Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

La técnica DC-ERG se puede utilizar para la evaluación no evasiva de la función de epitelio pigmentario de la retina para monitorear los cambios relacionados con la edad o la progresión de la enfermedad y para evaluar los efectos de la intervención farmacológica. Esta técnica mejora la capacidad de reproducción de DC-ERG y la facilidad de uso simplificando la preparación del electrodo capilar. También se puede complementar con una aplicación de software ohm estándar para facilitar el análisis.

Comience deslizando cuidadosamente una aguja de jeringa de calibre 25 a través de la junta de goma de silicona hasta la pared posterior del soporte del electrodo. Llene la base del soporte del electrodo con HBSS desgasificación mientras retrae lentamente la aguja, teniendo cuidado de no introducir burbujas, y reemplace la tapa roscada sin apretar. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro del espacio con HBSS y sostenga el capilar horizontalmente mientras se llena para evitar que la solución escape del otro extremo.

Sujetando el capilar lleno en el extremo doblado, inserte lentamente el otro extremo a través de la tapa aflojada y apriete la tapa del tornillo en su lugar. Incline los soportes de electrodos con los electrodos capilares hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan y desgasiquen los capilares en una cámara de vacío durante cinco a 10 minutos. A continuación, suelte lentamente el vacío y rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio, como se ha demostrado.

Para hacer un soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, retire los clips poliacetales negros de un lado de un clip en T número ocho y utilice una base de cilindro con juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura. Fije los clips en T modificados a los tornillos magnéticos de montaje de bolas con tuercas de tamaño M3 y un portaobjetos en un mango de madera cónico de aproximadamente una pulgada, modificado desde un palo de limpieza de punta de algodón, en el soporte en un ángulo para fijar el soporte de microelectrodo en el soporte de junta magnética de bola magnética T-clip hecho a medida. A continuación, utilice la base del cilindro de imanes de tierras raras para colocar de forma segura el soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360 grados en un eje de 180 grados.

Para realizar una prueba de electrodos, primero, baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en un pequeño recipiente de HBSS. Coloque el electrodo de tierra de la aguja y el electrodo de referencia de pellet centrado en cloruro de plata en el mismo HBSS para completar el circuito y seleccionar o crear un identificador adecuado para describir el ratón que se va a probar. Para seleccionar el protocolo de electroretinograma acoplado directo que se va a realizar, haga clic en los protocolos y seleccione DC-ERG.

Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo con la información del paciente. Si la información es correcta, haga clic en Sí y continúe con los pasos uno de seis.

Cierre las puertas de la jaula de Faraday y haga clic en la impedancia para mostrar el modo de impedancia. Compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables y haga clic en el paso para continuar con el paso cuatro de seis para probar la estabilidad de línea de base. Para comenzar a ver los seguimientos, haga clic en vista previa.

Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud pico a pico de menos de 200 microvoltas. Para colocar el ratón y los electrodos para un experimento, anestesia la córnea de un ratón sedado con una gota de 5%ácido clorhídrico proparacaína antes de dilatar la córnea con una gota de 2,5% fenilefrina HCL y 5%tropicamida. En el software del sistema ERG, verifique que el paciente correcto esté seleccionado.

Haga clic en protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG y haga clic en Ejecutar. Haga clic en Sí para comprobar que se está realizando la prueba correcta.

Utilice el paso uno de seis para encender una luz roja tenue dentro de la cúpula y coloque el ratón sobre una mesa de grabación con calefacción. Use fórceps para comprar cuidadosamente la piel de la pierna trasera. Y usando una mano para sujetar firmemente el electrodo de la aguja, utilice la otra mano para insertar el electrodo por vía subcutánea en la pierna trasera para asegurar el electrodo en su lugar.

Coloque la plata de referencia, electrodo de cloruro de plata en la boca del animal para que el pellet centrado se apoya a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo, coloque el soporte del electrodo con los capilares de vidrio orientados verticalmente y deslice el soporte del electrodo con un dedo índice para eliminar cualquier burbuja que pueda haber sido introducida. Utilice una aguja de calibre 25 para llenar las puntas capilares con HBSS e inspeccione los capilares para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en las puntas.

Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que las puntas abiertas de los capilares llenos de HBSS estén en contacto suave con la córnea. Y teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas, invierta el dispensador de gel para los ojos lubricante para desechar las gotas iniciales. A continuación, coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.

Para grabar los DC-ERG, haga clic en el paso para seleccionar el paso cinco de seis y haga clic en la impedancia para utilizar la pantalla de comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo deben ser similares. Y los valores de impedancia para los electrodos de tierra y de referencia deben ser inferiores a 10 kilohms.

Haga clic en vista previa para ver los trazos de los ojos izquierdo y derecho y espere hasta 10 minutos para que se logre una línea base estable. A continuación, haga clic en Detener para salir de la vista previa de seguimiento y haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación. Aquí, se muestra un conjunto de datos de ejemplo de ratones condicionales knockout y de tipo salvaje.

En este análisis, el rastro sufría de burbujas di minutos en el electrodo. Aumentó el ruido pico a pico en la traza. En un análisis separado, las burbujas se eliminaron utilizando la cámara de vacío antes de ensamblar los microelectrodos dentro de los soportes del soporte del electrodo.

Se pueden calcular las mejores líneas de ajuste a los 25 segundos iniciales, lo que permite volver a trazar las respuestas corregidas por deriva y identificar las amplitudes de los componentes DC-ERG. Como era de esperar, la reducción de la expresión de los canales de potasio de cura 7.1 en el RPE atenúa en gran medida la onda c y la oscilación rápida, lo que indica un deterioro significativo de las propiedades eléctricas del epitelio pigmentario de la retina. Aquí, se muestran las amplitudes relativas de los componentes DC-ERG, normalizados a de tipo salvaje y trazados contra las dos amplitudes de onda a evocadas por luz más grandes.

Esta forma de análisis puede determinar si las respuestas eléctricas reducidas del IR se pueden tener en cuenta mediante la reducción de la actividad del fotorreceptor solo. O si hay un defecto subyacente que se origina en el RPE. Recuerde lograr una línea de base estable antes de pasar a la grabación del ratón y volver a insertar los electrodos periódicamente para las burbujas que pueden haber sido introducidas.

Los ERG adaptados a la oscuridad se pueden grabar antes del DC-ERG para medir la función de retina impulsada por el cono. Los ERG adaptados a la luz también se pueden realizar después del DC-ERG para evaluar las respuestas de la retina impulsadas por el cono.