierto de fibronectina a 48 h y el accesorio aumentó a aproximadamente el 90% en 72 h en cultivo. El éxito de la unión de embriones puede verse afectado en...

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Muchos embarazos fracasan al principio del desarrollo embrionario humano alrededor de los siete u ocho después de la fertilización. Este protocolo ofrece oportunidades a los investigadores para hacer crecer los conceptores humanos in vitro durante esta misteriosa ventana de implantación. Esto nos permite comprender los mecanismos que sustentan el éxito de la implantación humana y la formación temprana de la placenta.El uso de un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos en estadio periimplantación in vitro es probablemente la única manera de obtener materiales auténticos para estudiar la implantación y la diferenciación temprana de trofoblastos. Esta técnica sencilla es una poderosa herramienta que nos permite responder a muchas preguntas fundamentales sobre el desarrollo temprano humano. Las investigaciones realizadas con el uso de este protocolo contribuirán en gran medida a la comprensión de la pérdida temprana del embarazo, el fracaso recurrente de la implantación y las patologías de la placenta.Demostrando el procedimiento estará Deirdre Logsdon, el estudiante de doctorado de un laboratorio. Un día antes del calentamiento del embrión, prepare los medios y las placas de recuperación en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos platos de lavado de cultivo de órganos de pozo central con 500 microlitros de BM con 10%SPS, luego cubrir el BM con 500 microlitros de aceite de grado de cultivo embrionario.En un plato de cultivo de tejido de 16 milímetros, capa ocho mililitros de aceite de cultivo embrionario y anclaje 20 microlitro gotas de BM con 10%SPS hasta la parte inferior. Equilibre los platos de lavado y la placa de recuperación en una incubadora a 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y 5% oxígeno durante al menos cuatro horas. Aliquot aproximadamente cuatro mililitros de IVC 1 en un tubo de tapa de presión de cinco mililitros y preparar un plato de lavado con 500 microlitros de IVC 1 sin recubrimiento de aceite.Equilibrar el plato y el tubo en la incubadora durante al menos cuatro horas. Diluir la fibronectina del suero humano en PBS a 30 microgramos por mililitro. Abra el paquete de cubreobjetos de ocho bien acobas teniendo cuidado de no tocar los pozos, luego pipetee suavemente 250 microlitros de la fibronectina en cada pozo.Vuelva a colocar la tapa en el cubreobjetos e incubarlo a cuatro grados centígrados durante 20 a 24 horas. Preparar la placa de cultivo extendida en la mañana del calentamiento del embrión. Recupere el resbalón de cubierta con cámara con fibronectina y colóquelo en la campana de flujo laminar.A continuación, retire la mezcla de fibronectina con una pipeta de un mililitro y deséchela. Pipetear 300 microlitros de la CIV 1 equilibrada en cada pozo y colocar el cubreobjetos en la incubadora hasta la eliminación de la zona pellucida. Después del calentamiento y la recuperación de los embriones humanos D5, evalúe su reaparión y tome fotografías de cada embrión.Mueva cada embrión a 500 microlitros de un medio de manipulación con búfer MOPS con 5%FCS. Luego trátalo con la solución ácida de Tyrode como se describe en el manuscrito de texto. Mueva inmediatamente el embrión con la zona de disolución en 300 microlitros de medio con búfer MOPS calentado para apagar la solución del Tyrode.A continuación, mueva el embrión a un plato de tejido de órgano de pozo central que contenga el BM equilibrado con 10%SPS bajo el aceite de grado de cultivo del embrión. A continuación, devuelva el embrión a la caída de recuperación de 20 microlitrotros. Mueva individualmente los embriones al plato de lavado con el medio IVC 1 equilibrado, luego mueva cuidadosamente cada embrión a un pozo del cubreobjetos con cámara, asegurándose de realizar un seguimiento de la identificación del embrión.Devuelva el cubreobjetos con cámara a una incubadora establecida en 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y oxígeno atmosférico durante dos días. En el día dos, examine cuidadosamente la fijación de los embriones bajo el microscopio e intercambie los medios. Sepa qué embrión está unido al plato tocando suavemente el plato.Para cambiar el medio, retire la tapa y aspire cuidadosamente 150 microlitros de IVC 1, teniendo cuidado de no molestar al embrión conectado. Si un embrión aún no se ha unido a la placa, no cambie el medio porque el suero de la CIV 1 ayudará a la fijación. Pipeta lentamente 150 microlitros de medios de cultivo extendidos equilibrados, IVC 2 en cada pozo y Reemplazar la tapa en el cubreobjetos.Devolvió cuidadosamente el cubreobjetos con cámara a la incubadora. Repita el intercambio de medios y la verificación de fijación todos los días hasta que los embriones estén listos para la fijación o la digestión de una sola célula. Si la recolección de medios gastados es necesaria para un análisis posterior, congele los 150 microlitros de IVC 1 eliminado en un tubo estéril de unión baja de 0,5 mililitros.Lave cada embrión una vez con 200 microlitros de PBS, luego agregue 200 microlitros de solución de trippsina a cada pozo. Vuelva a colocar el cubreobjetos con cámara en la incubadora durante cinco minutos. Utilice una pipeta pequeña o una pipeta de boca finamente tirada para recoger un MTB individual y luego utilice una pipeta más grande para disociar suavemente el embrión aspirando hacia arriba y hacia abajo.Continúe aspirando el embrión suavemente y repetidamente usando una punta de pipeta de menor diámetro hasta que el embrión haya sido incubado durante un total de 10 minutos en tripina. Para realizar la selección de una sola célula, mueva las células disociadas a través de 320 gotas de lavado de microlitros de PBS y 0.1%PVP bajo aceite de cultivo embrionario, teniendo cuidado de no perder ninguna célula. Después de lavar las células utilice una pipeta de vidrio finamente tirada para seleccionar una celda.Pipetee cuidadosamente la célula única en un tubo de unión bajo estéril de 0,2 mililitros con un volumen mínimo de PBS y PVP. Enganche las células individuales libres en nitrógeno líquido y guárdelas en 80 grados Celsius negativos para su uso posterior. Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo prolongado, mientras que los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse.En el día ocho después de la fertilización, la mayoría de las células en los embriones eran citotrofobia o CTB, que eran positivas para el marcador de trofoblasto GATA-3. En la periferia del embrión, los CTB ya estaban diferenciando en sindiscotiostiotrofoblastos multinólidos, que tenían una hoja como apariencia y teñido positivo para los seres humanos CGB. En el día 10, la formación de células de trofoblasto migratorios positivas de CGB estaba en un máximo, lo que fue confirmado por el aumento de la producción de HCG en este momento.Los trofoblastos migratorios que manchan positivos para el HLA-G, también comenzaron a emerger y migrar lejos del cuerpo embrionario. Para el día 12, la diferenciación de STB estaba en declive y la producción de MTB se hizo más prominente, lo que sugiere un cambio de énfasis de la producción de hormonas en el día 10 a la migración celular el día 12. Estos cambios se pueden observar en un vídeo de lapso de tiempo del período periimplantación.El video muestra el colapso del blastocele, la formación del STB, y la eventual diferenciación y migración de MTB. Lo más importante a tener en cuenta al completar este procedimiento es que está trabajando con embriones vivos que son sensibles a los cambios de temperatura, osmolalidad y pH. Minimizar la cantidad de tiempo que los platos están fuera de la incubadora es fundamental para mantener la salud embrionaria.Después de completar este procedimiento, los investigadores pueden utilizar células individuales aisladas para ensayos de omica de células individuales aguas abajo, como la secuenciación de ARN de células simples y la secuenciación de bisulfito del genoma completo para comprender mejor los cambios epigenéticos y transcriptómicos durante la implantación humana y la formación temprana de placenta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Las células gigantes trofoblásticas (TGC) desempeñan un papel clave en la placenta para garantizar un embarazo saludable. Presentamos un protocolo para evaluar el estado transcripcional de genes en TGCs mediante hibridación fluorescente naciente in situ en secciones de criostato de embriones post-implantación o cultivos a corto plazo de conos ectoplacentarios embrionarios de día 7.

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Este protocolo permite la purificación, caracterización y cultivo de trofoblastos extravillosos primarios de HLA-G+ (EVT) de la decidua basal y la membrana coriónica de placentas humanas a término. Los cultivos primarios de EVT mantienen la viabilidad durante 96 horas, permitiendo el cocultivo con células inmunitarias maternas emparejadas por muestras y el posterior análisis citométrico y molecular de flujo de sus interacciones.

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Aprende a cultivar blastocistos humanos vitrificados durante la ventana de implantación para estudiar la diferenciación de trofoblastos. Este método permite analizar células individuales y comprender los mecanismos de la implantación temprana.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

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