Name: Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a analizar respuestas neuroinflamatorias y hemodinámicas tras lesión cerebral traumática en ratones anestesiados mediante espectroscopía de correlación difusa y regresión de mínimos cuadrados parciales.

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Este proyecto fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R21 NS104801 (EMB) y R01 NS115994 (LBW / EB) y Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Este trabajo también fue apoyado por el Departamento de Defensa de los Estados Unidos a través de los Programas de Investigación Médica Dirigidos por el Congreso bajo el Premio No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este material se basa en el trabajo apoyado por el Programa de Becas de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. 1937971. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

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A continuación detallamos los métodos para la evaluación de la respuesta hemodinámica y neuroinflamatoria a la lesión cerebral traumática leve repetitiva. Además, hemos demostrado cómo integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando la regresión parcial de mínimos cuadrados. En el texto a continuación discutiremos algunos de los pasos clave y limitaciones asociadas con el protocolo, así como las ventajas / desventajas de los métodos sobre los métodos existentes.
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Visión general Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBIs) afectan a ~ 1.6-3.8 millones de atletas anualmente1. Estas lesiones, incluidas las lesiones subconmocionales y conmociones cerebrales, pueden dejar a los pacientes con síntomas físicos, emocionales, psicológicos y cognitivos transitorios2. Además, el mTBI repetitivo (rmTBI) sostenido dentro de una "ventana de vulnerabilidad" puede conducir a una gravedad acumulativa y a la duración de las consecuencias cognitivas que duran más que los efectos de un solo mTBI solo3 y, en última instancia, incluso a la pérdida permanente de la función 4,5,6. Aunque muchos pacientes se recuperan en un período de tiempo relativamente corto (<1 semana), el 10-40% de los pacientes sufren efectos más duraderos de mTBI durante > 1 mes, y algunos duran hasta 1 año 3,7,8,9. A pesar de la alta prevalencia y las consecuencias duraderas de estas lesiones, los mecanismos de lesión son poco conocidos y no existen estrategias de tratamiento efectivas.
Dada la alta variabilidad en los resultados después de mTBI / rmTBI, un desafío en la identificación de desencadenantes moleculares en etapa temprana del tejido obtenido en estudios terminales de mTBI / rmTBI es la falta de datos longitudinales que demuestren "enlaces moleculares agudos" definitivos de estos desencadenantes moleculares a resultados a más largo plazo. Para superar este desafío, nuestro grupo ha descubierto que la reducción aguda del flujo sanguíneo cerebral medida agudamente utilizando una herramienta óptica llamada espectroscopia de correlación difusa (DCS), se correlaciona fuertemente con el resultado cognitivo a largo plazo en un modelo de ratón de rmTBI10. Usando este biomarcador hemodinámico, demostramos que los ratones con flujo sanguíneo cerebral agudamente bajo (y, por extensión, peor resultado predicho a largo plazo) tienen aumentos agudos concomitantes en la fosfo-señalización neuronal dentro de las vías MAPK y NFκB, aumentos en la expresión neuronal de citoquinas proinflamatorias y aumentos en la expresión del marcador fagocito/microglial Iba111 . Estos datos sugieren un posible papel para la fosfo-señalización neuronal, la expresión de citoquinas y la activación microglial tanto en la regulación aguda del flujo sanguíneo cerebral después de la lesión, así como en el desencadenamiento de una cascada de señalización que conduce a la disfunción neuronal y un peor resultado cognitivo. A continuación, detallamos nuestro enfoque para sondear simultáneamente el entorno hemodinámico y neuroinflamatorio después de rmTBI y cómo integrar estos conjuntos de datos complejos. Específicamente, describimos los procedimientos para cuatro pasos clave para este enfoque integral: (1) un modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve, (2) evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa, (3) cuantificación del entorno neuroinflamatorio y (4) integración de datos (Figura 1). A continuación, proporcionamos una breve introducción a cada uno de estos pasos clave para ayudar a guiar a los lectores a través de la lógica detrás de nuestros métodos. El resto del manuscrito proporciona un protocolo detallado para cada uno de estos pasos clave.
Modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve Aunque existen muchos modelos preclínicos excelentes de LCT leve repetitiva 12,13,14,15,16,17,18, empleamos un modelo de lesión craneal cerrada por caída de peso bien establecido y clínicamente relevante. Las características clave de este modelo incluyen (1) impacto contundente del cráneo / cuero cabelludo intacto seguido de una rotación sin restricciones de la cabeza alrededor del cuello, (2) ninguna lesión cerebral estructural manifiesta, edema, daño de la barrera hematoencefálica, muerte celular aguda o pérdida crónica de tejido cerebral, y (3) déficits cognitivos persistentes (hasta 1 año) que surgen solo después de múltiples golpes19 (Figura 2)..
Evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa La espectroscopia de correlación difusa (EDC) es una técnica óptica no invasiva que mide el flujo sanguíneo 5,20,21. En DCS, se coloca una fuente de luz infrarroja cercana en la superficie del tejido. Se coloca un detector a una distancia fija de la fuente en la superficie del tejido para detectar la luz que se ha multiplicado dispersa a través del tejido (Figura 3). La dispersión de los glóbulos rojos en movimiento hace que la intensidad de la luz detectada fluctúe con el tiempo. Se utiliza un modelo analítico simple conocido como teoría de difusión de correlación para relacionar estas fluctuaciones de intensidad con un índice de flujo sanguíneo (CBFi, Figura 4). Aunque las unidades de CBFi (cm2/s) no son las unidades tradicionales de flujo (mL/min/100 g), un estudio previo en ratones ha demostrado que CBFi se correlaciona fuertemente con el flujo sanguíneo cerebral medido por espín arterial marcado como MRI21.
Como referencia, el instrumento DCS utilizado aquí se construyó internamente y se compone de un láser de longitud de coherencia de 852 nm de largo, una matriz de fotodiodos de avalancha de conteo de fotones y una placa autocorreladora de hardware (tau único, 8 canales, tiempo de muestra mínimo de 100 ns)21,22. Los datos se adquieren con software casero escrito en LabView. La interfaz animal para el dispositivo consiste en una fibra de fuente multimodo de 400 μm (rango de longitud de onda de 400-2200 nm, núcleo de sílice puro, revestimiento duro TECS) y una fibra detectora monomodo de 780 nm (rango de longitud de onda de 780-970 nm, núcleo de sílice pura, revestimiento duro TECS, corte de modo segundo de 730 ± 30 nm) espaciada a 6 mm de distancia e incrustada en un sensor impreso en 3D negro (4 mm x 8 mm, Figura 3).
Cuantificación del entorno neuroinflamatorio Aunque la neuroinflamación está regulada por diversos procesos celulares, dos mecanismos clave relevantes son la señalización extracelular por citoquinas / quimiocinas y la señalización intracelular por fosfoproteínas. Para investigar el entorno neuroinflamatorio del cerebro después de la lesión, los cerebros se extraen de ratones, se microdisectan, y las citoquinas / quimiocinas y fosfoproteínas se cuantifican utilizando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Los inmunoensayos multiplexados de Luminex permiten la cuantificación simultánea de una colección diversa de estas proteínas mediante el acoplamiento de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) a perlas magnéticas marcadas fluorescentemente. Se utilizan distintas etiquetas fluorescentes para cada proteína de interés, y las perlas de cada etiqueta se funcionalizan con un anticuerpo de captura contra esa proteína en particular. Cientos de cuentas para capturar cada proteína se mezclan, se colocan en una placa de 96 pocillos y se incuban con la muestra. Después de la incubación de la muestra, se utiliza un imán para atrapar las cuentas en el pozo mientras se lava la muestra. A continuación, el anticuerpo de detección biotinilado se une al analito de interés para formar un sándwich anticuerpo-antígeno similar a un ELISA tradicional, pero con el ELISA para cada proteína que ocurre en una cuenta diferente marcada fluorescentemente. La adición de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SAPE) completa cada reacción. El instrumento Luminex luego lee las cuentas y separa la señal de acuerdo con cada etiqueta fluorescente / proteína.
Integración de datos Debido a la gran cantidad de analitos (por ejemplo, citoquinas) medidos en el ensayo Luminex, el análisis de datos puede ser difícil de interpretar si cada proteína cuantificada se analiza individualmente. Para simplificar el análisis y capturar las tendencias observadas entre los analitos, utilizamos un método de análisis multivariante llamado regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR, Figura 8)23. PLSR funciona identificando un eje de pesos correspondientes a cada proteína medida (es decir, citoquinas o fosfoproteínas, denominadas "variables predictoras") que juntas explican de manera óptima la covarinancia de las proteínas medidas con una variable de respuesta (por ejemplo, flujo sanguíneo cerebral). Los pesos se conocen como "cargas" y se ensamblan en un vector conocido como variable latente (LV). Al proyectar (denominado "puntuación") los datos de proteínas medidos en cada uno de los dos LC, los datos se pueden volver a trazar en términos de estos LC. Después de calcular el PLSR, utilizamos una rotación varimax para identificar un nuevo VI que maximiza la covarianza entre las proyecciones de la muestra sobre el VI y la variablepredictora 24. Este enfoque nos permite definir LV1 como el eje para el que se explica mejor la varianza de la variable de respuesta. LV2 maximiza la covarinancia entre la variable de respuesta y los datos residuales de LV1, que pueden estar asociados con la variabilidad biológica o técnica entre muestras. Por último, llevamos a cabo una validación cruzada Leave One Out (LOOCV) para garantizar que el modelo PLSR no dependa en gran medida de ninguna muestra23.
En este protocolo, detallamos los métodos para caracterizar la respuesta del tejido neuroinflamatorio y hemodinámico a mTBI. El flujo de trabajo general se describe en la Figura 1. En este protocolo, los ratones están sujetos a uno o más mTBIs utilizando un modelo de lesión en la cabeza cerrada por caída de peso. El flujo sanguíneo cerebral se mide longitudinalmente antes y en múltiples puntos de tiempo después de la lesión. En el momento del punto de interés para el interrogatorio de los cambios neuroinflamatorios, el animal es sacrificado y se extrae el cerebro. Las regiones cerebrales de interés se aíslan a través de la microdisección y luego se lisan para extraer proteínas. Los lisados se utilizan tanto para los inmunoensayos multiplexados Luminex de citoquinas y expresión de fosfoproteínas como para Western blot. Finalmente, este conjunto de datos holístico se integra utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales.

<table><tbody><tr><td>Pipetas ajustables</td><td></td><td></td><td>cualquier pipeta ajustable</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex kit de lisis celular</td><td>C Bio-Rad</td><td>171304012</td><td></td></tr><tr><td>BRANDplates microplacas pureGrade, no estériles</td><td>BrandTech</td><td>781602 96</td><td></td></tr><tr><td>Mini comprimido inhibidor de proteasa completo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Amazon</td><td>Nair</td><td></td></tr><tr><td>DiH2O</td><td>VWR</td><td>VWRL0200-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bloque separador magnético de mano para placas de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Catálogo Millipore Sigma</td><td>40-285</td><td></td></tr><tr><td>Tablero de autocorrelador de hardware</td><td>www.correlator.com</td><td>Flex05-8ch</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano 250 mL</td><td>MED-VET INTERNATIONAL</td><td>RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe (11,2 x 21,3 cm)</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice de laboratorio</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D o MAGPIX con software xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex Drive Fluid</td><td>Luminex</td><td>MPXDF-4PK</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de vaina Luminex</td><td>EMD Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX MAP Panel de perlas magnéticas de citocinas/quimiocinas de ratón - Premezclado 32 Plex - Ensayo Multiplex de Inmunología</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCYTMAG-70K-PX32</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX MAPK/SAPK Señalización 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>48-660MAG</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>rotador VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de placas</td><td>VWR</td><td>82050-992</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga de polipropileno</td><td>VWR</td><td>20901-547</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z674591</td><td></td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos</td><td>VWR</td><td>89094-668</td><td></td></tr><tr><td>R Lenguaje</td><td></td><td></td><td></td>de programación</tr><tr><td>RStudio</td><td>www.rstudio.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Agitador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>de<td>placas de titulación</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubo guía acrílico de 1 m</td><td>McMaster-Carr</td><td>49035K85</td><td></td></tr><tr><td>fotodiodo de avalancha de conteo de 4 fotones</td><td>Perkin-Elmer</td><td>SPCM-AQ4C-IO</td><td></td></tr><tr><td>400 mmm fibra de fuente multimodo</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT-400-EMT</td><td></td></tr><tr><td>Perno de 54 g</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>0,95 cm diámetro del cuerpo básico, 2 cm de diámetro de la cabeza, 10,2 cm de longitud</td></tr><tr><td>780 nm fibra detectora monomodo</td><td>Thorlabs Inc.</td>Láser de longitud de coherencia larga de <td>780HP</td><td></td></tr><tr><td>852 nm</td><td>TOPTICA Photonics</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Las lesiones cerebrales traumáticas leves (MTBIs) son un problema importante de salud pública. La exposición repetida a mTBI puede conducir a déficits funcionales acumulativos y duraderos. Numerosos estudios realizados por nuestro grupo y otros han demostrado que mTBI estimula la expresión de citoquinas y activa la microglía, disminuye el flujo sanguíneo cerebral y el metabolismo, y afecta la reactividad cerebrovascular. Además, varios trabajos han reportado una asociación entre los trastornos en estos marcadores neuroinflamatorios y hemodinámicos y los deterioros cognitivos. A continuación detallamos los métodos para caracterizar la respuesta del tejido neuroinflamatorio y hemodinámico al mTBI en ratones. Específicamente, describimos cómo realizar un modelo de caída de peso de mTBI, cómo medir longitudinalmente el flujo sanguíneo cerebral utilizando una técnica óptica no invasiva llamada espectroscopia de correlación difusa y cómo realizar un inmunoensayo multiplexado luminex en muestras de tejido cerebral para cuantificar citoquinas y fosfoproteínas inmunomoduladoras (por ejemplo, dentro de las vías MAPK y NFκB) que responden y regulan la actividad de la microglía y otras células inmunes neurales. Finalmente, detallamos cómo integrar estos datos utilizando un enfoque de análisis de sistemas multivariante para comprender las relaciones entre todas estas variables. Comprender las relaciones entre estas variables fisiológicas y moleculares nos permitirá, en última instancia, identificar los mecanismos responsables de la mTBI.

Los datos recopilados previamente se tomaron de trabajos previos en los que un grupo de ocho ratones C57BL/6 fueron sometidos a tres lesiones de cabeza cerrada (Figura 2) espaciadas una vez al día11. En este trabajo, el flujo sanguíneo cerebral se midió con espectroscopia de correlación difusa 4 h después de la última lesión (Figura 3, Figura 4). Después de la evaluación de CBF posterior a la lesión, los anim...

Este protocolo presenta métodos para caracterizar la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática leve e integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando regresión parcial de mínimos cuadrados.

Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Estos métodos se pueden utilizar para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias y hemodinámicas a la lesión cerebral como parte de un análisis del sistema multivariante utilizando la regresión parcial de mínimos cuadrados. Estas técnicas se utilizan para dar una visión más holística de la respuesta del cerebro a las lesiones. Para inducir una lesión, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesiado y coloque el ratón en la posición prona en el centro de una membrana delgada.Usando ambas manos para sostener el tejido enseñado, asegure la cola del ratón debajo de un pulgar y coloque la cabeza del ratón debajo del tubo guía. Cuando el ratón esté en posición, apuntando al impacto entre la parte posterior de los ojos y la parte frontal de las orejas, deje caer el perno desde la parte superior del tubo guía sobre el aspecto dorsal de la cabeza del ratón. Tras el impacto, el ratón romperá el tejido, lo que permitirá una rápida aceleración de la cabeza alrededor del cuello.Después de la lesión, permita que el ratón se recupere en posición supina en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Centígrados. Después de un período de estabilización de dos minutos, apoye suavemente el sensor DCS sobre el hemisferio derecho del cráneo del ratón, de modo que el borde superior del sensor óptico se alinee con la parte posterior del ojo y el lado del sensor se alinee a lo largo de la línea media. Coloque una mano sobre el sensor para protegerlo de la luz de la habitación y adquirir cinco segundos de datos.Luego, reposicione el sensor sobre el hemisferio izquierdo y adquiera cinco segundos de datos del hemisferio izquierdo. Para evaluar la producción de citoquinas multiplexadas y fosfoproteínas, agregue 150 microlitros de tampón de lisis mixta por aproximadamente tres miligramos de tejido cerebral animal cosechado. Y use una punta de pipeta de 1, 000 microlitros para triturar mecánicamente el tejido de 15 a 20 veces.Coloque las muestras homogeneizadas en un rotador durante 30 minutos a cuatro grados centígrados antes de recoger los restos de tejido por centrifugación. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos y centrífuga las muestras para eliminar cualquier precipitado restante. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos y determine la concentración de proteínas mediante ensayo de BCA de acuerdo con los protocolos estándar.Preparar 25 microlitros de cada muestra a la concentración óptima de proteínas determinada por el análisis de rango lineal en tubos nuevos. Uso de búfer de ensayo para normalizar el volumen total de cada muestra a 25 microlitros. Para preparar una placa de ensayo, agregue 200 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y agite la placa en un agitador durante 10 minutos a 750 revoluciones por minuto.Al final de la incubación, decante el tampón de lavado y golpee el plato con una toalla de papel para eliminar cualquier residuo. A continuación, agregue 25 microlitros de tampón de ensayo a cada pozo, seguido de 25 microlitros adicionales de tampón a los pozos de fondo. Agregue 25 microlitros de las muestras diluidas a los pozos de muestra apropiados y vórtice la vía de cuentas magnéticas multiplexadas durante un minuto, antes de agregar 25 microlitros de las perlas completamente resuspendidas a cada pozo.Cuando se hayan agregado todas las perlas, selle la placa con un sellador de placas y cubra la placa con papel de aluminio para una incubación nocturna con agitación de dos a ocho grados centígrados. A la mañana siguiente, coloque la placa en un separador magnético, asegurándose de que los pozos estén alineados con los imanes. Después de dos minutos, decantar el contenido del pozo con la placa aún unida al separador magnético y agregar 200 microlitros de tampón de lavado a cada pozo.Después de mantenerlo temblando durante dos minutos, coloque la placa en el separador magnético durante dos minutos. Luego, decantar el contenido del pozo con la placa aún unida al separador magnético y lavar la placa con un nuevo tampón de lavado de 200 microlitros por pozo, como se acaba de demostrar. Después del segundo lavado, agregue 25 microlitros de anticuerpos de detección por pozo y vuelva a cubrir con papel de aluminio para una incubación de una hora a 750 revoluciones por minuto a temperatura ambiente.Al final de la incubación, agregue 25 microlitros de estreptavidina ficoeritrina a cada pocillo y devuelva la placa al agitador durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque la placa en el separador magnético durante dos minutos antes de decantar el contenido del pozo. Lave la placa dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado fresco por lavado y agregue 75 microlitros del fluido de accionamiento apropiado a cada pozo.Luego, vuelva a suspender las perlas en el agitador de placas durante cinco minutos a temperatura ambiente y lea las placas en el analizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este análisis, el flujo sanguíneo cerebral se midió con espectroscopia de correlación difusa cuatro horas después de la última lesión. El índice de flujo sanguíneo cerebral y el índice de flujo cerebral medio para cada hemisferio se pueden determinar.Se puede realizar un análisis de rango lineal para determinar una masa de carga de proteína adecuada antes de recopilar datos de todas las muestras. Los datos de citoquinas se pueden preparar restando las mediciones de fondo de los datos de muestra, luego calculando los datos de la puntuación Z para cada anolito. La regresión parcial de mínimos cuadrados se puede realizar utilizando un marcador de activación microglial de fagocitos u otra variable de interés como variable de respuesta, y las mediciones de citoquinas como variables predictoras.La rotación Varimax se puede realizar para maximizar la covarianza de los datos en la variable latente uno, con las mediciones del marcador de activación. Los pesos de carga altos en la variable latente uno se corresponden con las expresiones de citoquinas más asociadas con la alta expresión del marcador de activación. Las regresiones lineales entre el marcador de activación y las citoquinas ilustran que aquellas citoquinas con mayores pesos de carga en la variable latente uno también fueron estadísticamente significativas para este análisis.Aunque centramos este protocolo en la lesión cerebral traumática, estos métodos son ampliamente generalizables al estudio de una gran cantidad de afecciones patológicas que afectan al cerebro. Utilizamos estas técnicas para ayudarnos a identificar objetivos tratables para modular en futuros experimentos para establecer relaciones mecanicistas causales y, en última instancia, con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la lesión cerebral traumática leve.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este artículo proporciona una visión general de un enfoque multi-modal de diagnóstico leve lesión cerebral traumática y la recuperación de la juventud. Este enfoque combina las pruebas neuropsicológicas con resonancia magnética funcional y el impacto de la cabeza del sistema de telemetría para monitorizar la relación entre los impactos en la cabeza y la actividad cerebral durante las pruebas cognitivas.

Una investigación de los efectos de la conmoción cerebral relacionado con el deporte en la juventud, recurriendo a imágenes de resonancia magnética y el sistema de impacto de la cabeza de telemetría

Lateral fluido percusión (LFP), un modelo establecido de lesión traumática del cerebro en ratones, se demostró. LFP cumple tres criterios principales para los modelos animales: relevancia validez, fiabilidad y clínicos. El procedimiento, que consiste en una craneotomía quirúrgica, la fijación del cubo seguida por la inducción de la lesión, lo que resulta en lesiones focales y difusas, que se describe es.

Percusión fluido lateral: Modelo de Lesión Cerebral Traumática en ratones

Un enfoque multifacético para investigar cambios funcionales en los circuitos del hipocampo se explica. Técnicas electrofisiológicas se describen junto con el protocolo de lesión, las pruebas de comportamiento y método de disección regional. La combinación de estas técnicas se pueden aplicar de forma similar para otras regiones del cerebro y preguntas científicas.

Las investigaciones sobre alteraciones de la función del circuito del hipocampo después de una lesión cerebral traumática leve

En este video, demostramos la técnica de espectroscopia de correlación difusa para medir el flujo sanguíneo cerebral en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve.

Espectroscopia de correlación difusa para evaluar el flujo sanguíneo cerebral en un modelo de ratón

Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI) siguen siendo un grave problema de salud. Con el modelo de cirugía de impacto cortical controlado, se pueden realizar investigaciones sobre los efectos del TCE y los posibles métodos de tratamiento.

Controlado Modelo de Impacto cortical de la lesión cerebral traumática

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo animal de lesión craneal cerrada que replica el resultado de la neuroimagen de una lesión cerebral traumática leve sin complicaciones con la estructura cerebral preservada en la fase aguda y la atrofia cerebral a largo plazo. La resonancia magnética longitudinal es el método principal utilizado para la obtención de pruebas.

Desarrollo de un modelo de traumatismo craneoencefálico leve sin complicaciones, modificado por el método de pérdida de peso y evidenciado por resonancia magnética

Los modelos simplificados de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) han facilitado el desarrollo de enfoques terapéuticos. Este protocolo describe la creación de una corteza de ratón con heridas punzadas utilizando agujas, lo que permite el análisis de la hemorragia y la inflamación. El modelo de ratón con LCT con herida punzada ofrece la ventaja de realizarse sin necesidad de equipo especializado.

Modelo de ratón con herida de puñalada para estudiar la hemorragia y la inflamación en lesiones cerebrales traumáticas

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Aprende a analizar respuestas neuroinflamatorias y hemodinámicas tras lesión cerebral traumática en ratones anestesiados mediante espectroscopía de correlación difusa y regresión de mínimos cuadrados parciales.

Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

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