Técnicas de inmunohistoquímica para analizar la proliferación celular y la neurogénesis en ratas utilizando el análogo de timidina BrdU

Este es un protocolo clave en el campo de la neurogénesis adulta. Aquí presentamos una descripción detallada de los pasos necesarios para lograr una tinción exitosa. Esta técnica permite identificar simultáneamente proteínas específicas coexpresadas en las células en división, al tiempo que preserva la integridad del tejido.

Recomendamos analizar los anticuerpos tisulares y las afecciones con anticipación. Los pasos cruciales son la permeabilización de la membrana, la desnaturalización cuidadosa del ADN y la prueba de los tiempos para los pasos de bloqueo y lavado. La estandarización de la técnica es un reto para los nuevos laboratorios.

Para la administración de BrdU de análogo de timidina en roedores, se debe inmovilizar la cavidad abdominal inferior para sujetar a la rata experimental y utilizar una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 23 para inyectar intraperitonealmente una solución recién preparada de 50 miligramos por kilogramo de BrdU en el animal. En el punto final experimental apropiado, recoja el cerebro y congele el cerebro para permitir la adquisición de secciones coronales de 40 micrómetros de espesor utilizando un micrótomo de criostato y coloque las secciones en pocillos individuales de una placa de cultivo celular de 24 pocillos en una solución de crioprotección en el orden de su recolección. Cuando se hayan recolectado todas las secciones, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados durante unos meses.

Para evaluar la tinción de BrdU, mediante una reacción de peroxidasa, con el complejo avidina-biotina-peroxidasa, transfiera las rodajas de la solución de crioprotección a PBS 0,1 molar hasta que las muestras alcancen la temperatura ambiente y enjuague los tejidos tres veces durante 10 minutos con PBS fresco 0,1 molar por lavado. Después del último lavado, incuba las secciones en una solución bloqueadora de peroxidasa endógena durante 30 minutos, a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de 10 minutos en PBS 0,1 molar. Después del último lavado, incubar las secciones durante 20 minutos a 37 grados centígrados en ácido clorhídrico de dos molares, seguido de un enjuague de 10 minutos en tampón de borato de 0,1 molares.

Después de tres lavados en PBS 0,1 molar helado, incube las muestras durante dos horas a temperatura ambiente en una solución de bloqueo de PBS +, seguido de una incubación nocturna con anticuerpo primario Anti-BrdU de ratón en PBS + a cuatro grados Celsius. Después de tres lavados con PBS de 0,1 molares, incubar las muestras durante dos a cuatro horas con el anticuerpo secundario biotinilado de ratón adecuado en PBS+ a temperatura ambiente. Después del lavado, trate las secciones con ABC Solution durante una hora a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de PBS de 0,1 molares.

Después del último lavado, transfiera las rodajas a la solución de sustrato DAB-Peroxidasa para una incubación de dos a 10 minutos hasta que las rodajas se vuelvan de color gris oscuro. Si se pueden visualizar células positivas, enjuague las muestras con tres lavados con agua del grifo de 15 minutos seguidos de tres lavados de PBS de 0,1 molares. Después del último lavado, use un cepillo suave para montar cuidadosamente las rodajas en portaobjetos gelatinizados, para el secado al aire durante la noche a temperatura ambiente.

A la mañana siguiente, use un medio de montaje permanente para colocar cubreobjetos sobre las muestras. Para cuantificar las células positivas para BrdU, en primer lugar, utilice el aumento de 4x, en un microscopio, para identificar el giro dentado y buscar cuidadosamente en la capa de células granulares a lo largo del eje Z los núcleos marcados con BrdU. Después de seleccionar una sección de intervalo para la búsqueda de células en todo el giro dentado, cuente todas las células positivas para BrdU.

La morfología del núcleo marcado puede cambiar dependiendo de la cantidad de BrdU que incorpore la célula. Muévase lentamente sobre el eje Z para cuantificar todos los núcleos de al menos 10 secciones por animal y al menos cinco animales por grupo que integran un clúster. Para la deconvolución de imágenes, abra el complemento 3D de función de propagación de punto de difracción, complete todos los datos requeridos, haga clic en Aceptar y guarde el archivo.

A continuación, abra el complemento DeconvolutionLab2 y arrastre la imagen de pila Z y el archivo PSF coincidentes a la ranura de ventana correspondiente. Seleccione el algoritmo de deconvolución y el número de iteraciones y haga clic en ejecutar. Para combinar las imágenes deconvoneadas en una sola imagen de pila Z, seleccione Imagen y pilas y haga clic en Proyecto Z.

En el menú Tipo de proyección, seleccione Intensidad máxima. Haga clic en Aceptar y guarde el archivo. Para crear una imagen RGB, seleccione Imagen y color y haga clic en Fusionar canales para establecer la imagen correspondiente en el canal de color deseado en el menú desplegable.

A continuación, desmarque la casilla Crear compuesto. Haga clic en Aceptar y guarde el archivo. Cuando se hayan creado todas las imágenes de canal, abra al menos dos de los archivos de imagen y seleccione diferentes canales de color para cada archivo de imagen para crear una imagen RBG.

En estas imágenes, se pueden observar secciones representativas de giros dentados con células marcadas con BrdU. Como se observa en estas imágenes ampliadas de las secciones, las células marcadas muestran una intensa tinción oscura. Cabe destacar que existen diferencias significativas en el número de células BrdU positivas entre las ratas controladas que no se sometieron a actividad física y el grupo experimental que estuvo expuesto a la actividad física, lo que es consistente con otros resultados reportados que han demostrado que la actividad física aumenta la proliferación celular en el giro dentado adulto.

Al intentar este protocolo, emplee soluciones recién preparadas y manipule el pañuelo con cuidado. El hipocampo es susceptible de separarse del resto de los portaobjetos cuando se trata a través de él y puede pasarse por alto. Este procedimiento podría adaptarse para la evaluación de marcadores e índices de ADN de la síntesis de ADN y estudios de proliferación celular con tinción de duplicación.

Esperamos que este esfuerzo haya sido de utilidad para la comunidad científica y facilite la respuesta a nuevas preguntas en el estudio de la proliferación celular, cuando se utiliza la inmunohistoquímica.