Name: Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa usando células endoteliales derivadas del paciente. Este protocolo permite el monitoreo diario del crecimiento celular y la respuesta a terapias experimentales.

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Los autores quieren agradecer a Nora Lakes por su corrección. La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, bajo el Premio R01 HL117952 (E.B.), parte de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí, describimos un método para generar un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de VM. Este modelo murino presenta un excelente sistema que permite a los investigadores obtener una comprensión más profunda de la agrandación patológica del lumen y será fundamental en el desarrollo de terapias más eficaces y dirigidas para el tratamiento de la VM. Esto se puede adaptar fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares como la malformación venosa linfática capilar16. Hay varios p...

Los defectos en el desarrollo de la vasculatura son la causa subyacente de muchas enfermedades, incluida la malformación venosa (VM). La VM es una enfermedad congénita caracterizada por morfogénesis anormal y expansión de las venas1. Importantes estudios sobre el tejido VM y las células endoteliales (EC) han identificado mutaciones de ganancia de función en dos genes: TEK, que codifica el receptor de tirosina quinasa TIE2, y PIK3CA,que codifica la isoforma p110o (subunidad catalítica) de PI3-kinasa (PI3K)2,3,,4,5. Estas mutaciones somáticas dan lugar a la hiperactivación independiente del ligando de vías clave de señalización angiogénica/crecimiento, incluyendo PI3K/AKT, lo que resulta en venas ectáticas dilatadas3. A pesar de estos importantes descubrimientos genéticos, los mecanismos celulares y moleculares subsiguientes que desencadenan la angiogénesis anormal y la formación de canales vasculares agrandados todavía no se entienden completamente.
Durante la angiogénesis normal y patológica, los nuevos vasos brotan de una red vascular preexistente y la EC se someten a una secuencia de procesos celulares importantes, incluyendo la proliferación, la migración, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la formación de lúmenes6. Los cultivos in vitro bidimensionales y tridimensionales (2D/3D) de EC son herramientas importantes para investigar cada una de estas propiedades celulares individualmente. Sin embargo, existe una clara demanda de un modelo de ratón que recapitula la ampliación de los vasos patológicos dentro del microambiente anfitrión, al tiempo que proporciona una plataforma eficaz para la evaluación preclínica de fármacos específicos para la investigación traslacional.
Hasta la fecha, no se ha notificado un modelo murino transgénico de VM asociado con mutaciones de ganancia de función de TIE2. Los modelos actuales de ratón VM transgénicos se basan en la expresión omnipresente o restringida en los tejidos de la mutación activadora PIK3CA p.H1047R3,5. Estos animales transgénicos proporcionan una visión significativa de los efectos específicos de todo el cuerpo o tejido de esta mutación PIK3CA de punto caliente. La limitación de estos modelos es la formación de una red vascular altamente patológica que resulta en la letalidad temprana. Por lo tanto, estos modelos de ratón no reflejan completamente la ocurrencia esporádica de eventos mutacionales y la naturaleza localizada de la patología de la VM.
Por el contrario, los modelos de xenoinjerto derivados del paciente se basan en el trasplante o la inyección de tejido patológico o células derivadas de pacientes en ratones inmunodeficientes7. Los modelos de xenoinjertos son una poderosa herramienta para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de enfermedades y el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos8. Además, el uso de células derivadas del paciente permite a los científicos recapitular la heterogeneidad de la mutación para estudiar el espectro de fenotipos de pacientes.
Aquí, describimos un protocolo en el que la EC VM derivada del paciente que expresa una forma mutante constitutivamente activa de TIE2 y/o PIK3CA se inyecta por vía subcutánea en la parte posterior de ratones desnudos athímicos. Las células vasculares inyectadas se suspenden en un marco ECM para promover la angiogénesis como se describe en los modelos anteriores de xenoinjerto vascular9,10,11. Estos VM EC sufren una morfogénesis significativa y generan vasos patológicos agrandados y perfundidos en ausencia de células de soporte. El modelo de xenoinjerto descrito de VM proporciona una plataforma eficiente para la evaluación preclínica de fármacos específicos por su capacidad para inhibir la expansión de lúmenes no controlada.

<table><tbody><tr><td>Ratones desnudos atímicos, (Foxn1-nu); 5-6 semanas, machos</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Biotinilado Ulex europeaus Aglutinina-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella (500 ml; 0,2 y micro; M)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>Cultivo celular; Análisis histológico</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Calibre</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>50996491</td><td>Medición de tapones de lesiones</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas conjugadas CD31 (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>Separación EC</td></tr><tr><td>Filtro de células (100 &mu; M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubo cónico; polipropileno (15 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubo cónico; polipropileno (50 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Frasco de tinción Coplin</td><td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Reactivo de diaminobenzidina (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Modificación de Dulbecco del medio de águila (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Separación EC</td></tr><tr><td>Punzón de oreja</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales-2 (EGM2) Bulletkit (medio basal y suplementos)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Eosina Y (a base de alcohol)</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) , HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Punta de filtro 1,250 &mu; L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>Múltiples pasos</td></tr><tr><td>Punta de filtro 20 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>Pasos múltiples</td></tr><tr><td>Punta de filtro 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td></td></tr><tr><td>Solución tamponada con formalina de varios pasos (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td> Hemacitómetro de <td>disección con tapón de lesiones</td></tr><tr><td>(INCYTO; Desechable)</td><td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Vector de hematoxilina Hematoxilina</td><td>H-3401</td><td>Análisis histológico</td><td></td></tr><tr><td>Proteína purificada de fibronectina plasmática humana (1 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno (30% p/p)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>Análisis</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-106-01</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (libre de fenol rojo; </td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Separación EC</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost (75 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>Agujas de análisis histológico,</td></tr><tr><td>26G x 5/8 pulgadas Agujas estériles Sub-Q</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Normal suero de caballo</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-L-Glutamina (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Medio de montaje permanente (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Mortero tamaño C, liso</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>Aislamiento</td></tr> EC <tr><td>Fosfato tamponado Solución salina (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Escala de cultivo celular</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (5 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Peroxidasa de rábano picante, concentrado, para IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td><td>Jeringa de cultivo celular</td></tr><tr><td>(60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Cultivo en celda</td></tr><tr><td>FILTRO DE JERINGA (0.2 y micro; M)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Jeringas de cultivo celular</td></tr><tr><td>(1 mL con Luer Lock)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>Inyección subcutánea</td></tr><tr><td>Placa tratada con cultivo de tejidos (100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Placa tratada con cultivo de tejidos (145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>Placas</td></tr><tr><td>de cultivo celular tratadas con cultivo de tejidos (60 X 15) mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tris-base (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4 %)</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1X (0,05% Tripsina/0,53mM EDTA)</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>Análisis histológico</td></tr><tr><td>Frasco Wheaton</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td> de cultivo celular <td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Análisis histológico</td></tr></tbody></table>

un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

La malformación venosa (VM) es una anomalía vascular que surge del deterioro del desarrollo de la red venosa que resulta en venas dilatadas y a menudo disfuncionales. El propósito de este artículo es describir cuidadosamente el establecimiento de un modelo de xenoinjerto murino que imita la VM humana y es capaz de reflejar la heterogeneidad del paciente. Las mutaciones TEK (TEK2) y PIK3CA no heredadas hiperactivantes en células endoteliales (EC) se han identificado como los principales impulsores de la ampliación patológica del buque en la máquina virtual. El siguiente protocolo describe el aislamiento, purificación y expansión de la CE derivada del paciente que expresa EL TIE2 mutante y/o PIK3CA. Estas EC se inyectan por vía subcutánea en la parte posterior de ratones athímicos inmunodeficientes para generar canales vasculares ectáticos. Las lesiones generadas con TIE2 o PIK3CA-mutant EC se vascularizan visiblemente dentro de los 7 u20129 días de la inyección y recapitulan las características histopatológicas del tejido del paciente con VM. Este modelo de xenoinjerto de VM proporciona una plataforma confiable para investigar los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la formación y expansión de máquinas virtuales. Además, este modelo será fundamental para los estudios traslacionales que prueban la eficacia de los nuevos candidatos a fármacos en la prevención de la ampliación anormal de los vasos observados en la máquina virtual humana.

Este protocolo describe el proceso de generación de un modelo de xenoinjerto murino de VM basado en la inyección subcutánea de EC derivada del paciente en la parte posterior de ratones desnudos inmunodeficientes. Las colonias celulares endoteliales se pueden cosechar dentro de las 4 semanas posteriores al aislamiento celular inicial del tejido VM o de la sangre lesional(Figura 1A, B). Al día siguiente de la inyección, el tapón de la lesión de xenoinjerto cubre una superficie de aproximadamente 80-u201210...

Presentamos un protocolo detallado para generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa. Este modelo se basa en la inyección subcutánea de células endoteliales derivadas del paciente que contienen mutaciones hiperactivantes de los genes TIE2 y/o PIK3CA. Las lesiones de xenoinjerto recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido del paciente con VM.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Este protocolo se puede utilizar para crear xenoinjertos derivados del paciente que recapitulan la histopatología de malformaciones venosas. Esto se permitió además para llevar nuestras pruebas terapéuticas preclínicas. Esta técnica proporciona un sistema NVivo rápido y fiable que permite el seguimiento diario del crecimiento de las células endoteliales directas del paciente y la respuesta a la terapia experimental.Este método podría adaptarse fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares o linfáticas. Comience preparando la suspensión celular para inyección. Pruebe las células endoteliales con cinco mililitros de 0.05%tripsin-EDTA precalentados a 37 grados Celsius durante dos minutos.Neutralizar los tripsina y añadiendo cinco mililitros de EGM y recoger las células en tubo cónico de 150 mililitros. Centrifugarlo a 400 veces G durante cinco minutos y luego aspirar el sobrenadante y resuspend las células en tres mililitros de EGM. Cuente las células con un hemocicómetro.Ate la cantidad de volumen con el número de celda deseado en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y pelete las células de nuevo por centrifugación. Aspirar el sobrenadante dejando un pequeño volumen para aflojar el pellet celular. Resuspender el pellet celular con 220 microlitros de BMEM por inyección.Mezcle bien la suspensión celular sobre hielo asegurándose de evitar la creación de burbujas. Aspirar la mezcla de cultivo celular BMEM en una abertura de jeringa de un mililitro tirando del émbolo. Encerrará una aguja estéril de calibre 26 en la jeringa y mantendrá las jeringas preparadas sobre hielo antes de la inyección.Después de asegurarse de que el ratón ha anestesiado correctamente colocarlo en su estómago y desinfectar la región de inyección con 70%etanol. Enrolle suavemente la jeringa preparada para resuspender las células asentadas. Burbujas de escamas hasta el final de la jeringa y expulsar un pequeño volumen de la suspensión celular.Pinche la piel en el lugar de inyección para crear una tienda de campaña como estructura. A continuación, inserte la aguja justo debajo de la piel y asegúrese de que la aguja sólo es la piel profunda mediante la liberación de pellizcar la piel para evitar la inyección en el tejido muscular. Sostenga la aguja constantemente inyectando cuidadosamente 200 microlitros de la suspensión celular para crear una pequeña masa esférica.Tenga cuidado de evitar inyectar la suspensión celular en el músculo. Mida la longitud y la anchura de cada enchufe con una pinza. Alinee los tapones de xenoinjerto diseccionados en una tabla de cortar junto a una regla y tome una imagen para registrar la vascularización bruta de las lesiones.A continuación, fije los enchufes sumergiéndolos en 10% de formol durante la noche a temperatura ambiente. Después de la disección, los tapones de la lesión se procesan para el análisis histológico y se tiñen de UEA-1 para detectar células endoteliales derivadas humanas dentro del tapón. Tome cinco imágenes HPF por sección de lesión con un microscopio de campo brillante a 20 X de aumento en un patrón de plano X dentro de la sección de la lesión para evitar la superposición.Asegúrese de incluir una barra de escala en las imágenes tomadas. Abra las imágenes HPF en la imagen J.To calibrar los píxeles de la barra de escala, utilice la herramienta de línea recta y pase por encima de la barra de escala. A continuación, convierta los píxeles medidos en milímetros haciendo clic en Analizar y Establecer escala.A continuación, haga clic en Analizar definir medidas y seleccione el área y agregue a la superposición. Mida el área de campo total del HPF utilizando analizar y medir el ahorro de esta medición para la cuantificación. Usando la herramienta de selección de manos libres perfilar manualmente el canal vascular positivo UEA-1.Haga clic en Analizar y medir para cuantificar el área esbozada. Mida todos los canales vasculares dentro del HPF. Repita el proceso para los cinco HPF tomados dentro de cada sección y transfiera los valores a Excel para su posterior análisis.A continuación, calcule el porcentaje de área vascular y densidad vascular de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Usando este protocolo, los tapones de lesiones con células endoteliales mutantes hiperactivas TIE2 o PIK3CA se vascularizan visiblemente y se perfunden dentro de los siete a nueve días después de la inyección. Los tapones de la lesión se asemejan mucho a las características histopatológicas del tejido humano VM y son visibles los grandes canales vasculares alineados por una fina capa de células endoteliales.Estas estructuras vasculares suelen contener eritrocitos que confirman la anastomosis funcional con la vasculatura del ratón huésped. La tinción inmunohistoquímica utilizando la lectina específica humana UEA-1 confirma que las células que recubren las regiones vasculares se derivan de células implantadas humanas en lugar de vasculatura de ratón. Después de este procedimiento, se puede realizar una tinción adicional de las secciones de la lesión para marcadores de proliferación o apoptosis para analizar los efectos específicos de los tratamientos experimentales.Este modelo escenográfico se ha utilizado para estudios preclínicos de nuevas terapias para la malformación venosa, como la rapamicina inhibidora de mTOR, que ha demostrado eficacia en varios ensayos clínicos para pacientes con VM.

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Para mejorar nuestro conocimiento de la formación de neotejido celular y molecular, un modelo murino de la TEVG fue desarrollado recientemente. Los injertos fueron implantados como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Este modelo logra resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación clínica, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto.

Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

Este video muestra un modelo para estudiar el desarrollo de la hiperplasia miointimal después de la cirugía de interposición venosa en ratas.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Una fístula aortófica fue creada perforando la aorta renal murina a través de ambas paredes en la vena cava inferior y fue seguida por la creación de una estenosis en su salida a través de la ligadura parcial de la vena cava inferior. Este modelo reproducible se puede utilizar para estudiar la estenosis venosa central.

Modelo murino de estenosis venosa central usando fístula aortocaval con una estenosis de salida

El presente protocolo tiene como objetivo crear experimentalmente hiperplasia intimal venosa sometiendo las venas a la presión arterial para desarrollar estrategias para atenuar la hiperplasia intimal venosa después de la cirugía de revascularización mediante injertos de venas.

Un modelo de interposición venosa de conejo imitando la cirugía de revascularización usando injertos de vena para evaluar la hiperplasia intimal bajo presión arterial arterial

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

En este protocolo, el nuevo injerto de derivación de la vena porcina se realizó a través de una pequeña incisión en la pared torácica izquierda sin bypass cardiopulmonar. Se realizó un estudio patológico postoperatorio, que mostró engrosamiento de la íntima.

Establecimiento y evaluación de un modelo de enfermedad por injerto de vena porcina

Aprenda a generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa usando células endoteliales derivadas del paciente. Este protocolo permite el monitoreo diario del crecimiento celular y la respuesta a terapias experimentales.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

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