Name: Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a realizar electrofisiología inalámbrica y pruebas de memoria simultáneas en ratas para estudiar la neurogénesis del hipocampo. Este método integra EEG y seguimiento conductual en tiempo real.

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Queremos agradecer al Sr. Miguel Burgos y al Sr. Gustavo Lago por brindar asistencia técnica. Agradecemos a Stoelting Co. por cubrir los costos de producción de video, Jinga-hi, Inc. por brindar asistencia técnica, y a la División de Investigación y Posgrado de la Universidad Iberoamericana Ciudad de México por otorgar fondos para este trabajo.

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<li>Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contextual+and+cued+fear+conditioning+test+using+a+video+analyzing+system+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50871(2014).</li>
<li>Zheng, W., Ycu, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+automated+and+highly+versatile+system+for+testing+multi-cognitive+functions+and+recording+neuronal+activities+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A fully automated and highly versatile system for testing multi-cognitive functions and recording neuronal activities in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3685(2012).</li>
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<li>Medlej, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+setup+for+wired+continuous+long-term+EEG+monitoring+in+juvenile+and+adult+rats%3A+application+for+epilepsy+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced setup for wired continuous long-term EEG monitoring in juvenile and adult rats: application for epilepsy and other disorders.</a> BMC Neuroscience. 20, 8(2019).</li>
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</ol>

Sylvia Ortega-Martínez trabaja como empleada de Stoelting Co., una compañía que proporcionó y patrocinó la producción y el acceso abierto a este artículo.

La investigación conductual y de electroencefalografía es difícil y desafiante por naturaleza. Por lo tanto, la combinación de ambas técnicas presenta pasos críticos significativos. Por lo tanto, ambas técnicas concurrentes no se utilizan ampliamente. En la práctica real, cada grupo en todo el mundo realiza pruebas de comportamiento con condiciones especiales, como animales, parámetros analizados o tratamientos. Lo anterior crea controversias significativas en el campo y la necesidad de desarrollar procedimientos estándar disponibles para todos. Aquí, hemos preparado este procedimiento detallado con todos los pasos críticos y consideraciones metodológicas que generalmente no se describen o mencionan en la mayoría de los artículos publicados. Estos se discuten a continuación.
La producción de los materiales necesarios es un paso fundamental en el éxito de esta técnica. En este sentido, el electrodo debe construirse desde cero utilizando tornillos de acero inoxidable, cables de cobre y soldador de plata. Estos materiales son difíciles de soldar entre sí de forma permanente, de tal manera que la conductividad y la resistencia de cada electrodo deben verificarse antes de su uso. Es posible utilizar otro tipo de cable para el conjunto del electrodo; Sin embargo, el cobre es lo suficientemente flexible como para manipular el electrodo para insertarlo en el conector del amplificador. En este sentido, el uso de electrodos comerciales es deseable, pero su adquisición podría ser complicada y costosa. La cirugía es uno de los pasos más críticos en este protocolo. Es muy recomendable e incluso necesario contar con un cirujano experimentado, especialmente para la implantación de electrodos. Dado que la cirugía con frecuencia requiere alargar el tiempo de anestesia y, a veces, una aplicación de soldadura durante la cirugía, cada laboratorio debe realizar las pruebas necesarias con la anestesia adecuada (se pueden usar diferentes cócteles) para cada cepa de roedores, particularmente en condiciones de vivero, diferencias entre camadas e incluso diferencias individuales entre animales. La planificación y consideración adecuadas podrían evitar la pérdida de animales durante las cirugías. La implantación de electrodos es otro paso crucial. Requiere mucho cuidado para evitar golpear el cráneo y dañar las meninges o el tejido cerebral. Los tornillos deben colocarse correctamente, es decir, completamente fijados en el cráneo, de lo contrario, el ruido y los artefactos se presentarán en las señales, como las relacionadas con una pésima colocación o movimiento que no utiliza la grabación del EEG. El tratamiento y las condiciones pre y postoperatorias siempre deben realizarse y observarse para evitar el sufrimiento del roedor. La lidocaína subcutánea se puede usar en la piel de la cabeza antes de hacer la incisión con el bisturí. Una gota de solución salina en los ojos del animal ayudará a prevenir la sequedad. Además, se debe administrar una solución salina en la boca, y después de la cirugía, se debe administrar 1 ml por vía subcutánea o intraperitoneal para compensar el equilibrio de líquidos del animal y prevenir la deshidratación. Inmediatamente después de la cirugía, se debe administrar un medicamento antiinflamatorio (para reducir el dolor), así como antibióticos a través de antibióticos subcutáneos o tópicos, directamente en la periferia del cuero cabelludo donde se encuentra la tapa de cemento dental (para disminuir la probabilidad de infección). Repita el procedimiento anterior 24 h después de la cirugía. El posicionamiento del amplificador de EEG en la espalda del animal es la principal dificultad para la grabación simultánea. El diseño y la fabricación de un chaleco se basan específicamente en el tamaño de los animales. El chaleco debe permitir el movimiento natural del roedor (ver Figura 5). Esto último garantizará la principal ventaja de la técnica, que es el registro de movimientos libres. Dado que los animales no intentaron quitarse el chaleco, el conector de la cabeza o los cables después de la cirugía y durante los días posteriores, se presume que la configuración no generó restricción de movimiento significativamente ni causó dolor o incomodidad. Para una correcta segmentación del EEG en épocas basada en eventos marcados por el BTS es obligatorio anotar un protocolo bien definido. Las marcas temporales podrían combinarse mediante manipulación de series temporales porque ambos sistemas utilizan el mismo reloj para configurar sus marcas de tiempo. Lo anterior amplía las posibilidades de experimentación animal incorporando datos electrofisiológicos para su análisis.
La técnica aquí presentada se puede utilizar en cualquier área de investigación en neurociencia y con las especies murinas más comunes e incluso otras especies. La versatilidad del software de seguimiento de comportamiento es una de las ventajas más significativas, ya que podría usarse en una gran versatilidad de laberintos como el laberinto de agua Morris, campo abierto, reconocimiento de objetos novedosos, preferencia de lugar condicionado, tablero de agujeros, laberinto elevado plus, laberinto en Y, laberinto de brazo radial, laberinto de Barnes y otros. Se pueden utilizar hasta 16 cámaras simultáneamente. Además, se pueden informar cientos de medidas diferentes (para obtener información más detallada, consulte los manuales31,32). Tenga en cuenta que este trabajo describe la experimentación para grabaciones de EEG, algunas otras técnicas como los potenciales de campos locales o la grabación de una sola unidad son posibles. Sin embargo, los usuarios deben tener en cuenta que la configuración general y varios pasos preparatorios deben cambiar para otros fines. Entonces, cuando esta técnica se usa junto con la grabación de EEG Wi-Fi, las posibilidades se amplían, porque agrega nuevas perspectivas a estudios en animales como los realizados en seres humanos para evaluar varias características de la integración y dinámica del EEG, como la conectividad, la potencia de la banda EEG o las respuestas evocadas. A diferencia de los seres humanos, la experimentación animal es posible para evaluar la administración de fármacos, modificaciones genéticas o expresión, entre muchos otros paradigmas experimentales. Para el análisis de EEG, considere que algunos protocolos tienen un número muy bajo de repeticiones de los comportamientos deseados, lo que restringe la posibilidad de promediar respuestas y obtener resultados confiables. Por lo tanto, tenga cuidado de diseñar los protocolos de grabación y análisis que se considera realizar antes de comenzar el experimento. Sin embargo, debe contemplarse que trabajar en experimentación animal no es posible para evitar el movimiento, aumentando la complejidad del protocolo experimental y las consideraciones para el análisis de señales y tareas conductuales. Actualmente, los equipos para sistemas completos de seguimiento y grabaciones de EEG no están estandarizados ni modulares, lo que significa que su configuración está destinada a un solo protocolo y adaptaciones para explorar otras tareas de comportamiento, lo que implica / sugiere mayores costos para un gran número de laboratorios. Esta situación podría resolverse siguiendo las opciones explicadas en este estudio. Sin embargo, se podrían realizar varias mejoras para experimentos más confiables. El trabajo se puede mejorar en varios pasos, desde la fabricación de electrodos hasta el procesamiento de señales y comportamiento. No obstante, está demostrado que el seguimiento de animales y la adquisición de EEG son posibles utilizando una configuración asequible de alta tecnología pero económica.
En resumen, el presente trabajo es un intento de ayudar a los científicos, particularmente en el campo de las neurociencias, a poder utilizar estas dos técnicas que no se usan comúnmente en combinación. La técnica de grabación simultánea de EEG y pruebas de comportamiento utilizando software de seguimiento del comportamiento tiene muchas ventajas, y puede ser particularmente útil en muchos campos de la neurociencia, particularmente en áreas de aprendizaje y memoria. Teniendo en cuenta que este equipo tiene otras capacidades como un registro profundo de estructuras subcorticales como el hipocampo, pero como se mencionó, varios pasos preparatorios cambiarán. Los equipos inalámbricos resuelven casi todas las limitaciones de un enfoque de cable convencional, como los problemas de movilidad de los animales de una jaula a otra, los animales obstaculizados o enredados con los cables. Esta técnica de configuración es fácil de usar, como se describió anteriormente, y un grupo de expertos o individuos casi no capacitados o no especializados puede usar este software. El precio del equipo de EEG es más bajo que un amplificador de EEG regular. El software de seguimiento del comportamiento es también uno de los programas más asequibles para el seguimiento de video en el mercado. Este software requiere licencias anuales. El equipo se puede utilizar en más de una configuración experimental, diferentes animales y el tipo de versatilidad. Esperamos que este esfuerzo ayude a la comunidad científica y proporcione un fácil acceso para estudiar simultáneamente el comportamiento y la electroencefalografía.

La prueba de comportamiento es crucial en la investigación en neurociencia para una gran cantidad de información generada en un contexto in vivo. En este sentido, los investigadores han estado utilizando ampliamente diferentes pruebas de comportamiento para analizar la función sensorio-motora, las interacciones sociales, el comportamiento similar a la ansiedad y depresivo, la dependencia de sustancias y diversas formas de funciones cognitivas1. El registro manual de las pruebas de comportamiento puede ser difícil, agotador e inexacto incluso para la mayoría de los observadores expertos. A pesar de que se han hecho algunos esfuerzos para desarrollar software libre y de código abierto para el registro del comportamiento (por ejemplo, la aplicación sexrat macho2 para el comportamiento sexual), varias alternativas permiten el registro automático y en tiempo real del comportamiento de diferentes especies animales, desde peces3 hasta roedores 4,5,6. El seguimiento de vídeo es un método valioso para la grabación rápida y precisa del comportamiento utilizado en una amplia variedad de aplicaciones7. Una característica más potencial en el área de registro del comportamiento es explorar la actividad neuronal durante la manifestación del comportamiento. El registro simultáneo de la actividad neuronal (desde células individuales hasta las principales áreas cerebrales) y tareas conductuales podría mostrarnos cómo el cerebro genera patrones de comportamiento específicos8. Los comportamientos son una secuencia de componentes menores que podrían revelar correlaciones entre la actividad neuronal y los movimientos o acciones. Si la actividad neuronal y los patrones de comportamiento pudieran registrarse simultáneamente a través de múltiples escalas de tiempo, podrían explicar cómo cada estado cerebral se correlaciona con cada comportamiento particular (para un examen más profundo del registro del comportamiento, consulte Datta et al., revisión8 de 2019). Por lo tanto, el registro sincronizado de la actividad conductual y neuronal a la escala deseada (desde neuronas hasta grandes áreas del cerebro) se considera una herramienta extremadamente útil. Existen varios sistemas destinados a integrar registros conductuales con otras mediciones como la actividad neuronal 4,5.
Aunque la electroencefalografía es considerada una de las técnicas más utilizadas en el campo de la neurociencia clínica y de investigación, la movilidad relativamente alta, así como el tamaño del dispositivo de registro de EEG, hace que esta técnica sea única y desafiante para la detección en el caso de modelos in vivo9. Se han desarrollado algunas soluciones a este problema, por ejemplo, el uso de cables y dispositivos giratorios que permiten a los animales moverse libremente en la arena. Sin embargo, los sistemas basados en cables a menudo imponen problemas para realizar estudios, por ejemplo, durante la transferencia de un animal de una jaula a otra, se observa un obstáculo o enredo del animal con los cables. Se han desarrollado dispositivos telemétricos para grabaciones electrofisiológicas inalámbricas para aumentar la flexibilidad de la situación de registro10,11. Sin embargo, estos sistemas han mostrado limitaciones considerables debido a su bajo número de canales de grabación y bajas frecuencias de muestreo11. En este estudio, utilizamos un sistema inalámbrico disponible comercialmente que envía señales de EEG del animal a través de una conexión Wi-Fi con un sistema de roedores que se mueve libremente12. El aparato pesa 6 gramos y soporta hasta 16 canales registrados a 1 kSps. Este sistema permite el registro de EEG o picos en el entorno animal, con una perturbación reducida, sirviendo como una solución económica en comparación con los sistemas electrofisiológicos tradicionales en el mercado. Además, hemos sincronizado estos datos utilizando un software de seguimiento de video para proporcionar correlación entre EEG y patrones de comportamiento. Esta sincronización se realiza fuera de línea mediante la alineación e interpolación de datos y eventos en función de las marcas de tiempo generadas por ambos sistemas y se procesa en MATLAB.
La neurogénesis adulta se define como la proliferación, supervivencia y diferenciación en neuronas de células recién generadas en el giro dentado de animales13,14. Se sabe que este proceso está asociado con la mejora de la memoria y el aprendizaje, lo que aumenta la neurogénesis adulta en roedores a través de condiciones de ambiente enriquecido (EE)15. La EE consiste en alojar roedores en pequeños grupos dentro de una gran jaula provista de juguetes y tubos, donde los animales tienen novedad y complejidad pero sin relevancia biológica15. Aunque la EE estimula la neurogénesis del hipocampo, también varía en muchos factores, como la edad, la tensión animal, las condiciones de estimulación específicas o el procedimiento de detección de neurogénesis. En ratones de mediana edad expuestos al alojamiento de EE durante siete días, se ha reportado el nacimiento de nuevas células granulares (GC) en el giro dentado del hipocampo (DG)16. Los estudios que intentan extirpar selectivamente la neurogénesis adulta en ratas adultas han sugerido que se requieren nuevas células granulares de aproximadamente 1 a 2 semanas de edad en la respuesta aprendida17. Alrededor de 2 o 3 semanas después del nacimiento de la GC en adultos DG, comienzan a aparecer varios rasgos característicos, como las espinas dendríticas, que son esenciales para la transmisión sináptica excitatoria18. Zhao et al. realizaron un análisis cuantitativo para mostrar que el pico de crecimiento de la columna vertebral ocurre durante las primeras 3 - 4 semanas19. Varios estudios electrofisiológicos in vivo sugieren que sólo tres semanas de condiciones de alojamiento EE producen alteraciones en la transmisión sináptica del DG y aumentan la excitabilidad celular20. Además, se ha informado que la exposición a un ambiente enriquecido a las 1-4 semanas después de las inyecciones de BrdU aumentó significativamente la densidad de las células BrdU / NeuN en la capa granular DG en ratones21. Estos autores sugieren que existe un período crítico entre una y tres semanas después de la exposición a EE, ya que se observó un aumento sustancial en el número de nuevas neuronas21. Los estudios de neurogénesis del hipocampo adulto (AHN) en humanos han sido controvertidos ya que no hubo evidencia directa. Sin embargo, un informe reciente describió las etapas de desarrollo de la AHN en el cerebro humano adulto, identificando miles de neuronas inmaduras en la DG, y demostrando así la importancia de la AHN durante el envejecimiento en humanos22. Sobre la base de la evidencia mencionada anteriormente, el estudio de la AHN en modelos animales es más importante que nunca (para un examen más profundo de la AHN, véase Leal-Galicia et al., revisión15 de 2019).
Como se mencionó anteriormente, el hipocampo se ha relacionado con una función fundamental en las capacidades de aprendizaje y memoria. La formación de memorias pasa por tres procesos distintos: codificación (adquisición de memoria), consolidación (almacenamiento de memoria) y recuperación (reconocimiento de memoria)23. La memoria de reconocimiento en humanos se prueba utilizando la tarea24 de comparaciones pareadas visuales. Los fundamentos de los modelos humanos y animales de memoria y amnesia son las pruebas de comportamiento que evalúan la capacidad de reconocer un estímulo previamente presentado25,26, como lo hace la tarea de comparaciones visuales pareadas en humanos. Por lo tanto, una de las pruebas de comportamiento más utilizadas para evaluar la capacidad de un roedor para reconocer un estímulo previamente presentado, es decir, la capacidad de aprendizaje y memoria es la tarea espontánea de reconocimiento de objetos novedosos (NORT)23,27. El protocolo NORT consiste en dos objetos novedosos idénticos en un ámbito familiar durante 10 minutos en la prueba de adquisición. Después de un tiempo específico entre 0 28 y48 horas29 (tiempo variable según cada protocolo), el animal es devuelto a la misma arena que contiene uno de los mismos objetos familiares y un objeto novedoso. El animal explora espontáneamente el objeto novedoso si el objeto familiar fue memorizado26. La relación de preferencia se utiliza comúnmente para evaluar el rendimiento de la exploración. Se determina dividiendo el tiempo total de exploración del objeto del tiempo de exploración del objeto nuevo o familiar. El NORT tiene algunas ventajas sobre otras pruebas de memoria de reconocimiento. Lo más importante es que no requiere motivación externa, recompensa o castigo. No genera condiciones estresantes. Finalmente, no se necesita entrenamiento para evocar el comportamiento de explorar los objetos (para un examen más profundo de NORT, ver ref.23).
Por lo tanto, el registro simultáneo de múltiples modalidades de datos y su integración en el estudio del aprendizaje y la memoria, como efecto de la neurogénesis del hipocampo adulto, es muy atractivo y proporciona una solución convincente para los investigadores en el campo. El presente trabajo expondrá todos los procesos involucrados en la evaluación simultánea del seguimiento de video conductual (tarea de reconocimiento de objetos novedosos) y la grabación inalámbrica de electroencefalografía. Aquí hemos revisado el proceso de fabricación de electrodos, la cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo), el protocolo de enriquecimiento ambiental (para la inducción de neurogénesis del hipocampo), siguiendo el protocolo NORT, la configuración BTS, el acoplamiento EEG – BTS para la monitorización simultánea en tiempo real, y el análisis de datos de EEG y comportamiento ejecutados en el entorno informático MATLAB.

<table><tbody><tr><td>#2 Punta de herramienta rotativa de velocidad variable</td><td>Reordenar #310048, Longitud 44.5mm</td><td>SS Blanco</td><td>Para hacer los agujeros donde se insertarán los tornillos</td></tr><tr><td>#4 Bisturí y hoja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 X 50 X 50 cm Campo Abierto Negro Mate Arena</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 pines Carcasa de receptáculo hembra</td><td>Amphenol FCI</td><td>10147606-00008LF</td><td></td></tr><tr><td>8 pines Carcasa de receptáculo macho</td><td>Amphenol FCI</td><td>10147603-00008LF</td><td></td></tr><tr><td>Resina Acrílica</td><td>MDC Dental</td><td>NicTone</td><td>Para la fijación de los tornillos al cráneo</td></tr><tr><td>ANY-maze software de seguimiento de video</td><td>Stoelting, Co.</td><td>versión 6.1</td><td>http://www.anymaze.co.uk/)</td></tr>solución <tr><td>antiséptica de cloruro de benzalconio</td><td>Benzal</td><td>Benzal</td><td></td></tr><tr><td>Abrazaderas Bulldog</td><td>Cientifica VelaQuin</td><td></td><td>Para retraer la piel</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Logitech</td><td>c920</td><td></td></tr><tr><td>Alambre</td><td></td><td></td><td></td>de cobre</tr><tr><td>Contacto de crimpado</td><td>Amphenol FCI</td><td>10147604-01LF</td><td></td></tr><tr><td>PC DELL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DELL Electrodo</td> JAGA16 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jinga-Hi, Inc.</td><td>JAGA16</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>PiSA Agropecuaria</td><td>ANESKET</td><td>Para la anestesia</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>R2020a</td><td>MathWorks</td><td>Script fue desarrollado en colaboración con Jinga-Hi, Inc.</td></tr><tr><td>Monómero</td><td>MDC Dental</td><td>NicTone</td><td>Para fijar los tornillos al cráneo</td></tr><tr><td>Software Neurophys</td><td>Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC</td><td>Neurosys 3.0.0.7</td><td></td></tr><tr><td>Atornillado</td><td></td><td></td><td>Para insertar los tornillos en el cráneo</td></tr><tr><td>Tornillos Tornillos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>equipados con electrodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento</td> <td>estereotáxicoKOPF</td><td></td><td>Para la cirugía</td></tr><tr><td>Herramienta rotativa de velocidad variable</td><td>Dremel 3000</td><td>Dremel</td><td>Para hacer los orificios donde se insertarán los tornillos</td></tr><tr><td>Voltímetro</td><td>PROAM</td><td>MUL-040</td><td>Para confirmar que el electrodo conduce la electricidad</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>PiSA Agropecuaria</td><td>PROCIN</td><td>Para anestesia</td></tr></tbody></table>

monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

Simultaneous Monitoring of Wireless Electrophysiology and Memory Behavioral Test as a Tool to Study Hippocampal Neurogenesis

La amplitud de las ondas cerebrales obtenida de la electroencefalografía (EEG) ha sido bien reconocida como una base para la capacidad cognitiva, la memoria y el aprendizaje en animales y humanos. El mecanismo de neurogénesis adulta también está relacionado con la mejora de la memoria y el aprendizaje. Tradicionalmente, los investigadores solían evaluar los parámetros de aprendizaje y memoria en modelos de roedores mediante tareas de comportamiento. Por lo tanto, el monitoreo simultáneo de los cambios de comportamiento y el EEG es particularmente interesante para correlacionar los datos entre la actividad cerebral y los comportamientos relacionados con las tareas. Sin embargo, la mayoría de los equipos necesarios para realizar ambos estudios son complejos, costosos o utilizan una red de configuración cableada que dificulta el movimiento de los animales naturales. En este estudio, el EEG se registró con un dispositivo de electrofisiología inalámbrico junto con la ejecución de una nueva tarea de reconocimiento de objetos (NORT). El comportamiento del animal fue monitoreado simultáneamente por un sistema de seguimiento de video. Ambas grabaciones se analizaron fuera de línea por sus marcas de tiempo que se sincronizaron para vincular las señales de EEG con las acciones del animal. Los sujetos consisten en ratas Wistar adultas después de un tratamiento de enriquecimiento ambiental a mediano plazo. Seis electrodos de tornillo de cráneo se fijaron en pares en ambos hemisferios sobre las regiones frontal, central y parietal y se hizo referencia a un electrodo ubicado en la parte posterior del hueso nasal. El protocolo NORT consiste en exponer al animal a dos objetos idénticos durante 10 min. Después de 2 h y 24 h, uno de los objetos fue reemplazado por uno novedoso. El tiempo de exploración de cada objeto fue monitoreado por un software de seguimiento del comportamiento (BTS) y el registro de datos de EEG. El análisis del EEG sincronizado con datos de comportamiento consiste en estimaciones de la potencia de banda relativa alfa y beta y comparaciones entre el reconocimiento de objetos novedosos frente a la exploración de objetos familiares, entre tres etapas experimentales. En este manuscrito, hemos discutido el proceso de fabricación de electrodos, la cirugía de implantación de electrodos epidurales, el protocolo de enriquecimiento ambiental, el protocolo NORT, la configuración BTS, el acoplamiento EEG – BTS para monitoreo simultáneo en tiempo real y el análisis de datos de EEG basado en la detección automática de eventos.

Los métodos descritos anteriormente se aplicaron para registrar el EEG y la actividad de ratas simultáneamente después del tratamiento de enriquecimiento ambiental. Las ratas Wistar macho de tres meses de edad estuvieron bajo un protocolo de tratamiento de enriquecimiento ambiental a mediano plazo durante 20 días, y fueron operadas para fijar seis electrodos de tornillo de cráneo emparejados en regiones frontales, centrales y parietales referenciadas a un séptimo electrodo ubicado en Nueva Zelanda. Los animales se mantuvieron en condiciones naturales de luz oscura, con acceso ad libitum a alimentos y agua. Este trabajo muestra la integración entre el sistema de EEG y el software de seguimiento del comportamiento para una grabación simultánea en vivo. Solo utilizamos animales tratados bajo protocolo EE ya que no pretendemos comparar la efectividad del tratamiento, sino que solo ejemplificamos las ventajas del equipo. Como evidencia de que el protocolo de alojamiento de enriquecimiento ambiental de 20 días utilizado estimula la neurogénesis adulta, presentamos datos de recuento de células BrdU positivas de animales bajo EE y animales alojados en condiciones estándar a partir de datos no publicados de nuestro laboratorio. Se utilizaron ratas Wistar macho de tres meses de edad. Se les inyectó tres veces BrdU con 12 h entre sí. Los animales fueron anestesiados (pentobarbital [50 mg/kg, i.p.) y sacrificados por perfusión transcárdica (ver Figura 5). Para garantizar que el chaleco conectado al dispositivo EEG no limite los movimientos de los animales, realizamos la prueba de campo abierto (OFT) en dos grupos, un grupo se sometió a cirugía mientras usaba el equipo (chaleco y amplificador de EEG), y el otro grupo de animales permaneció intacto sin usar el hardware. No encontramos diferencias significativas en la distancia recorrida por los animales en 10 min de prueba (ver Figura 5). El protocolo NORT típico consiste en la presentación de dos objetos y la sustitución de uno de ellos por un nuevo objeto. El software de seguimiento del comportamiento monitoreó el tiempo de exploración.
El software de seguimiento del comportamiento registró un grupo de animales para evaluar sus parámetros clave de rendimiento. Por lo tanto, utilizamos tres parámetros para evaluar el rendimiento de la exploración. La relación de preferencia se calculó utilizando el tiempo de cabeza de los animales pasado en la zona del objeto, que informa la cantidad total de tiempo que la cabeza de los animales pasó en cada objeto. Además, calculamos una relación de preferencia para el tiempo dedicado a moverse hacia los objetos, que muestra la cantidad total de tiempo dedicado a cada animal que se movía hacia cada zona del objeto. Además, se calculó el tiempo empleado por visita a cada objeto. La figura 6 muestra los resultados de tres parámetros mencionados anteriormente. En el ensayo de adquisición, no hubo distinciones entre objetos en los tres parámetros evaluados: tiempo de cabeza en la zona de objetos para los tres ensayos, tiempo de movimiento hacia los objetos para los tres ensayos y tiempo por visita en cada objeto. No hubo diferencias en el ensayo STM. Mientras tanto, en el ensayo LTM, se observó una relación de preferencia de exploración significativamente mayor para el nuevo objeto. Además, en el ensayo LTM, también se pudo ver una preferencia por el objeto novedoso en el tiempo dedicado por visita (panel C). El video 1 muestra un ejemplo representativo de una rata grabada en el experimento, mientras que el video 2 muestra un ejemplo representativo de EEG simultáneo y grabación conductual.
Fue posible hacer coincidir los eventos de tiempo rastreados con el seguimiento del comportamiento y la grabación del software EEG utilizando el reloj de la computadora. La Figura 7 y la Figura 8 muestran los cambios en la potencia relativa del EEG sobre las bandas alfa y beta. Estos están relacionados con el control motor, la concentración y la memoria, lo que sugiere que la exploración solo está relacionada con estas funciones. Los resultados del animal 3 muestran que la potencia alfa tiende a reducirse en STM con respecto a ACQ y LTM, lo que sugiere una desincronización relacionada con la exploración o recuperación de la memoria. El número de reconocimiento de objetos (épocas procesadas) fue bajo. En este punto, no es posible determinar si una prueba estadística validaría si tal diferencia es real, o si un artefacto fue capaz de producir tales condiciones experimentales. Sin embargo, la segmentación, el etiquetado y el análisis de épocas se han hecho posibles gracias a una línea de tiempo de eventos de marcado simultáneos en animales y resultados de EEG producidos para futuros proyectos de investigación. La combinación de estos sistemas evita una identificación errónea de eventos mediante un proceso de marcado manual, que se ha convertido en un problema importante para fines de experimentación animal. La combinación del BTS y la actividad electrofisiológica (EP) podría asociarse con precisión con el comportamiento animal; Sin embargo, las condiciones experimentales requieren el uso de técnicas avanzadas de procesamiento de señales para eliminar los artefactos de movimiento y realizar mejoras en la configuración experimental de manera efectiva.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplos de condiciones de ambiente enriquecido (EE) en jaula. El alojamiento fue provisto de juguetes y tubos, en los que los animales encuentran novedosos y complejos, pero sin relevancia biológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig02.jpg"> Figura 2: Posiciones de los electrodos epidurales en el cráneo de la rata. Los tornillos se utilizaron simultáneamente como anclaje para los auriculares y como electrodos. F = frontal; C = frontoparietal; P = parietal; 3 = izquierda; 4 = derecha; NZ = como referencia terrestre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas de una cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo). Imagen que muestra electrodos intracraneales implantados en ratas en diferentes etapas de la cirugía. Asegúrese de que se siguen técnicas asépticas mientras realiza este procedimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes representativas de una rata junto con la configuración experimental. La rata fue obligada a usar el chaleco conectado al dispositivo EEG con una batería incorporada, dentro de la arena utilizada para el protocolo NORT. La imagen muestra el auricular y el conector del cable instalado en la rata de la cabeza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig05.jpg"> Figura 5: Evidencia de capacidad de movimiento y estimulación de neurogénesis adulta por protocolo EE. (A) Imágenes representativas de la actividad animal durante 10 minutos en la prueba de campo abierto (OFT) y la distancia media que recorrieron los animales que llevaban el equipo/cirugía, y los animales sin el equipo/sin cirugía. (B-E) Sección DG representativa con celdas marcadas con BrdU (oscuridad intensa) para EE y grupos de vivienda estándar. Los paneles B y D muestran un bajo aumento del DG, y los paneles C y E muestran el área de la caja con mayor aumento. Los paneles B y C son tejidos del grupo de viviendas EE, los paneles D y E son del grupo de viviendas estándar. El recuadro ilustra el número promedio de celdas marcadas en ambos grupos. ML - capa molecular; GCL – capa de células granulares; SGZ – zona subgranular; flechas - Celdas BrdU+. Los gráficos muestran la media ± SEM. Se utilizó la prueba T-student para comparar grupos. * p≤0,05. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos en la prueba de campo abierto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig06.jpg"> Figura 6: Rendimiento de exploración en la evaluación NORT. (A) Tiempo de cabeza en la zona de objetos para los tres ensayos. (B) El tiempo se mueve hacia los objetos para los tres juicios. (C) Tiempo por visita en cada objeto. Los gráficos muestran la media ± SEM. Se utilizó ANOVA de medidas repetidas bidireccionales con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak en todos los parámetros. * p≤0.05, ** p≤0.01 entre los objetos en el ensayo respectivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig07.jpg"> Figura 7: Cambios sobre la potencia de la banda alfa EEG asociada con la exploración. Esta figura muestra cambios en la potencia alfa relativa, de medio segundo a 2,5 después de que el animal comienza la exploración de los objetos. Los seis gráficos correspondían a electrodos frontal, central y parietal (de arriba a abajo) y lados izquierdo y derecho. Los diagramas de caja muestran la distribución de dichas series temporales para cada combinación de condiciones de un objeto: "familiar" y "novela", y etapa: "ACQ", "STM" y "LTM". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61494/61494fig08.jpg"> Figura 8: Cambios sobre la potencia de la banda beta EEG asociada con la exploración. Esta figura muestra cambios en la potencia beta relativa, de medio segundo a 2,5 después de que el animal comienza la exploración de los objetos. Los seis gráficos correspondían a electrodos frontal, central y parietal (de arriba a abajo) y lados izquierdo y derecho. Los diagramas de caja muestran la distribución de dichas series temporales para cada combinación de condiciones de un objeto: "familiar" y "novela", y etapa: "ACQ", "STM" y "LTM". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61494/61494fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video 1: Video representativo que muestra una rata grabada en el experimento. La rata estaba dentro de la arena utilizada para el protocolo NORT. La rata llevaba el chaleco conectado al dispositivo EEG con una batería incorporada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61494/VIDEO_1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Video representativo que muestra EEG simultáneo y grabación de comportamiento. La señal de EEG se mostró en el lado izquierdo, mientras que la prueba de comportamiento (NORT) se mostró en el lado derecho del video. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61494/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

El protocolo presentado aquí proporciona información sobre la electroencefalografía simultánea (EEG) y la evaluación del comportamiento en tiempo real. Hemos discutido todos los pasos involucrados en este protocolo como una solución atractiva para los investigadores en muchos campos de la neurociencia, particularmente en las áreas de aprendizaje y memoria.

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

Brainwaves amplitude obtained from electroencephalography (EEG) has been well-recognized as a basis for cognitive capacity, memory, and learning on ...

La evaluación simultánea del seguimiento del comportamiento y la grabación inalámbrica de electrones de holografía y su integración son muy atractivas y proporcionan una solución interesante para los investigadores en muchos campos de la neurociencia. La versatilidad de la evaluación simultánea del seguimiento de video del comportamiento y el registro inalámbrico de EEG es una de las ventajas más significativas, ya que podría usarse en muchas condiciones experimentales. Florencia Mata, estudiante de posgrado, y Alejandro Tapia de Jesús, investigador de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento.Para configurar el dispositivo de electrofisiología, conecte el módem del dispositivo a un host de computadora personal y encienda el módem. Apague cualquier otro dispositivo de red en la computadora y silencie cualquier otra comunicación inalámbrica dentro de la sala de registro como sea posible. Conecte el amplificador a la parte posterior de la rata que se va a analizar y conecte la batería para encender el dispositivo EEG.Dos segundos después de conectarse, un LED rojo en el amplificador de EEG parpadeará en el dispositivo indicando que la comunicación con el módem está activa, seguido de la activación de una luz LED verde. Si la comunicación se realiza correctamente, los LED del módem comenzarán a parpadear continuamente. Cuando la comunicación del dispositivo se haya configurado correctamente, inicie el software de EEG y configure el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante para integrar el software con el dispositivo de adquisición de EEG inalámbrico.A continuación, haga clic en Iniciar pantalla. El software de EEG mostrará la adquisición real de la señal. Para configurar el software de seguimiento del comportamiento, inicie sesión en la cuenta y seleccione Nuevo experimento vacío y Nuevo.Establezca un nombre para el protocolo y seleccione Modo de seguimiento de video. En el aparato, establezca la línea de la regla móvil de la escala en una posición a lo largo de la longitud conocida de la arena e ingrese la longitud de la arena en milímetros en el panel de configuración. En Seguimiento y comportamiento, seleccione Zonas.En Agregar elemento, seleccione Nueva zona y la longitud de la arena y establezca un nombre para la nueva zona. Después de configurar el área de la arena y nombrar el área como se acaba de demostrar, abra Color de animal y los animales seleccionados serán más claros que el fondo del aparato. En Seguimiento de la cabeza y la cola del animal, seleccione Sí, quiero que se realice un seguimiento de la cabeza y la cola del animal.Vaya a Pruebas y etapas y seleccione Agregar elemento y Nueva etapa. Asigne un nombre a la adquisición de etapa. A continuación, defina la duración de la etapa y repita la configuración para las pruebas de memoria a corto y largo plazo.Cuando se hayan configurado todas las pruebas, abra Procedimientos y defina los eventos que se van a rastrear para cada etapa. Para una sesión de adquisición en el software de seguimiento, seleccione Pruebas y Agregar una prueba y asigne un número para el animal que se va a probar, seleccione Registrar y nombrar los animales y la sesión. Antes de colocar al animal en la arena, haz clic en Jugar.Se mostrará un mensaje de espera para iniciar. Luego coloque un animal en la arena frente a una pared opuesta a los objetos. Haga clic en Jugar nuevamente y permita que el animal explore libremente durante 10 minutos.Dos horas después del final de la sesión de adquisición, reemplace uno de los objetos por otro objeto de una forma, color y textura completamente diferentes y configure una prueba de memoria a corto plazo en el software de seguimiento como se demuestra. A continuación, coloque al animal en la arena frente a una de las paredes opuestas al objeto como se muestra. Presione Play nuevamente y permita que el animal explore libremente durante 10 minutos.24 horas después de la sesión de adquisición, configure el software para registrar una prueba de memoria a largo plazo y reemplace el objeto por otro objeto completamente diferente al utilizado en la prueba de memoria a corto plazo. A continuación, coloque al animal en la arena y registre el comportamiento del animal con el software tal y como se demuestra. Las pruebas de campo abierto de ratas que se sometieron a cirugía mientras usaban el equipo o que permanecieron intactas sin usar el hardware no mostraron diferencias significativas en su distancia de viaje durante el período de exploración de 10 minutos.Utilizando el análisis de seguimiento, el tiempo de cabeza en la relación de preferencia de objeto se puede calcular utilizando el tiempo de cabeza del animal que pasa en la zona de objeto. También se puede calcular una relación de preferencia para el tiempo dedicado a moverse hacia los objetos, indicando la cantidad total de tiempo dedicado a cada animal moviéndose hacia cada zona de objetos y el tiempo dedicado por visita a cada objeto. En este ensayo representativo de adquisición, no hubo distinciones entre los objetos en los tres parámetros evaluados, ni hubo diferencias en el ensayo de memoria a corto plazo.Sin embargo, en el ensayo de memoria a largo plazo, se observó una tasa de preferencia de exploración significativamente más alta para el objeto nuevo, así como una preferencia por el objeto nuevo en el tiempo dedicado a la visita. En estos datos de un solo animal representativo, la potencia alfa tendió hacia una disminución en la memoria a corto plazo en comparación con la adquisición y la memoria a largo plazo, lo que sugiere una desincronización relacionada con la exploración o la recuperación de la memoria. Al intentar este procedimiento, asegúrese de que todos los canales de EEG muestren una relación señal/ruido confiable.Es necesario construir o usar electrodos y sistema motor adecuados. Esta técnica puede ayudar a los investigadores a responder preguntas relacionadas con el rendimiento conductual y la actividad eléctrica del cerebro como potenciales evocadores como la prueba P300, un Stroop o un estado estacionario.

simultaneous-monitoring-wireless-electrophysiology-memory-behavioral

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Un enfoque multifacético para investigar cambios funcionales en los circuitos del hipocampo se explica. Técnicas electrofisiológicas se describen junto con el protocolo de lesión, las pruebas de comportamiento y método de disección regional. La combinación de estas técnicas se pueden aplicar de forma similar para otras regiones del cerebro y preguntas científicas.

Las investigaciones sobre alteraciones de la función del circuito del hipocampo después de una lesión cerebral traumática leve

La modulación de hippocampally dependiente de memoria de trabajo espacial mediante microinyección intrahipocampal directo, acompañado y seguido...

Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

Aquí demostramos el uso de una tecnología inalámbrica para el electroencefalograma (EEG) en modelos neonatos de roedores con enfermedades humanas. Con la telemetría, no hay conexiones que entorpezcan, lo que permite comportamientos naturales.

A largo plazo Monitoreo EEG continua en Modelos pequeño roedor de las enfermedades humanas Uso del Sistema Transmisor inalámbrico Epoch

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Describimos los pasos diversas sondas de silicio crónica del implante y registrar lugar células en ratones que son cabeza de funcionamiento fijo en un aparato de cinta enriquecida con cue.

Implantación de sondas de silicio crónica y grabación de las células Hippocampal del lugar en un aparato de cinta enriquecido

Este protocolo describe un método sencillo para grabación simultánea de co localizada electroencefalografía (EEG) y campo local multi-laminar en una rata anestesiado. Un orificio de trépano en el cráneo para la introducción de un microelectrodo se muestra para producir distorsión insignificante de la señal de EEG.

Grabación concurrente de electroencefalografía Co localizada y potencial de campo Local en roedores

Aquí, presentamos un protocolo para registrar el cerebro y corazón bio señales en ratones usando video simultáneo, electroencefalografía (EEG) y electrocardiografía (ECG). También se describen métodos para analizar las grabaciones de EEG ECG resultantes para convulsiones, energía espectral del EEG, la función cardiaca y variabilidad del ritmo cardíaco.

Video-EEG-ECG simultánea de monitoreo para identificar la disfunción neurocardiaco en modelos de ratón de la epilepsia

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Este protocolo describe el uso de un dispositivo de registro y electrodos diseñados a medida para registrar los potenciales de campo local e investigar el flujo de información en el hipocampo y la corteza prefrontal del ratón.

Registros extracelulares duales en el hipocampo y la corteza prefrontal del ratón

Este protocolo proporciona una descripción completa de un método para el registro simultáneo de señales de calcio de neuronas y astrocitos en múltiples regiones cerebrales relacionadas con la memoria y demuestra su aplicación en un paradigma de aprendizaje y comportamiento de la memoria.

Un método de fotometría de fibra bicolor para registrar la actividad de las neuronas astrocitos en múltiples regiones cerebrales durante comportamientos de aprendizaje y memoria

Aprende a realizar electrofisiología inalámbrica y pruebas de memoria simultáneas en ratas para estudiar la neurogénesis del hipocampo. Este método integra EEG y seguimiento conductual en tiempo real.

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo (Video) | JoVE Journal

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

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