Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón
9 de septiembre de 2020
Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.
Este protocolo cuantifica los flujos de calcio en las neuronas dopaminérgicas, que se pierden en la enfermedad de Parkinson. Esto es útil para entender cómo el calcio anormal causa la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson. Por primera vez, demostramos flujos espontáneos de calcio en las neuronas primarias cultivadas de cerebro medio.
Este método se puede utilizar para diseccionar las contribuciones específicas de los receptores implicadas en la apoptosis mediada por calcio. Nuestro método proporciona una vía para las pantallas de fármacos de alto contenido para descubrir compuestos neuroprotectores específicos y eficaces para la enfermedad de Parkinson. Estos compuestos neuroprotectores evitarían la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.
Comience preparando un mililitro de medio DMEM sin suero con un microlitro de AAV hSyn-GCaMP6f por plato. Aspirar el medio de cultivo celular de cada plato y reemplazarlo por un mililitro del DMEM preparado con hSyn-GCaMP6f. Coloque los platos de nuevo en la incubadora de 37 grados Centígrados durante una hora.
Después de la incubación, aspirar el medio con AAVs y reemplazarlo por tres mililitros de medio de cultivo celular. Incubar los platos a 37 grados centígrados durante cinco a siete días. Cambiar el medio cada dos o tres días a lo largo de este período de infección viral.
Prepare un litro del tampón de grabación HEPES, 200 mililitros de 20 tampones de grabación de glutamato micromolar y 200 mililitros de búfer de grabación NBQX de 10 micromolares según las instrucciones del manuscrito. Llene una placa estéril de 35 milímetros de Petri con tres mililitros del tampón de grabación. Tome el plato de Petri con los cultivos infectados de la incubadora, luego agarre cuidadosamente el borde de un resbalón de cubierta con fórceps de punta fina y transfiéralo al plato con el tampón de grabación.
Coloque el resguardo de la cubierta restante en el medio de nuevo en la incubadora de 37 grados Celsius y transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal. Inicie el software de imágenes. Mientras se está inicializando, inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación.
A continuación, calibrar el flujo a dos mililitros por minuto. Transfiera el resbalón de la cubierta infectada del plato Petri al baño de grabación con fórceps finos. Usando el objetivo de inmersión de agua 10X y la luz de campo brillante, busque el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares de neuronas, luego cambie al objetivo 40X y reenfoque la muestra.
Seleccione y aplique AlexaFluor 488 en la ventana de lista Tintes. Con el fin de evitar la sobreexposición y el blanqueo fotográfico de los fluoróforos, comience con ajustes de baja potencia HV y láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el HV en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento a cero.
Establezca la potencia en 5% para la línea láser 488. Aumente el tamaño del agujero a 300 micrómetros y utilice la opción de escaneo de enfoque x2 para ajustar de forma óptima las señales de emisión a los niveles de subsaturación. Los ajustes se pueden ajustar para una visibilidad óptima de cada canal.
Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva el escenario para localizar una región con varias células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la toma de imágenes. Utilice la herramienta Rectificar clip para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de un segundo. Establezca la ventana de intervalo en un valor de 1.0 y la ventana Num en 600.
Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción Tiempo y, a continuación, utilice la opción de escaneo Xyt para comenzar la creación de imágenes. Observe la barra de progreso de la imagen y mueva la línea desde el búfer de grabación HEPES al búfer de grabación de glutamato micromolar en el punto de tiempo adecuado. Cuando se complete la creación de imágenes, seleccione el botón de la serie realizada y guarde la película de la serie t terminada.
Continúe perfundiendo el glutamato durante cinco minutos adicionales para que el cultivo de las neuronas haya estado expuesto al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada hoja de portada que se va a tomar la imagen. Es posible ver rastros de calcio y cuerpos celulares neuronales inmediatamente después del experimento.
Utilice la herramienta Elipse para dibujar el número deseado de ROI alrededor del soma neuronal. Y utilice el botón Análisis de serie para visualizar las trazas. Después de la exposición adicional de cinco minutos al glutamato, retire el resbalón de la cubierta del baño con fórceps finos y colóquelo de nuevo en la placa Petri con el búfer de grabación hasta que se completen todas las imágenes.
El día de la toma de imágenes, los cultivos de VM fueron tratados con glutamato o una combinación de glutamato y NBQX. En ambas condiciones, se observaron cambios heterogéneos y espontáneos en la florescencia de GCaMP6f que indicaron flujos espontáneos de calcio. La aplicación del glutamato generó una respuesta de calcio robusta y sostenida en las neuronas espontáneamente activas y en reposo.
La aplicación de NBQX redujo la actividad espontánea y bloqueó parcialmente la respuesta del glutamato. La medida en que la aplicación de glutamato estimuló una respuesta de calcio en cada condición se cuantificó utilizando el área debajo de la curva, la amplitud máxima y la latencia para responder. La latencia a la respuesta aumentó bajo la condición nbQX y glutamato.
Para medir la apoptosis mediada por glutamato, las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-Caspasa-3. La intensidad media de la caspasa-3 fue significativamente mayor en ambas condiciones de tratamiento en comparación con los controles no tratados. Un análisis más exhaustivo de la muerte de células tóxicas excitadas se puede hacer contando el número de inmunosustina hidroxilasa positivas neuronas dopaminérgicas en control y condición tratada con glutamato.
Esta técnica ha allanado el camino para entender las contribuciones relativas de diferentes receptores y canales de hierro involucrados en la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.
Resumen
Este estudio presenta un protocolo para medir flujos de calcio (Ca2+) in vitro en neuronas del mesencéfalo utilizando cultivos primarios de mesencéfalo de ratón. El modelo investiga cambios patológicos relacionados con la actividad anormal del calcio, particularmente en el contexto de la enfermedad de Parkinson, y proporciona una plataforma para la evaluación de posibles terapias neuroprotectoras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Neurofarmacología
Antecedentes
- El flujo de calcio en las neuronas desempeña un papel crucial en numerosos procesos celulares.
- La pérdida de neuronas dopaminérgicas es una característica distintiva de la enfermedad de Parkinson.
- El estudio explora cómo los niveles anormales de calcio inducen apoptosis en neuronas dopaminérgicas.
- La aplicación de glutamato y NBQX ayuda a evaluar las respuestas mediadas por calcio y los efectos neuroprotectores.
Objetivo del estudio
- Para medir los flujos espontáneos de calcio en cultivos primarios de neuronas del mesencéfalo.
- Para comprender las contribuciones de los receptores a la muerte celular mediada por calcio.
- Para facilitar la selección de alto contenido de compuestos neuroprotectores.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron cultivos celulares derivados de neuronas primarias del mesencéfalo de ratón.
- La imagen de calcio implicó el uso de GCaMP6f para monitorear los cambios de fluorescencia.
- Los procedimientos clave incluyeron la preparación del medio de cultivo y la aplicación de glutamato.
- Se realizó una imagen de tiempo sensible mediante microscopía con ajustes cuidadosos de parámetros.
- Las células fueron tratadas con glutamato o con una combinación de glutamato y NBQX.
Resultados principales
- Las respuestas de calcio variaron según las condiciones del tratamiento, mostrando cambios espontáneos e inducidos por glutamato.
- La actividad de la caspasa-3 aumentó significativamente en las neuronas tratadas, lo que indica procesos apoptóticos.
- La aplicación de NBQX redujo la actividad espontánea y modificó las respuestas al glutamato.
- El método demostró potencial para analizar las contribuciones específicas de los receptores a la muerte neuronal.
Conclusiones
- Este estudio permite una exploración detallada de la apoptosis mediada por calcio en neuronas dopaminérgicas.
- El protocolo sirve como una herramienta valiosa para la selección de agentes neuroprotectores relevantes para la enfermedad de Parkinson.
- Los hallazgos proporcionan información sobre los mecanismos patológicos y los objetivos terapéuticos para la neurodegeneración.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la cuantificación de flujos de calcio espontáneos y evocados por glutamato en neuronas primarias del mesencéfalo de ratón, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad que modele la excitotoxicidad de las neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson. Al vincular la dinámica del calcio con la activación de la caspasa-3, este método apoya la reducción mecanicista de riesgos de compuestos neuroprotectores mediante lecturas funcionales de la supervivencia neuronal. El enfoque ofrece continuidad traslacional desde la validación del objetivo hasta el cribado preclínico, al permitir una evaluación de alto contenido de los efectos de fármacos sobre la apoptosis mediada por calcio.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas en torno a la entrada de calcio mediada por receptores de glutamato en la pérdida de neuronas dopaminérgicas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco al medir el flujo de calcio como una lectura directa de la actividad del receptor.
- Valor predictivo: Apoya la confianza predictiva al vincular la modulación del receptor con resultados apoptóticos descendentes mediante la activación de caspasa-3.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas en tiempo real de los cambios de calcio intracelular como resultado funcional del ensayo.
- Valor operativo: Permite la estandarización del ensayo mediante condiciones definidas de tratamiento con glutamato y NBQX, así como parámetros de imagen.
- Escalabilidad: Soporta un formato de cribado de alto contenido mediante imagen en vivo y análisis automatizado de regiones de interés (ROI) del soma neuronal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Biomarcador Translacional: Utiliza la activación de la caspasa-3 como un punto final medible de la apoptosis inducida por glutamato en neuronas positivas para tirosina hidroxilasa.
- Modelo Preclínico: Establece un sistema relevante para la enfermedad mediante el uso de neuronas primarias del mesencéfalo ventral para modelar la excitotoxicidad relacionada con la enfermedad de Parkinson.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite la priorización de compuestos según su capacidad para suprimir el flujo de calcio y la activación subsiguiente de la caspasa-3.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de la eficacia preclínica, al proporcionar una lectura funcional de la salud neuronal en un modelo relevante para la enfermedad de Parkinson.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la contribución de los receptores del glutamato a la apoptosis mediada por calcio en neuronas dopaminérgicas.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante mediciones estandarizadas del flujo de calcio y detección de apoptosis mediante inmunotinción.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos, incluyendo el área bajo la curva, la amplitud máxima y la latencia de respuesta en los rastreos de calcio, lo que permite el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona la alteración del calcio con la muerte celular apoptótica en neuronas dopaminérgicas, apoyando la alineación de biomarcadores con vías neurodegenerativas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar compuestos neuroprotectores en múltiples campañas de tamizaje dirigidas al equilibrio del calcio.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar el flujo de calcio como un impulsor clave de la apoptosis de neuronas dopaminérgicas.
- Valor operativo: Promueve la reproducibilidad mediante la transducción viral estandarizada, la preparación del tampón de imagen y la configuración de parámetros confocales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia funcional temprana del acoplamiento al blanco y la neuroprotección.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos que reducen la apoptosis mediada por calcio en neuronas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo primario de neuronas, transducción viral e imágenes confocales en vivo.
- Depende de instrumentación que incluye microscopio confocal con sistema de perfusión y software de análisis de regiones de interés (ROI).
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto al tiempo de exposición al glutamato, aplicación simultánea de NBQX y protocolos de tinción para caspasa-3.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el método desde modelos neuronales de ratón a humanos o a otros contextos de enfermedad.
- Limitado por la variabilidad en la eficiencia de transfección en neuronas primarias y en la actividad espontánea basal entre diferentes preparaciones.
