Name: Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a realizar electroretinogramas de acoplamiento directo para evaluar la función del epitelio pigmentario retiniano en ratones. Este protocolo mejorado reduce el ruido mediante desgasificación al vacío y facilita el estudio de enfermedades oculares.

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Este trabajo fue apoyado por los fondos intramuros de NEI. Los autores reconocen sinceramente al Dr. Sheldon Miller por su orientación científica, asesoramiento técnico y experiencia en fisiología y enfermedades de RPE. Los autores agradecen a Megan Kopera y al personal de cuidado de animales por administrar las colonias de ratones, y al Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou y Yuan Wang por el apoyo técnico.

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal descritas en el protocolo de estudio animal aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional del Ojo.
1. Importación de protocolos de estimulación de la luz para DC-ERG
NOTA: Siga las instrucciones a continuación para importar los protocolos de estimulación de la luz para el DC-ERG en el software del sistema ERG (Tabla de materiales). El protocolo consiste en un intervalo de pre-estímulo de 0,5 min, seguido de un paso de luz (10 cd/m2)durante 7 min, y terminando con un intervalo post-estímulo de 1,5 min. Se seleccionó la intensidad lumínica de 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2)ya que evoca aproximadamente la mitad de la respuesta máxima para todos los componentes del DC-ERG en ratones WT18,21. La onda c y la oscilación rápida son de particular interés, ya que los orígenes de estas respuestas eléctricas están bien caracterizados y pueden aislarse y estudiarse más adelante en modelos de RPE in vitro (por ejemplo, iPSC-RPE). La aplicación de otras intensidades de luz puede extraer información adicional, por ejemplo, la respuesta off sufre una reversión de la polaridad en estímulos de luz más brillantes y puede mostrar diferencias en la intensidad a la que se produce esta reversión. El usuario es libre de cambiar la configuración de intensidad de la luz a su discreción.
<ol><li>Abra el software del sistema ERG.</li>
	<li>Haga clic en Centro de base de datos.</li>
	<li>Haga clic en Nuevo (proporcione un nuevo nombre de archivo de base de datos). Haga clic en Guardar. El cuadro emergente mostrará: "Base de datos creada, ¿desea conectarse al nuevo archivo de base de datos." Haga clic en Sí. El nombre de la base de datos actual ahora debe reflejar el nuevo nombre de archivo.</li>
	<li>Haga clic en Transferir en la ventana Centro de control de base de datos.</li>
	<li>Seleccione Archivo suplementario 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Haga clic en Abrir.</li>
	<li>Haga clic en Cerrar (Centro de control de bases de datos) al finalizar la barra de progreso.</li>
	<li>Haga clic en el botón verde Inicio.</li>
	<li>Haga clic en Nuevo en la ventana Seleccionar paciente. Cree un nuevo nombre de familia de pacientes que describa el modelo de ratón, introduzca la fecha de nacimiento (DOB, mm/dd/aaaa), cambie el botón de género (M/F) a la descripción adecuada. Haga clic en Cerrar para guardar los detalles experimentales.</li>
	<li>Haga clic en Protocolos. Los protocolos ERG y DC-ERG adaptados a la oscuridad ahora deberían ser visibles.</li>
	<li>Por último, coloque el archivo Long Flash.col en la siguiente carpeta C:-Archivos de usuario de ERG-Long Flash.col.</li>
</ol>2. Preparación del electrodo capilar
<ol><li>Corte los capilares de vidrio de 1,5 mm por la mitad utilizando una baldosa de cerámica (Tabla de materiales) para puntuar el vidrio y romperlos limpiamente usando una mesa para proporcionar contrafuerza física y estabilizar el vidrio. NOTA: Desde con rodeos según sea necesario.</li>
	<li>El uso de un quemador Bunsen (Tabla de Materiales) permite que el calor haga una pequeña curva en el capilar mientras lo sostiene sobre la llama con fórceps.</li>
</ol>3. Llenado de electrodos capilares
<ol><li>Conecte el desecador de vacío a la línea de vacío del laboratorio a través de un filtro en línea(Tabla de materiales).</li>
	<li>Vierta 30 ml de la solución de sal equilibrada (HBSS) (tabla de materiales) de Hanks en un tubo cónico abierto de 50 ml y colóquelo (con la tapa quitada) en la cámara de vacío.</li>
	<li>Encienda el vacío y desgaste el HBSS mientras enciende el ordenador y el equipo de grabación.</li>
	<li>Después de 5o 201210 min apague el vacío y utilice el HBSS desgastado para llenar una jeringa de 12 ml a través de una aguja de 25 G conectada. Utilícelo para llenar las bases de los soportes de electrodos tomando precauciones adicionales para no introducir burbujas.<ol>
<li>Para ello, retire la tapa roscada del tornillo y deslice cuidadosamente la aguja de la jeringa a través de la junta de goma de silicona para llegar a la pared posterior (pellet de cloruro de plata/plata) del soporte. NOTA: Los pellets de cloruro de plata/plata son ventajosos sobre los soportes que utilizan alambre de plata, ya que proporcionan más superficie, lo que resulta en una línea de base estable de bajo ruido. Sin embargo, los pellets de cloruro de plata/plata requieren una interfaz líquida libre de burbujas de aire para lograr una buena conexión. Por lo tanto, tenga mucho cuidado de no introducir burbujas de aire durante este proceso.</li>
		<li>Inyecte gradualmente HBSS para llenar todo el microelectrodo mientras retrae lentamente la aguja de la jeringa. Vuelva a colocar la tapa roscada pero no apriete. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro de la tapa con HBSS. A continuación, llene el capilar de vidrio mientras lo mantiene horizontal para evitar que la solución escape del otro extremo.</li>
		<li>Sujete el capilar de vidrio del extremo doblado e inserte lentamente el extremo opuesto a través de la tapa aflojada y luego apriete la tapa del tornillo en su lugar. NOTA: Los electrodos de vidrio llenos de HBSS mantienen la lubricación del ojo del ratón y evitan la deshidratación corneal que se produciría con el uso de electrodos de bucle de oro estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los soportes de electrodos con los electrodos capilares inclinados hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan. Ejecuta el vacío durante 5.u201210 min para desgas. El escape de gas de las superficies de vidrio y plástico expulsará a HBSS de los soportes de electrodos.</li>
	<li>Deténgase y luego suelte lentamente el vacío. Rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio como se describió anteriormente. NOTA: Las burbujas tienden a acumularse en o cerca de la junta de goma de silicona y también pueden ocultarse en las ranuras de la tapa roscada, por lo tanto se debe prestar especial atención para mantener estas áreas libres de burbujas.</li>
	<li>Instale y asegure el soporte de microelectrodo en el soporte de junta de bolas magnéticas/T-clip hecho a medida(Figura 1A, inset). Para hacer el soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, modifique un clip T (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabla de Materiales) eliminando los clips poliacetales negros en un lado. Tener la base del cilindro de las juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura (Tabla de materiales). Fije los clips en T modificados a los tornillos de montaje de bolas magnéticas con tuercas de tamaño M3.</li>
	<li>Coloque el soporte de microelectrodo en el clip T modificado y sostén lo sostenga firmemente en su lugar deslizando en aproximadamente un mango de madera cónico de 1 pulgada hecho de romper un palo de limpieza con punta de algodón (Tabla de Materiales) en un ángulo. Utilice la base del cilindro del imán de tierras raras para colocar de forma segura el soporte del soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360o en un eje de 180o.</li>
</ol>4. Electrodos de prueba
<ol><li>Vierta EL HBSS en un recipiente pequeño (por ejemplo, la tapa del tubo cónico de 50 ml).</li>
	<li>Baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en la tapa que contiene HBSS para preequilibrar los electrodos y colocar el electrodo de tierra de la aguja (cola/pierna trasera) y el electrodo de referencia de pellets sinterizado Ag/AgCl (boca) en el mismo HBSS para completar el circuito (Figura 1A). NOTA: Realice todos los pasos posteriores bajo luz roja tenue. Utilice una linterna de luz roja para colocar el ratón y los electrodos capilares. Recuerde apagar completamente todas las fuentes de luz antes de comenzar la grabación.</li>
	<li>Seleccione o cree un identificador adecuado (nombre de familia) para describir el mouse que se va a probar y seleccione el protocolo DC-ERG que se va a realizar completando el registro de acuerdo con el siguiente orden.<ol>
<li>Haga clic en Protocolos. Seleccione DC-ERG. Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo: "El paciente actual es XXX [DOB: XX/XX/XX) ¿Es esto correcto para la prueba que se está realizando?" Haga clic en Sí. A continuación, proceda a "Paso 1/6."</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cierra las puertas de la jaula de Faraday.</li>
	<li>Visualice el modo de impedancia haciendo clic en Impedancia y compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables (consulte la figura 1B).</li>
	<li>Pruebe la estabilidad de línea base (ruido y deriva) haciendo clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Flash Largo Sin Luz." NOTA: La cantidad de deriva observada cuando los electrodos se colocan en el baño HBSS es generalmente inferior a 500 v por 80 s una vez que se han estabilizado y es equivalente a la deriva observada cuando los electrodos están conectados al ratón. Por lo tanto, la lectura eléctrica de los electrodos en el baño HBSS son un indicador importante del estado de los electrodos. El ruido, medido como pico a pico, es generalmente de 10 u201215% mayor en el ratón que en el baño HBSS. Esto es probablemente debido a la adición de artefactos de movimiento de la respiración.</li>
	<li>Comience a ver los seguimientos haciendo clic en Vista previa. Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud de pico a pico <200 V. Se acepta una ligera deriva (<500 v/80 s) que se desvanece gradualmente hasta la línea de base(Figura 1C).</li>
</ol>5. Posicionamiento de ratón y electrodo
<ol><li>Mantenga a los ratones durante la noche en una caja bien ventilada y apretada para una adaptación oscura.</li>
	<li>Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg).</li>
	<li>Aplicar una gota de 0.5% proparacaína HCl tópicamente para anestesiar la córnea, así como una gota de 2.5% fenilefrina HCl y 0.5% tropicamida dilatar las pupilas.</li>
	<li>Recorte los bigotes de ratón con tijeras para evitar que los espasmos involuntarios molesten los electrodos capilares de vidrio durante la grabación. NOTA: El protocolo de estímulo DC-ERG dentro del sistema ERG tiene varias rutinas de estímulo integradas que se pueden seleccionar haciendo clic en el paso (flecha hacia adelante) o paso (flecha hacia atrás). Solo se requieren los pasos 1, 4 y 5 del software para preparar y realizar la grabación DC-ERG.</li>
	<li>En el software del sistema ERG verifique que el paciente correcto está seleccionado. Haga clic en el botón verde Protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. A continuación, haga clic en Ejecutar. Verifique que esta sea la prueba correcta que se está realizando haciendo clic en Sí.</li>
	<li>Utilice el estímulo de luz roja designado para el paso 1/6 para encender la luz roja dentro de la cúpula para ayudar a colocar el ratón y los electrodos mientras observa los cambios en la impedancia.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una mesa de grabación calentada y coloque cuidadosamente la piel de la pierna trasera con fórceps. Sujete el electrodo de la aguja firmemente en una mano e insértelo por vía subcutánea en la pierna trasera para fijarlo en su lugar.</li>
	<li>Coloque el electrodo Ag/AgCl de referencia(Tabla de Materiales)dentro de la boca para que el pellet sinterado descanse a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes. NOTA: Los electrodos de alambre de oro no deben utilizarse como electrodo de referencia de boca, ya que tienen diferentes características de impedancia y aumentan el ruido de pico a pico.</li>
	<li>Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo del ratón, sostenga el soporte del electrodo con el capilar de vidrio vertical, deslice el soporte del electrodo con el dedo índice para eliminar las burbujas que puedan haber sido introducidas. Llene la punta con HBSS con una aguja de 25 G unida a una jeringa e inspeccione para asegurarse de que no haya burbuja de aire atrapada en la punta. Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que la punta abierta de los capilares llenos de HBSS esté en contacto suave con la córnea.</li>
	<li>Tenga especial precaución para evitar la introducción de burbujas de aire sosteniendo el dispensador de gel para los ojos lubricante invertido y deseche las gotas iniciales. Coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.</li>
</ol>6. Grabación DC-ERG
<ol><li>Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Largo Flash No Li."</li>
	<li>Haga clic en Impedancia. Utilice la pantalla Comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Se espera que los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo sean similares (39 ko). Se espera que los valores de impedancia tanto para los electrodos de tierra como para los electrodos de referencia sean inferiores a 10 ko).</li>
	<li>Haga clic en Vista previa para ver los rastros del ojo izquierdo y derecho. Espere a que se alcance una línea de base estable (<10 min). Haga clic en Detener para salir de la vista previa del seguimiento. NOTA: Los cambios bruscos en la dirección de deriva o el ruido aberrante en la grabación no mejorarán con el tiempo y requerirán identificar el electrodo capilar que requiere atención. La causa más probable es una burbuja introducida en la punta del electrodo. Rellene la punta con HBSS. Haga clic en Vista previa de nuevo para comprobar la línea base.</li>
	<li>Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación(Figura 1D).</li>
</ol>7. Exportación de datos
<ol><li>Seleccione el "Paciente" (Nombre de la familia) que describe la grabación del ratón que se va a exportar.</li>
	<li>Haga clic en Pruebas antiguas.</li>
	<li>En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. Haga clic en el botón verde Cargar para cargar los datos adquiridos anteriormente.</li>
	<li>Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para avanzar al paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."</li>
	<li>Haga clic en Exportar.</li>
	<li>Proporcione el nombre de archivo (por ejemplo, nombre de archivo.csv). Un nombre de archivo válido debe comenzar con una letra, seguido de letras, números o guiones bajos. No utilice caracteres especiales ni guiones. El programa de análisis de datos (DCERG_Analysis.exe) requiere que las entradas de tabla cumplan los requisitos para los nombres de variables.</li>
	<li>Coloque una marca de verificación junto a Tabla de datos. Junto al separador, seleccione Tabulador. Coloque las marcas de verificación situadas junto a Opciones (Títulos, Vertical), Incluir todo (Pasos, Chans , Resultados), Columnasde datos (Contenido, Resultados, Barridos) y Formato (Archivo).</li>
	<li>A continuación, haga clic en Exportar (Figura 1E). De este modo, se guarda el archivo *.csv en la carpeta C:-Multifocal.</li>
</ol>8. Análisis de datos
<ol><li>Descargue e instale el instalador en tiempo de ejecución adecuado (Tabla de materiales)</li>
	<li>Descargue e instale el instalador de DCERG_Analysis.exe. NOTA: Esto instala el script que realizará el análisis de los componentes DC-ERG y crea un acceso directo para ejecutar el programa en la carpeta Menú Inicio.</li>
	<li>Haga clic en el acceso directo creado en la carpeta Menú Inicio > Programas.</li>
	<li>Seleccione el archivo o archivos de datos exportados (*.csv) para el análisis. Utilice Ctrl + clic izquierdo en el ratón para seleccionar más de un archivo. NOTA: El archivo ejecutable genera dos tipos de trazados: 1) los datos sin procesar se trazan con una línea de ajuste mejor que indica la deriva medida; 2) la respuesta corregida de deriva se traza después de ser suavizada con una media móvil (con un lapso de 5 s). A partir de esta gráfica se identifican las amplitudes y el tiempo de pico de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. A continuación, los datos se exportan en formato de tabla para sobresalir, donde cada hoja corresponde a una grabación de ratón diferente. Estas hojas van seguidas de dos hojas de resumen: (i) amplitudes de DC-ERG compiladas (mV); (ii) tiempo de pico de DC-ERG compilados (inicio de luz, t a 0 min).</li>
</ol>

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<li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+function%3A+a+role+for+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li>
<li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+%22light-peak+substance%22%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li>
<li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651(2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos
Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alrededor de ...

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris4,5. Las anomalías en la función de la EPH subyacen a numerosas enfermedades de la retina humana, como la degeneración macular relacionada con la edad6,la amaurosis congénita de Leber7,8 y la mejor distrofia macular vitelliforma9. Como los tejidos oculares de los donantes a menudo son difíciles de obtener únicamente con fines de investigación, los modelos animales con modificaciones genéticas pueden proporcionar una forma alternativa de estudiar el desarrollo de enfermedades de la retina10,11. Además, la aparición y aplicación de la tecnología CRISPR cas9 permite ahora introducciones genómicas (knock-in) o eliminaciones (knock-out) en un proceso simple de un solo paso superando las limitaciones de las tecnologías de apuntamiento genético anterior12. La auge en la disponibilidad de los nuevos modelos deratón 13 requiere un protocolo de grabación más eficiente para evaluar de forma no invasiva la función RPE.
La medición de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del RPE se puede lograr mediante una técnica de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG). Cuando se utiliza en combinación con grabaciones ERG convencionales que miden las respuestas celulares del fotorreceptor (onda a) y bipolar (onda b)14, el DC-ERG puede definir cómo cambian las propiedades de respuesta del RPE con la degeneración de la retina15,16,17 o si la disfunción del RPE precede a la pérdida del fotorreceptor. Este protocolo describe un método adaptado del trabajo de Marmorstein, Peachey y sus colegas que desarrollaron por primera vez la técnica DC-ERG16,18,19,20 y mejora la reproducibilidad y facilidad de uso.
La grabación DC-ERG es difícil de realizar debido al largo tiempo de adquisición (9 min) durante el cual cualquier interrupción o introducción de ruido puede complicar la interpretación de los datos. La ventaja de este nuevo método es que las líneas de base alcanzan un estado estable en un período de tiempo más corto reduciendo la probabilidad de que el animal despierte prematuramente de la anestesia y sea menos propenso a la formación de burbujas en los electrodos capilares.

<table><tbody><tr><td>Ag/AgCl (boca) Electrodo</td><td>WPI Inc</td><td>EP1</td><td>Electrodo de referencia de boca para ratón</td></tr><tr><td>Baldosas de cerámica</td><td>Instrumento Sutter</td><td>CTS</td><td>Se utiliza para cortar el tubo capilar de vidrio a un tamaño adecuado</td></tr><tr><td>Varilla de limpieza con punta de algodón</td> Productos <td>médicos puritanos</td><td>867-WC Sin pegamento</td><td>Se utiliza como espaciador para mejorar el ajuste del conjunto del portaelectrodos</td></tr><tr><td>Sistema de electrorretinograma (ERG)</td><td>Sistema Diagnosys LLC</td><td>E3</td><td>Sistema de electrofisiología visual para diagnosticar afecciones oftálmicas en la investigación de la visión y ensayos de medicamentos</td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Argos Technologies</td><td>BW20002460</td><td>O equivalente para dar forma al vidrio bajo llama</td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio (1,5 mm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-75</td><td>Para el llenado con HBSS y el contacto con la córnea</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina tamponada (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>14175-095</td><td>Disponible comercialmente. Mantener en RT</td></tr><tr><td>Filtro en línea</td><td>Whatman</td><td>6722-5001</td><td>Para proteger la bomba de vacío de los aerosoles</td></tr><tr><td>Cable de bajo ruido para soportes de microelectrodos</td><td>WPI Inc</td><td>5372</td><td>Sugerido para mejorar la longitud y la ubicación de los cables y los conjuntos de portaelectrodos</td></tr><tr><td>Rótula magnética</td><td>WPI Inc</td><td>500871</td><td>Para el posicionamiento magnético del conjunto del portaelectrodos en la platina</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>MatLab: Para editar el software de análisis</td></tr><tr><td>MatLab Curvefit Toolbox</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox for MatLab (solo necesario para editar el software de análisis)</td></tr><tr><td>MatLab Compiler</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox for MatLab (solo necesario para editar y volver a publicar el software de análisis)</td></tr><tr><td>MatLab Runtime versión 9.5</td><td>Mathworks</td><td>R2018b (9.5)</td><td>Necesario para ejecutar el software de análisis: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td></tr><tr><td>Soportes de microelectrodos (45 grados)</td><td>WPI Inc</td><td>MEH345-15</td><td>Para sujetar los capilares</td></tr><tr><td>Aguja (calibre 25)</td><td>Covidien</td><td>8881250313</td><td>Para llenar los tubos capilares con HBSS</td></tr><tr><td>Aguja (rectificada) Electrodo</td><td>Rhythmlink</td><td>13mm - un electrodo</td><td>Electrodo de aguja subdérmico (tierra) para ratón (aguja de 13 mm de largo, 0,4 mm de diámetro, cable conductor de 1,5 m)</td></tr><tr><td>Regulador/Acondicionador de potencia</td><td>Furman</td><td>P-1800</td><td>O equivalente para eliminar la compensación de CC del ruido introducido a través de la línea eléctrica</td></tr><tr><td>Jeringa (12 mL)</td><td>Monoyecto</td><td>1181200777</td><td>Para llenar los tubos capilares con HBSS</td></tr><tr><td>T-clip</td><td>Cole-Parmer</td><td>06852-20</td><td>Para el montaje de portaelectrodos</td></tr><tr><td>Desecador</td><td>de vacío Bel-Art</td><td>420120000</td><td>Fondo y cubierta</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de policarbonato transparente<tr><td><fuerte>Tratamiento farmacológico</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel lubricante para ojos</td><td>Alcon</td><td>0078-0429-47</td><td>Ayuda a lubricar la superficie de la córnea y a mantener el contacto eléctrico con los electrodos capilares</td></tr><tr><td>Clorhidrato de fenilefrina 2.5%</td><td>Akorn</td><td>17478-201-15</td><td>Colirio midriático de acción corta (para la dilatación de la pupila)</td></tr><tr><td>Clorhidrato de proparacaína 0.5%</td><td>Akorn</td><td>17478-263-12</td><td>Anestésico local para la instilación oftálmica</td></tr><tr><td>Tropicamida 0.5%</td><td>Akorn</td><td>17478-101-12</td><td>Colirio midriático de acción corta (para la dilatación de la pupila)</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>AnaSed</td><td>sc-362949Rx</td><td>Analgésico y relajante muscular</td></tr><tr><td>Zetamina (Ketamine HCl)</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td>Anestésico para inyecciones intramusculares</td></tr></tbody></table>

electroretinograma de acoplamiento directo (dc-erg) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.
Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.

La Figura 2 es un conjunto de datos de muestra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) y ratones de tipo salvaje (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ son ratones con un nocaut condicional de microRNA 204 en el epitelio pigmentario de la retina. Estos ratones se generan cruzando ratones miR-204 con floxed (producidos por NEIGEF)22 con ratones VMD2-CRE23. MiR-204 se expresa en gran medida en el RPE donde regula la expresión de proteínas críticas para la fun...

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

La técnica DC-ERG se puede utilizar para la evaluación no evasiva de la función de epitelio pigmentario de la retina para monitorear los cambios relacionados con la edad o la progresión de la enfermedad y para evaluar los efectos de la intervención farmacológica. Esta técnica mejora la capacidad de reproducción de DC-ERG y la facilidad de uso simplificando la preparación del electrodo capilar. También se puede complementar con una aplicación de software ohm estándar para facilitar el análisis.Comience deslizando cuidadosamente una aguja de jeringa de calibre 25 a través de la junta de goma de silicona hasta la pared posterior del soporte del electrodo. Llene la base del soporte del electrodo con HBSS desgasificación mientras retrae lentamente la aguja, teniendo cuidado de no introducir burbujas, y reemplace la tapa roscada sin apretar. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro del espacio con HBSS y sostenga el capilar horizontalmente mientras se llena para evitar que la solución escape del otro extremo.Sujetando el capilar lleno en el extremo doblado, inserte lentamente el otro extremo a través de la tapa aflojada y apriete la tapa del tornillo en su lugar. Incline los soportes de electrodos con los electrodos capilares hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan y desgasiquen los capilares en una cámara de vacío durante cinco a 10 minutos. A continuación, suelte lentamente el vacío y rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio, como se ha demostrado.Para hacer un soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, retire los clips poliacetales negros de un lado de un clip en T número ocho y utilice una base de cilindro con juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura. Fije los clips en T modificados a los tornillos magnéticos de montaje de bolas con tuercas de tamaño M3 y un portaobjetos en un mango de madera cónico de aproximadamente una pulgada, modificado desde un palo de limpieza de punta de algodón, en el soporte en un ángulo para fijar el soporte de microelectrodo en el soporte de junta magnética de bola magnética T-clip hecho a medida. A continuación, utilice la base del cilindro de imanes de tierras raras para colocar de forma segura el soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360 grados en un eje de 180 grados.Para realizar una prueba de electrodos, primero, baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en un pequeño recipiente de HBSS. Coloque el electrodo de tierra de la aguja y el electrodo de referencia de pellet centrado en cloruro de plata en el mismo HBSS para completar el circuito y seleccionar o crear un identificador adecuado para describir el ratón que se va a probar. Para seleccionar el protocolo de electroretinograma acoplado directo que se va a realizar, haga clic en los protocolos y seleccione DC-ERG.Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo con la información del paciente. Si la información es correcta, haga clic en Sí y continúe con los pasos uno de seis.Cierre las puertas de la jaula de Faraday y haga clic en la impedancia para mostrar el modo de impedancia. Compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables y haga clic en el paso para continuar con el paso cuatro de seis para probar la estabilidad de línea de base. Para comenzar a ver los seguimientos, haga clic en vista previa.Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud pico a pico de menos de 200 microvoltas. Para colocar el ratón y los electrodos para un experimento, anestesia la córnea de un ratón sedado con una gota de 5%ácido clorhídrico proparacaína antes de dilatar la córnea con una gota de 2,5% fenilefrina HCL y 5%tropicamida. En el software del sistema ERG, verifique que el paciente correcto esté seleccionado.Haga clic en protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG y haga clic en Ejecutar. Haga clic en Sí para comprobar que se está realizando la prueba correcta.Utilice el paso uno de seis para encender una luz roja tenue dentro de la cúpula y coloque el ratón sobre una mesa de grabación con calefacción. Use fórceps para comprar cuidadosamente la piel de la pierna trasera. Y usando una mano para sujetar firmemente el electrodo de la aguja, utilice la otra mano para insertar el electrodo por vía subcutánea en la pierna trasera para asegurar el electrodo en su lugar.Coloque la plata de referencia, electrodo de cloruro de plata en la boca del animal para que el pellet centrado se apoya a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo, coloque el soporte del electrodo con los capilares de vidrio orientados verticalmente y deslice el soporte del electrodo con un dedo índice para eliminar cualquier burbuja que pueda haber sido introducida. Utilice una aguja de calibre 25 para llenar las puntas capilares con HBSS e inspeccione los capilares para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en las puntas.Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que las puntas abiertas de los capilares llenos de HBSS estén en contacto suave con la córnea. Y teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas, invierta el dispensador de gel para los ojos lubricante para desechar las gotas iniciales. A continuación, coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.Para grabar los DC-ERG, haga clic en el paso para seleccionar el paso cinco de seis y haga clic en la impedancia para utilizar la pantalla de comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo deben ser similares. Y los valores de impedancia para los electrodos de tierra y de referencia deben ser inferiores a 10 kilohms.Haga clic en vista previa para ver los trazos de los ojos izquierdo y derecho y espere hasta 10 minutos para que se logre una línea base estable. A continuación, haga clic en Detener para salir de la vista previa de seguimiento y haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación. Aquí, se muestra un conjunto de datos de ejemplo de ratones condicionales knockout y de tipo salvaje.En este análisis, el rastro sufría de burbujas di minutos en el electrodo. Aumentó el ruido pico a pico en la traza. En un análisis separado, las burbujas se eliminaron utilizando la cámara de vacío antes de ensamblar los microelectrodos dentro de los soportes del soporte del electrodo.Se pueden calcular las mejores líneas de ajuste a los 25 segundos iniciales, lo que permite volver a trazar las respuestas corregidas por deriva y identificar las amplitudes de los componentes DC-ERG. Como era de esperar, la reducción de la expresión de los canales de potasio de cura 7.1 en el RPE atenúa en gran medida la onda c y la oscilación rápida, lo que indica un deterioro significativo de las propiedades eléctricas del epitelio pigmentario de la retina. Aquí, se muestran las amplitudes relativas de los componentes DC-ERG, normalizados a de tipo salvaje y trazados contra las dos amplitudes de onda a evocadas por luz más grandes.Esta forma de análisis puede determinar si las respuestas eléctricas reducidas del IR se pueden tener en cuenta mediante la reducción de la actividad del fotorreceptor solo. O si hay un defecto subyacente que se origina en el RPE. Recuerde lograr una línea de base estable antes de pasar a la grabación del ratón y volver a insertar los electrodos periódicamente para las burbujas que pueden haber sido introducidas.Los ERG adaptados a la oscuridad se pueden grabar antes del DC-ERG para medir la función de retina impulsada por el cono. Los ERG adaptados a la luz también se pueden realizar después del DC-ERG para evaluar las respuestas de la retina impulsadas por el cono.

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Investigación

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En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de...

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Le mostraremos cómo registrar las respuestas de flash de conos ratón utilizando un electrodo de succión.

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Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

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Registro electrofisiológico de las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de la retina de Drosophila a los estímulos luminosos

Este video muestra cómo registrar el electrorretinograma (ERG) y el potencial evocado visual (VEP) en una rata consciente. La rata, con electrodos implantados quirúrgicamente, se adapta primero a la oscuridad. Después de aplicar las gotas dilatadoras, el animal se coloca en un sujetador y se coloca en un recipiente Ganzfeld. A continuación, se registran las señales ERG y VEP.

Registro del electrorretinograma y del potencial evocado visual en una rata

Este video muestra la grabación de un electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) en un epitelio pigmentario de la retina (EPR) de ratón anestesiado y adaptado a la oscuridad. Después de aplicar gotas dilatadoras, el animal se coloca en una configuración de registro y el electrodo capilar lleno de un tampón de sal se coloca en la córnea. Después de establecer la línea de base, se registra el DC-ERG.

Registro de electrorretinograma de acoplamiento directo del epitelio pigmentario de la retina en un ratón

El electrorretinograma (ERG) es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz. En este trabajo se describe cómo utilizar el ERG para evaluar la función de la retina, en ratas adaptadas a la oscuridad, y cómo se puede utilizar para evaluar una intervención neuroprotectora, en el presente caso el precondicionamiento isquémico a distancia.

Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Ex vivo ERG se puede utilizar para registrar la actividad eléctrica de las células de la retina directamente a partir de retinas intactas aisladas de animales o humanos. Demostramos aquí cómo los sistemas ERG in vivo comunes se pueden adaptar para registros ERG ex vivo con el fin de diseccionar la actividad eléctrica de las células de la retina.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

Este protocolo describe la medición simultánea del electrorretinograma y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas.

Grabación simultánea de Electrorretinografía y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas

Adherirse a los estándares internacionales y mantener la adaptación oscura de la retina son fundamentales para adquirir respuestas válidas de electrorretinogramas de campo completo en el diagnóstico y manejo de enfermedades hereditarias de la retina. Se proporciona un protocolo práctico con un cuarto oscuro portátil para obtener electroretinograma de campo completo para bebés y niños bajo sedación o anestesia general en el entorno del quirófano.

Grabación de electrorretinogramas para bebés y niños bajo anestesia para lograr una adaptación óptima de la oscuridad y estándares internacionales

La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

Aprende a realizar electroretinogramas de acoplamiento directo para evaluar la función del epitelio pigmentario retiniano en ratones. Este protocolo mejorado reduce el ruido mediante desgasificación al vacío y facilita el estudio de enfermedades oculares.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón (Video) | JoVE Journal

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

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