Name: Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a aplicar interferencia de ARN en escarabajos acuáticos Thermonectus marmoratus para estudiar función génica en etapas específicas del desarrollo. Este método permite el análisis de estructura y comportamiento.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Josh Benoit por su ayuda con la bioinformática Hailey Tobler por su ayuda en la crianza de Sunburst Diving Beetles y Tamara Pace para la ayuda editorial. Esta investigación fue apoyada por la National Science Foundation bajo las becas IOS-1456757 y IOS-1856341 a EKB y IOS1557936 a YT.

<ol><li>Muller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms+-+A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Model organisms - A historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Westerman, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aristaless+Controls+Butterfly+Wing+Color+Variation+Used+in+Mimicry+and+Mate+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice.</a> Current Biology. 28, 3469(2018).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+behind+the+three-way+stochastic+choices+that+expand+butterfly+colour+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision.</a> Nature. 535, 280(2016).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).</li>
<li>Meister, G., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+gene+silencing+by+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.</a> Nature. 431, 343-349 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Agrawal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+Biology%2C+mechanism%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA interference: Biology, mechanism, and applications.</a> Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657(2003).</li>
<li>Gu, L. Q., Knipple, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+RNA+interference+research+in+insects%3A+Implications+for+future+insect+pest+management+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies.</a> Crop Protection. 45, 36-40 (2013).</li>
<li>Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+developmental+analysis+of+Drosophila+and+Tribolium+reveals+conserved+and+diverged+roles+of+abrupt+in+insect+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution.</a> Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Co-options+of+Exoskeleton+Formation+during+Wing-to-Elytron+Evolution+in+Beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles.</a> Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29%3A+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>ZarinKamar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pax+gene+eyegone+facilitates+repression+of+eye+development+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium.</a> Evodevo. 2, 15(2011).</li>
<li>Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle%2C+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52059(2014).</li>
<li>Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+lens+for+a+complex+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">A complex lens for a complex eye.</a> Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).</li>
<li>Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeku%2C+O+%22RNA%2C+Methods+In+Molecular+Biology%22">RNA, Methods In Molecular Biology</a>. , Springer. 107-122 (2011).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Systemic+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+Affecting+the+Efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi.</a> Plos One. 7, (2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhilip%2C+BN+%22Molecular+Methods+for+Evolutionary+Genetics%22">Molecular Methods for Evolutionary Genetics</a>. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).</li>
<li>Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localisation+of+the+White%2FScarlet+ABC+transporter+to+pigment+granule+membranes+within+the+compound+eye+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster.</a> Genetica. 108, 239-252 (2000).</li>
<li>Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase+2+is+the+phenoloxidase+gene+required+for+beetle+cuticle+tanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).</li>
<li>Werner, S., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+step-wise+eye+growth+in+molting+diving+beetle+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).</li>
<li>Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+via+Embryonic+RNAi+in+Spider+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos.</a> Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).</li>
<li>Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+in+Crustaceans%3A+From+Basic+Research+to+Biotechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies.</a> Genes. 4, 620-645 (2013).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+KY+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).</li>
<li>Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+network+controlling+glial+development+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system.</a> Development. 142, 2184(2015).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+doublesex1+expression+in+Daphnia+pulex+Leydig%2C+1860+%28Cladocera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crustaceana%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera).</a> Crustaceana. 92, 137-154 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+shrimp+and+potential+applications+in+aquaculture%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture.</a> Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+KDB+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).</li>
<li>Crumiere, A. J. J., Khila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+genes+mediate+the+escalation+of+sexually+antagonistic+traits+in+water+striders%5BTitle%5D)+AND+%22Biology.+Letters%22%5BJournal%5D)">Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders.</a> Biology. Letters. 15, 5(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro objetivo es que esta recopilación de métodos haga que el ARNI esté ampliamente disponible, sobre todo porque esta herramienta sigue siendo una poderosa técnica sinérgica para la edición de genes basados en CRISPR/Cas9, con la ventaja de que se puede aplicar a las etapas de desarrollo deseadas de los organismos estudiados. Para ejemplificar esta fuerza, inyectamos dsRNA en embriones y en diferentes etapas larvales. Las inyecciones en óvulos afectaron al desarrollo de embriones (Figura 2), las inyecciones en la segunda etapa larvaria tuvieron efectos aparentes en la tercera etapa larval(Figura 4 y Figura 6),y las inyecciones en la tercera etapa larval mostraron efectos en los adultos (Figura 5). Mientras que el momento exacto tiene que establecerse experimentalmente, generalmente, las inyecciones surten efecto dentro de unos pocos días. El éxito de este proceso puede verse afectado por la longitud de la secuencia dsRNA. Aquí, presentamos ejemplos usando un poco más de 200 bp a más de 800 bp. Como regla general, las secuencias entre 100 y 600 bp se prefieren para limitar los efectos fuera del objetivo, pero las secuencias de hasta 1000 bp producen buenos resultados22. Una pregunta con respecto al ARNi es la duración del derribo que se puede lograr a través de esta técnica. Dado que los fenotipos eran terminales en cada etapa, no podemos comentar este tema sobre la base de nuestros resultados presentados. Sin embargo, anteriormente se ha observado que los efectos de arNI son generalmente relativamente de larga duración, y que las concentraciones más altas conducen a derribos más duraderos20.
Una limitación de esta técnica es que funciona mejor para algunos organismos que para otros, y parece que no hay una forma directa de predecir qué tan bien funcionará a priori. Sin embargo, se ha encontrado para trabajar bien para una amplia gama de diferentes organismos. Dentro de los artrópodos, esto incluye arácnidos26,crustáceos27,y una variedad de insectos, con tasas de éxito particularmente altas en escarabajos28. Otra complicación es que las diferencias en la gravedad del fenotipo a menudo ocurren entre individuos a pesar de la aplicación de la misma cantidad de ARD. Como se ilustra en la Figura 2B,la variación puede incluso ocurrir dentro de un individuo. En nuestros estudios de ARNi dirigidos a diferentes genes implicados en el desarrollo ocular larvario de T. marmoratus, con frecuencia hemos encontrado que algunos ojos se ven afectados más severamente que otros. Este fenómeno puede estar relacionado con el tejido relativamente denso del grupo ocular, con el dsRNA más capaz de llegar a algunas de las unidades.
Para la ejecución exitosa de experimentos de ARNi, es fundamental que varios parámetros estén optimizados para el gen objetivo. Por ejemplo, la concentración del ARS y la longitud del gen objetivo pueden influir fuertemente en el resultado20. Otro parámetro crítico es cómo se ejecutan las inyecciones, ya que este proceso puede influir en gran medida en la tasa de supervivencia. Para los embriones, logramos los mejores resultados apuntando al centro del embrión. Una placa bien colocada permite la inyección de 100 o más embriones en una sola sesión. Para las larvas, es fundamental insertar la aguja de inyección entre los segmentos. Estas inyecciones requieren más dsRNA, y en función de la disponibilidad de larvas, nuestros conjuntos de inyección aquí típicamente sólo consistía en unos pocos animales a la vez. Para todas las inyecciones, es fundamental evitar que el aire entre en el organismo.
En algunos casos, los bucles de retroalimentación de una red reguladora de genes y la redundancia genética pueden influir en la penetración de los fenotipos de ARNi, a pesar de los derribos constantes. Este parece ser el caso de nuestras observaciones conductuales de larvas con derribos de gran éxito de una proteína de lente prominente, Lens318. Aunque verificamos la alta eficiencia de estos derribos a través de qPCR, se observó una variación considerable en los fenotipos asociados. Este resultado pone de relieve la necesidad de cuantificar correctamente los derribos de ARNI (para obtener más información sobre las opciones, véase22). Si no hay una expectativa clara a priori con respecto a los fenotipos resultantes, una buena manera de controlar los efectos fuera de la diana del ARNi es apuntar al mismo gen con dos secuencias no superpuestas de dsRNA y evaluar los resultados de los fenotipos comunes.
A diferencia de las técnicas de edición de genes, el ARNi también es una poderosa herramienta para estudiar genes letales, y hay dos maneras de hacerlo. Por ejemplo, si uno está interesado en la contribución funcional de un gen donde se sabe que la pérdida de función al principio del desarrollo es letal, se puede lograr una investigación funcional de dicho gen simplemente permitiendo que el animal se desarrolle normalmente y luego derribando el gen a través de ARNi más adelante en el desarrollo (es decir, en el adulto). Alternativamente, un gen donde se sabe que la pérdida completa de la función es letal puede ser investigado a través de un derribo parcial, que se puede lograr mediante la inyección de un rango de concentraciones de dsRNA. Algunos de nuestros resultados muestran derribos de lac2,que se sabe que son letales si la cutícula en insectos se vuelve demasiado suave24. Incluso el escarabajo lac2 RNAi representado en la Figura 5 sería poco probable que sobreviviera fuera de las condiciones de laboratorio. Otro gen letal es el corte,que codifica para un factor de transcripción que es fundamental para la especificación del destino celular en varios sistemas de órganos en artrópodos y se ha relacionado con el desarrollo de glia en el sistema visual Drosophila 29. Basándonos en nuestra experiencia con el corte de ARNi en embriones de T. marmoratus, podemos evocar fenotipos oculares informativos en embriones que son capaces de completar su desarrollo ocular embrionario (observaciones inéditas). Aquí, dosis más altas parecen conducir a mayores tasas de letalidad, mientras que dosis más bajas resultan en fenotipos observables e informativos.
Nuestro protocolo no sólo enumera los pasos necesarios para que un investigador realice experimentos de ARNi en T. marmoratus,como se ilustra, sino que también es generalmente aplicable a otros organismos, especialmente los organismos acuáticos. Entre los organismos acuáticos, ya hay varios ejemplos dentro de los crustáceos como las pulgas de agua Daphnia30 y camarones (para una revisión reciente, véase la referencia31). Hay amplias oportunidades entre los insectos acuáticos, ya que se ha estimado que representan alrededor del 6% de toda la diversidad de insectos, con probablemente más de 200.000 especies32. Además, el ARNI ya se ha realizado en estibas de agua que tienden a habitar la superficie de los ambientes acuáticos33. Si no hay un genoma presente, entonces se puede ensamblar un transcriptoma de novo. Mientras este proceso revele contigs de unos pocos cientos de nucleótidos, se puede diseñar dsRNA contra genes específicos. Nuestro protocolo para inmovilizar insectos en la agarosa probablemente también será útil para otros procedimientos, especialmente para organismos blandos, maleables y acuáticos. En conjunto, el ARNi sigue siendo una técnica poderosa para manipular la expresión génica en un grupo diverso de organismos, incluso cuando no hay otras herramientas moleculares y genéticas disponibles.

La cuestión de cómo los genes específicos contribuyen a la evolución de diversos rasgos es un tema emocionante en biología. En las últimas décadas, se ha avanzado mucho en cuanto a la disección de los fundamentos genéticos de los procesos de desarrollo en unos pocos organismos modelo, como el nematodo Caenorhabditis elegans,la mosca de la fruta Drosophila melanogaster,y el ratón de la casa Mus musculus1. Más recientemente, la invención de potentes técnicas de edición genética, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente entrepacializadas (CRISPR)/Cas92, ha proporcionado la capacidad de cambiar el código genético de los organismos no modelo (porejemplo,véase3,4). Como resultado, ha habido un aumento en los estudios genéticos en una variedad de organismos que no habían sido abordados previamente a través de técnicas moleculares. Teniendo en cuenta la enorme diversidad de nuestro reino animal, con muchos rasgos interesantes o variaciones de rasgo que sólo se representan en especies específicas, este progreso lo ha convertido en un momento emocionante para el trabajo relacionado con la biología evo evo-desarrollo ("evo-devo"). Sin embargo, las técnicas de edición del genoma que están disponibles para los organismos no modelo están relativamente restringidas en lo que respecta a los puntos de tiempo de desarrollo a los que se pueden aplicar, lo que dificulta discernir las propiedades temporales relacionadas con el papel que desempeñan los genes específicos en cualquier rasgo. Además, las técnicas transgénicas a menudo se limitan a genes que no son esenciales para la supervivencia (es decir, cuyo nocaut no resulta en letalidad). Por lo tanto, si bien las técnicas de edición de genes han comenzado a ser populares, sigue siendo necesario contar con técnicas eficaces que sean aplicables a una variedad de organismos diferentes en puntos de tiempo de desarrollo específicos y faciliten derribos parciales (en lugar de una pérdida total de funciones). Aquí, llamamos la atención sobre la interferencia de ARN (ARNi), una técnica de derribo de genes5 algo anticuada pero potente que es particularmente valiosa como enfoque sinérgico para la edición de genes. En concreto, desarrollamos procedimientos que permiten la aplicación de ARNi a escarabajos de buceo acuático como ejemplo que ilustra la implementación de esta técnica, desde la adquisición de las secuencias moleculares necesarias hasta la inyección exitosa de ARN de doble cadena (dsRNA) en huevos y larvas.
El derribo genético basado en ARNi aprovecha un mecanismo de defensa innato de organismos, en el que las moléculas de dsRNA facilitan el silenciamiento de las secuencias de ácido nucleico invasoras, como virus y transposones6. En resumen, el dsRNA se toma en la célula, donde se corta en 20-25 trozos de nucleótidos por la enzima Dicer. Estas piezas activan la formación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que inhibe el ARNm objetivo mediante la unión a él en sitios específicos utilizando el hilo guía. Este proceso conduce en última instancia a la degradación del ARNm y por lo tanto interfiere con la traducción del ARNm en la proteína respectiva6. Por lo tanto, la técnica de derribo de genes basada en ARNi que se presenta aquí se basa en la inyección de dsRNA. Para los modelos animales, esta técnica fue desarrollada originalmente en C. elegans7 y D. melanogaster8, pero desde entonces ha surgido como una poderosa herramienta genética funcional en organismos no modelo9,,10. Debido a su naturaleza altamente eficaz en algunos insectos, RNAi incluso se puede aplicar en el manejo de plagas11.
Como herramienta de investigación, RNAi se ha utilizado para examinar cómo funcionan las vías clave de desarrollo molecular en modelos de insectos no tradicionales. Por ejemplo, el ARNi en el escarabajo de harina Tribolium castaneum ha sido fundamental para determinar cómo los genes profundamente conservados contribuyen a rasgos específicos en ese escarabajo, como se ejemplifica para el desarrollo de alas de forma específica12,13,14 y los ojos15,16. Las técnicas que subyacen a las manipulaciones en T. castaneum han sido bien descritas17 y dependen de la capacidad de inmovilizar huevos y larvas relativamente secos en una superficie pegajosa. Esta inmovilización, sin embargo, no es posible para las formas de desarrollo húmedo de organismos acuáticos como el Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Como es el caso de muchos organismos modelo no tradicional, carece de un genoma anotado. Para manipular la expresión génica en cualquier organismo sin un genoma, un primer paso razonable y rentable es generar transcriptomas e identificar las secuencias de nucleótidos putativos de los genes expresados de interés basados en la similitud de la secuencia con organismos modelo relacionados pero más establecidos, en este caso, principalmente genes Tribolium (Coleoptera) y Drosophila.
Aquí, para demostrar cómo el ARNi se puede utilizar en un organismo acuático, primero discutimos protocolos y software para la extracción de ARN y la generación y ensamblaje de transcriptomas, que permiten la identificación de secuencias genéticas específicas dirigidas. A continuación, resumimos los pasos necesarios para sintetizar dsRNA específico del gen. Posteriormente, ilustramos cómo se pueden inyectar los óvulos en un entorno acuático y demostramos los protocolos de incubación para el cultivo de embriones en desarrollo. Además, mostramos cómo el gel de agarosa se puede utilizar para inmovilizar completamente las larvas durante el proceso de inyección, una técnica que es generalmente útil durante varios procedimientos y podría aplicarse a una variedad de artrópodos. Para demostrar cómo se puede aplicar el ARNi a diferentes etapas del desarrollo, incluimos un ejemplo en el que silenciamos el gen de pigmentación ocular blanco en embriones. Además, describimos un ejemplo en el que el gen bronceado laccase2(lac2) fue silenciado durante la segunda estrella larval (para afectar a las larvas de la tercera estrella larval) y la tercera estrella larval (para afectar a los adultos). Finalmente, demostramos que la inyección de una menor concentración de dsRNA conduce a un derribo parcial, lo que demuestra que esta técnica también se puede aplicar a genes donde se sabe que la pérdida de función es letal.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Aislamiento de ARN y ensamblaje de novo del transcriptoma</nitrógeno líquido fuerte</td> Almacén > la Universidad Por lo general, disponible localmente en instituciones de investigación Fisher Scientific depende del tamaño Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien Mini kit de tejido lipídico RNeasy (kit de aislamiento de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>ARN)Qiagen 74804 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Se proporciona un protocolo específico detallado con el kit</td></tr><tr><td>de espectrofotómetro (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>1.2. De novo transcriptome assembly.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUSCO.v3</td><td>https://busco.ezlab.org/</td><td></td> <td>Se puede utilizar cualquier software disponible gratuitamente para evaluar la integridad del transcriptoma.</td></tr><tr><td>CLC Genomics</td><td>workbench Qiagen</td><td>832021</td><td>También están disponibles otros paquetes de software equivalentes</td></tr><tr><td>Galaxy workbench</td><td>https://usegalaxy.org/</td><td></td> <td>Un proceso de anotación y ensamblaje de transcriptomas en línea de código abierto</td></tr><tr><td>NCBI BLASTx</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx</td><td></td><td>Un canal</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de alineación y anotación en línea de código abierto<tr><td>2. Síntesis de ADNc, Clonación & Aislamiento Miniprep</</td>sal sódica ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td> fuerte <td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de</td></tr><tr><td>bien glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Kit Omniscript RT (transcripción inversa)</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>El protocolo específico detallado se proporciona con el kit</td></tr><tr><td>One Shot&trade; TOP10 E. coli químicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>El protocolo específico detallado se proporciona con el kit</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>FB0875713 Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien Kit de</td></tr><tr><td>minipreparación de plásmido rápido PureLink</td><td>ThermoFischer</td><td>771471</td><td>El protocolo específico detallado se proporciona con el kit</td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>El kit</td></tr><tr><td>agitador-incubador</td><td>Labnet</td><td>211DS</td> proporciona un protocolo específico detallado Otros <td>modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>espectrofotómetro (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Otros modelos funcionarían igual</td></tr><tr><td>de bien termociclador para PCR</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>TOPO TA Kit de clonación</td><td>Invitrogen</td><td>1845069</td> Se <td>proporciona un protocolo específico detallado con el kit</td></tr><tr><td>X-Gal Solution</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0941</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igualmente bien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2.2 Amplificación de PCR y síntesis de dsRNA in vitro</centrífuga fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien:</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>FastTaq DNA Polymerase, dNTPack</td><td>Roche</td><td>13873432</td><td>Este kit contiene todos los reactivos necesarios para una PCR</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de limpieza de Transcriiption</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1908</td><td>Con el kit</td></tr> <tr><td>se proporciona un protocolo específico detalladoMEGAscript T7 Kit de transcripción</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1334</td><td>El protocolo específico detallado se proporciona con el kit</td></tr><tr><td>de agua sin nucleasas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>El protocolo específico detallado se proporciona con el kit de</td></tr><tr><td>acetato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>Haga que la solución de trabajo de 3M</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>3. Recolección y preparación de embriones de T. marmoratus en etapa temprana para inyecciones de dsRNA</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td> fuerte <td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>con agua destilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>9180</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>con pinzas (Dumon #4 Biología)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Plato de cavidad de vidrio (3 platos de pocillos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-243-43</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Mesa giratoria</td><td>Welbilt</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Pincel de pelo natural</td><td>Amazon</td><td></td><td>Cualquier pincel fino servirá</td></tr><tr><td>Micropipeteo P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>FB0875713 Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Microscopo Central</td><td></td><td>10446293 Cualquier buen microscopio estereoscópico funcionará</td></tr><tr><td>pipetas de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-200-109</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>4. Microinyecciones de dsRNA en embriones de T. marmoratus en etapa temprana</cámara digital fuerte></td> Edmund optics (Qimaging)Retiga 2000R Otros modelos funcionarían igual de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>bien</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>colorante alimentario</td><td>Kroger</td><td></td><td>Cualquier colorante alimentario disponible debería Trabajar en</td></tr><tr><td>la cámara</td><td></td><td></td> de humedad fina <td>Tome cualquier caja de plástico con tapa, estérlela con etanol al 70% y déjela secar</td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Labline</td><td>203</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> de inyección <td>Preparado para 1 mL siguiendo la referencia #22 : Mix 10 &micro; L de tampón de fosfato sódico 0,1 M, 100 y micro; L de solución de cloruro de potasio 0,5 M, 100 y micro; L de colorante alimentario y 790 &micro; L de agua bidestilada. Almacenar en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sistemas de microinyección intracelular (Picospritzer)</td><td>Parker</td><td>052-0500-900</td><td>Actualmente está disponible el modelo III, pero los modelos más antiguos también funcionan</td></tr> con <tr><td>el soporte de micro agujas</td><td>A-M Systems</td><td>672441</td><td>Otros productos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>agujas de microinyección (1,2 mm x 0,68 mm, 4 pulgadas)</td><td>A-M Systems</td><td>603000</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-024-R</td><td>Cualquier micromanipulador de calidad funcionará</td></tr><tr><td>fosfato monosódico</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-80-7</td><td>Para hacer 10 mL de solución de trabajo 1 M: Agregue 1,2 g de polvo de fosfato monosódico a 10 mL de agua destilada doble y mezcle hasta obtener una solución clara</td></tr><tr><td>P-1000 Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Ajustes del tirador: Calor 575, Tirar 60, Velocidad 75, Retardo 110, Presión 700.</td></tr><tr><td>Micropipeta P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td>Otros modelos funcionarían igual</td></tr><tr><td>de bien Micropipeta P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fischer scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Para hacer 100 mL de solución de cloruro de potasio 0,5 M: Añadir 3,73 g de cristales de cloruro de potasio a 100 mL de agua bidestilada y mezclar hasta obtener una solución clara.</td></tr><tr><td>tampón de fosfato de sodio (0,1M)</td><td></td><td></td><td>Para hacer 10 mL de 0,1 M de este tampón: Mezcle 8,5 mL de solución dibásica de fosfato de sodio 1 M con 1,5 mL de solución de fosfato monosódico 1 M. Compruebe el pH con un medidor de pH y ajústelo en consecuencia a un pH de 7,6 a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>fosfato de sodio dibásico</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-79-4</td><td>Para hacer 10 mL de solución de trabajo 1 M: Agregue 1,42 g de polvo de fosfato de sodio dibásico a 10 mL de agua destilada doble y mezcle hasta obtener una solución clara</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Microscopio Central</td><td>10446293</td><td>Cualquier buen microscopio estereoscópico funcionará</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>5. Preparación de larvas de T. marmoratus para inyecciones de dsRNA</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td> fuerte <td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>fórceps (Dumon #4 Biology)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Los productos de otros proveedores funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>6. Microinyecciones de dsRNA en larvas de T. marmoratus</</td>tampón > inyección fuerte (10x)Ver sección 4 agujas de microinyección (1,2 mm x 0,68 mm, 4 pulgadas)A-M Systems 603000 Otros modelos funcionarían igual de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>bien</td></tr> <tr><td></td><td></td>microinyección <td></td><td></td></tr><tr><td> jeringa</td><td>A-M Systems</td><td>603000</td><td>Otros modelos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>micro soporte de agujas</td><td>A-M Systems 672441</td><td></td><td>Otros productos funcionarían igual de bien</td></tr><tr><td>P-1000 Extractor de micropipetas</td><td>Instrumento Sutter P-1000</td><td></td><td>Ajustes del extractor: Calor 575, Tracción 60, Velocidad 75, Retardo 110, Presión 700.</td></tr><tr><td>microscopio</td><td>estereoscópico Central</td><td>10446293</td><td>Cualquier buen microscopio estereoscópico funcionará</td></tr></tbody></table>

interferencia de arn en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

La interferencia de ARN (ARNi) sigue siendo una técnica poderosa que permite la reducción selectiva de la expresión génica a través de la degradación del ARNm. Esta técnica es aplicable a una amplia variedad de organismos y es altamente eficiente en el orden rico en especies Coleoptera (escarabajos). Aquí, resumimos los pasos necesarios para desarrollar esta técnica en un organismo novedoso e ilustramos su aplicación a las diferentes etapas de desarrollo del escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus. Las secuencias genéticas diana se pueden obtener de manera rentable mediante el montaje de transcriptomas contra un pariente cercano con genómica o de novo conocida. La clonación de genes candidatos utiliza un vector de clonación específico (el plásmido pCR4-TOPO), que permite la síntesis de ARN de doble cadena (dsRNA) para cualquier gen con el uso de una sola imprimación común. El dsRNA sintetizado se puede inyectar en embriones para procesos de desarrollo tempranos o larvas para procesos de desarrollo posteriores. A continuación, ilustramos cómo se puede inyectar ARNi en larvas acuáticas mediante inmovilización en agarosa. Para demostrar la técnica, proporcionamos varios ejemplos de experimentos de ARNi, generando derribos específicos con fenotipos predichos. Específicamente, el ARNi para el gen bronceado laccasa2 conduce a la iluminación de la cutícula tanto en larvas como en adultos, y el ARNi para el gen de pigmentación ocular blanco produce un aclaramiento / falta de pigmentación en los tubos oculares. Además, el derribo de una proteína de lente clave conduce a larvas con deficiencias ópticas y una capacidad reducida para cazar presas. Combinados, estos resultados ejemplifican el poder de los ARNi como herramienta para investigar tanto el patrón morfológico como los rasgos de comportamiento en organismos con solo bases de datos transcriptómicas.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, derribamos tres genes diferentes, a saber, blanco, laccase2 (lac2),y Lens3 (Tabla 1),en una variedad de diferentes etapas de desarrollo del Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. Realizamos ARNi en T. marmoratus inyectando dsRNA en una etapa muy temprana durante la embriogénesis (Figura 1A). Como algunos de los embriones no sobreviven al proceso y se vuelven necróticos(Figura 1B),es necesario eliminarlos para mantener sanos los embriones restantes. Aquí se ejemplifican las inyecciones de ARN contra el gen blanco. Este gen es bien conocido en Drosophila como uno de los tres transportadores de casete de unión ATP (ABC) involucrados en la absorción y almacenamiento de los precursores del pigmento ocular23. En consecuencia, su pérdida de función da como resultado un fenotipo de ojos blancos sin pigmentar. Nuestros resultados muestran que las inyecciones de dsRNA dirigidas al gen blanco ortologos en embriones de T. marmoratus conducen a la pérdida de pigmentación ocular en larvas recién emergentes. En este caso, las larvas de tipo salvaje se caracterizan por ojos muy pigmentados, y el derribo de RNAi del blanco conduce a varios niveles de reducción e incluso eliminación completa del pigmento ocular. En general, observamos al menos cierta reducción en la coloración de los ojos en el 34% de los embriones supervivientes (n.o 35). La Figura 2A compara a un individuo de control y a un individuo con un color de ojos ligeramente más claro. La Figura 2B ilustra un derribo más grave en un individuo, en el que los ojos más ventrales (Ojos 2–5) del cúmulo están completamente sin pigmentar, mientras que los ojos dorsales todavía muestran algo de pigmentación. Estas diferencias ponen de relieve cómo la eficiencia del derribo puede variar regionalmente, lo que posiblemente está relacionado con las diferencias en la eficacia de la penetración de dsRNA en el tejido denso. Otro individuo muestra esencialmente la pérdida completa de pigmento en todos los ojos(Figura 2C).
Para investigar qué tan bien funciona el ARNi en la etapa larval de T. marmoratus, inyectamos dsRNA apuntando al gen tánico lac2 en larvas de segunda estrella unos días antes de que se fusionaran en terceras estrellas(Figura 3) y evaluamos el efecto sobre la coloración cuticular de las larvas de tercera estrella. Lac2 es un tipo de fenoloxidasa que conjuga oxidativamente las proteínas para hacerlas insolubles, más duras y oscuras. Knockdown en el escarabajo de harina T. castaneum se ha demostrado para conducir a individuos de color más claro en dosis bajas, pero se considera letal en dosis altas24. La Figura 4 ilustra que este tratamiento también conduce a larvas de Sunburst Diving Beetle de color más claro. Específicamente, en este experimento, el 75% de las larvas inyectadas supervivientes (n.o 12) tenían pigmentación reducida (en comparación con el 0% en el grupo de control). La Figura 4A muestra a un individuo con despigmentación relativamente leve, mientras que la Figura 4C ilustra la cabeza de una larva de T. marmoratus en la que la coloración oscura de la cutícula está casi ausente. La despigmentación fue particularmente evidente para el patrón oscuro central que es típico de estas larvas, mientras que este patrón permaneció claramente visible en un individuo con control inyectado (Figura 4B). Además, se observó un aclaramiento de la tráquea de cola, como se muestra en la Figura 4D. En el caso de que lac2 dsRNA se inyectara en larvas de tercera estrella, se obtuvieron individuos adultos más ligeros(Figura 5). Tenga en cuenta que las alas del escarabajo knockdown están algo deformadas, probablemente debido a su suavidad inusual.
Además de alterar los rasgos morfológicos, es posible utilizar arNI para atacar genes que afectan el comportamiento. Para demostrar esto, realizamos ARNi contra un gen clave de codificación de proteínas de lente, Lens318,y lo inyectamos en larvas de segunda estrella para afectar las propiedades ópticas de los ojos larvales de tercera estrella. Cualquier efecto sobre la lente observada aquí es probable porque los ojos de las larvas de T. marmoratus experimentan un crecimiento ocular importante en esta transición, que también implica cambios ópticos importantes de la lente25. El derribo de ARNi en este experimento fue muy eficiente. La verificación a través de qPCR mostró una tasa de éxito del 100%; de 13 individuos probados, 12 fueron derribados a menos del 10% del nivel de expresión de los individuos de control, y el individuo restante tenía un nivel de expresión del 17% del nivel de control (observación inédita). A nivel fenotípico, sólo algunos individuos fueron severamente discapacitados o incapaces de ser presas, como se ilustra en la Figura 6 para un individuo que se acercó repetidamente a su presa desde una distancia muy cercana, pero constantemente la superó.
Tabla 1: Secuencias de imprimación y amplicons para proteínas blancas, lac2 y Lens3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración de las inyecciones de embriones. (A) Embriones descorionados alineados en una placa de agarosa e inyectados cerca de su centro utilizando una aguja de microinyección llena de ARNd y tampón de inyección que contiene tinte alimentario. La barra de escala representa 500 m. (B) Un individuo con un derribo más grave. Los embriones inyectados se mantienen en una cámara de humedad y se monitorean diariamente para puntuar fenotipos y eliminar a los individuos muertos (que se vuelven marrones). La barra de escala representa 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de embriones completamente desarrollados que se inyectaron con dsRNA contra el blanco. (A) Comparación de un individuo con una reducción de la pigmentación ocular (izquierda) y un individuo con inyección de control (derecha). E1–E6 se refieren a Ojos 1–6. (B) Un individuo con un fenotipo de derribo más grave, que ilustra que, a veces, algunos de los ojos dentro del cúmulo se ven más gravemente afectados por el derribo que otros. (C) Individuo con una pérdida casi completa de pigmentación ocular. La barra de la escala representa 200 m; Los paneles B y C se representan a la misma escala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> Figura 3: Ilustración de inyecciones larvarias. (A) Varias larvas inmovilizadas por la incrustación en el 2% de agarosa con sus espiráculos de cola dejados libres de cualquier agarosa. (B) Microelectrodo que contiene la solución inyectable colocada de modo que su punta pueda penetrar la membrana fina entre dos segmentos. (C) Tinte de inyección azul visible en el lugar de inyección después de la inyección. Las barras de escala representan 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> Figura 4: ARNi para lacasse2 aplicado a las larvas de segunda estrella que resultan en una reducción de la coloración de la cutícula en larvas de tercera estrella. (A) Pérdida relativamente leve de coloración en un individuo de ARNi lac2 (abajo) en comparación con un individuo con inyección de control (arriba). La barra de escala representa 5 mm. (B) Cabeza de un individuo de control que muestra el patrón característico de color oscuro en el centro de la cabeza. (C) Derribo relativamente grave de lac2 que conduce a una pérdida casi completa de la coloración central de la cabeza. (D) Pérdida de coloración en la cutícula de cola principal de un individuo de ARNi lac2 (abajo) en comparación con un individuo con inyección de control (arriba). Las barras de escala en B-u2012D representan 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> Figura 5: ARNi para lacasse2 aplicado a una tercera larva instar que resulta en una reducción de la coloración de la cutícula en un adulto. El individuo knockdown (izquierda) también se caracteriza por elytra muy suave en comparación con el control (derecha). La barra de escala representa 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> Figura 6: Derribo de una proteína de lente principal que conduce a deficiencias en la captura de presas. (A–C). Tres ejemplos en los que una larva de Escarabajo Buceo Sunburst, en la que se indujeron déficits ópticos a través de ARNi, no pudo capturar presas (larvas de mosquitos). Se seleccionaron imágenes fijas representativas de una grabación de vídeo de capturas de presas características. (D) Controlar la captura de larvas. Todas las barras de escala representan 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

A pesar de que la edición genética se ha vuelto popular para estudiar la genética molecular de los organismos no modelo, el ARNi sigue siendo una poderosa herramienta sinérgica. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a diferentes etapas de desarrollo. Además, se puede utilizar un derribo parcial para estudiar estos genes enteros.El éxito del procedimiento se basa en la inyección de DSR y tener un daño mínimo. Esto requiere práctica, así que no se desanime si se necesitan algunos intentos para hacerlo bien. Para preparar embriones en etapa temprana para la micro inyección, primero vierta la ebullición del 20% de la agarosa en una pequeña placa de Petri y coloque tres tubos de plástico de uno a dos milímetros de ancho en la superficie del líquido agarosa antes de que se solidifique.Una vez que la agarosa se ha solidificado utilizar un par de fórceps contundentes para quitar los tubos y cubrir las hendiduras resultantes con 500 microlitros de agua destilada autoclave. Cuando el recipiente de la colección esté listo, utilice un cepillo de pintura de pelo natural fino para transferir cinco ocho horas de edad embrión T.marmoratus de edad de los sitios de anidación de escarabajos en un plato de cavidad de vidrio lleno de agua destilada autoclave bajo un microscopio estereo. Usando el microscopio y los fórceps de disección fina agarran la tarea de cada embrión desde ambos lados y desgarran la tarea abierta permitiendo que el embrión se deslice suavemente fuera del tejido.Después de eliminar ambas capas de coro de todos los embriones recogidos, utilice el pincel para transferir cuidadosamente los embriones de la placa de cavidad de vidrio a las ranuras de la placa de agarosa preparada. Para inyectar embriones en etapa temprana con ARN de doble cadena específico del gen, primero prepare agujas de microinyección en un pulverizador de aguja y utilice el microscopio estéreo y encuentre fórceps para romper cada punta a un borde afilado. Después de lanzar el ARN de doble cadena de doble cadena de material purificado de interés sobre el hielo, agregue un microlitro de tampón de inyección 10X a la solución resultante y utilice agua destilada doble para llevar el volumen de vinilo de la solución a 10 microlitros.Utilice una pipeta P10 para rellenar una de las agujas de microinyección preparadas con la solución de ARN de doble cadena de trabajo y cargue la aguja en un soporte de microneedleta conectado a un sistema de microinyección que utilice tecnología de eyección de presión. Encienda el sistema de microinyección y el suministro de aire presurizado y utilice la microválvula del sistema de microinyección para ajustar la presión de inyección a 15 libras de presión por pulgada cuadrada y luego utilice la perilla de ajuste de tiempo para ajustar la duración de la inyección a segundos. Para calibrar la aguja de inyección evaluar el volumen de la burbuja de fluido que se forma en la punta de la aguja al inyectar en el aire para el embrión T.marmoratus utilizar un tamaño de burbuja óptimo de 100 a 200 micras.La aguja de inyección es de buena calidad si se pueden lograr burbujas óptimas a 15 libras de presión por pulgada cuadrada con una duración de inyección de unos tres segundos. Cuando la aguja configurada esté lista, alinee la aguja en la placa de agarosa de embriones de manera que la aguja se acerque a los embriones en un ángulo de 45 a 60 grados. Utilice el micromantenedor para mover lentamente el microneedle hasta que la punta esté tocando la superficie del centro de un embrión y luego mueva cuidadosamente la aguja hacia adelante hasta que simplemente perfore la superficie del embrión.Una vez que la aguja está dentro del embrión presione cuidadosamente el botón de inyección del microinyectores para entregar de uno a dos nanolitros de ARN de doble cadena en el embrión. Cuando todo el ARN se haya entregado lentamente, retraiga lentamente la aguja del embrión sin hacer que el embrión se rompa. Los embriones inyectados con éxito se pueden identificar por la presencia de un punto de color en el lugar de la inyección.Cuando todos los embriones se hayan inyectado cuidadosamente coloque el plato en una cámara de humedad en una incubadora de 25 grados Celsius ajustada a un ciclo de 14 horas de luz de 10 horas oscuro durante cuatro a cinco días. Supervise el progreso del desarrollo embrionario diariamente bajo el microscopio estéreo para identificar fenotipos de derribo morfológicamente visibles. Uso de una cámara digital de alta resolución para documentar el proceso de desarrollo.Retire los embriones muertos y reponga el agua de la placa de agarosa diariamente para evitar la desceración y la propagación de la contaminación microbiana a otros embriones supervivientes durante el período de incubación. Antes de recoger la larva primero añadir 60 a 70 grados Celsius 2%agarosa líquida a un pequeño plato petri. Cuando la agarosa se ha solidificado utilizar fórceps contundentes para hacer un grupo poco profundo por larva para ser inyectado en la agarosa y drenar suavemente el agua de las copas de cultivo de larvas.Después de la anestesia utilice fórceps de extremo suave para colocar cuidadosamente la larva en la placa de inmovilización con los cuellos y cuerpos en las ranuras, pero la cola situada por encima de la superficie de la agarosa. Cuando se haya colocado toda la larva, cubra cada lava con una gruesa capa de agarosa que todavía es líquida pero no peligrosamente caliente y libre de cualquier cuento que se cubrió accidentalmente según sea necesario. para una microinyección de ARN de doble cadena, cargue un microneedle con la solución específica de trabajo de ARN de doble cadena específica de genes como se ha demostrado.Enrojecer el émbolo de una jeringa de microinyección controlada manualmente y cargue la aguja en el sistema de microinyección. Coloque la larva inmovilizada bajo el microscopio estéreo de manera que el lugar de inyección esté alineado con la trayectoria de la aguja de microinyección en un ángulo relativamente plano. Utilice el micromantenidor para mover cuidadosamente la punta de la aguja en la larva y aplicar presión lenta y cuidadosamente a la jeringa, ajustando la presión de inyección de acuerdo con el movimiento del líquido de inyección de color en la aguja según sea necesario.Cuando se haya inyectado todo el ARN, utilice fórceps blandos para liberar la larva de la agarosa y colocar la larva en un nuevo recipiente de agua a temperatura ambiente a 25 a 28 grados centígrados y un ciclo de 14 horas de luz de 10 horas de oscuridad. En este análisis representativo se derribaron tres genes diferentes en una variedad de diferentes etapas de desarrollo del escarabajo de buceo T.marmoratus. La interferencia del ARN se realiza como se demuestra mediante la inyección de ARN de doble cadena en una etapa muy temprana de la embrióngénesis.Algunos de los embriones no sobreviven al proceso y se vuelven necróticos. En estas imágenes controlan individuos y un individuo con un color de ojos ligeramente más claro se puede observar. En este individuo, un derribo más severo en el que las mentiras más ventrales del cúmulo están completamente sin pigmentar, pero los aliados do todavía muestran algo de pigmentación se puede observar.Aquí se muestra un ejemplo de otro individuo con pérdida de pigmento esencialmente completa en todos los ojos. Lac2 derribado en larvas resulta en una cutícula menos pigmentada, individuos adultos más ligeros con alas algo deformadas probablemente debido a la suavidad inusual del tejido también se obtuvieron. Asegúrese de mirar atentamente para observar de cerca sus animales inyectados sobre una base diaria y para eliminar inmediatamente cualquier individuo muerto.El poder de esta técnica es que se puede aplicar a los genes de muchos organismos diferentes. Esta técnica también se ha aplicado ampliamente y con éxito a la biología del desarrollo evolutivo.

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Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

ARN de interferencia se ha demostrado muy eficaz para analizar la función del gen...

RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina, Tribolium castaneum

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Proporcionamos un protocolo detallado para la interferencia de ARN mediado por electroporación en insectos de la orden Odonata (libélulas y damiselas) utilizando la presa de cola azul (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) y la libélula pied skimmer libélula (Pseudothe zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferencia de ARN mediado por electroporación en Odonata

Aprende a aplicar interferencia de ARN en escarabajos acuáticos Thermonectus marmoratus para estudiar función génica en etapas específicas del desarrollo. Este método permite el análisis de estructura y comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos (Video) | JoVE Journal

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

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