Name: Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprende a aislar osteocitos primarios GFP-positivos de cráneos murinos neonatales mediante FACS. Este protocolo optimizado reduce el tiempo de manipulación y maximiza el rendimiento celular con mínima contaminación.

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Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención JSPS KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (No. 19K10397 a H.K. y No. 18K09862 a I.M.).

Todos los procedimientos y el cuidado de los animales se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Universidad de Tohoku.
1. Disección de calvaria de ratón dmp1-topacio recién nacido
<ol><li>Para este protocolo, use cachorros de 6 a 27 días de edad de ratones C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia a los ratones con inhalación de isoflurano al 5% y luego transfiera los cachorros al etanol al 70%.</li>
	<li>Transfiera el cachorro sacrificado a un plato de cultivo no tratado.</li>
	<li>Usando tijeras y pinzas, agarre la piel en la base del cráneo y haga una incisión.</li>
	<li>Usando la primera incisión como punto de partida, corte en ambos lados laterales del cráneo frente a las orejas, retire la piel y exponga la calvaria.</li>
	<li>Sostenga la cabeza desde el puente nasal y corte la calvaria a lo largo de la sutura lambdoidea. Corte a lo largo de los bordes laterales de los huesos parietales y extiéndalo para incluir la parte frontal.</li>
	<li>Separe la calvaria del tejido cerebral subyacente. NOTA: Para asegurar una calvaria ósea limpia con una unión mínima de tejidos blandos, no corte profundamente en el hueso; Como referencia, uno debería poder ver la sombra de las tijeras debajo del hueso.</li>
	<li>Transfiera la calvaria a solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4 durante todo el protocolo). Asegúrese de que la parte cóncava esté orientada hacia arriba.</li>
</ol>2. Fraccionamiento de calvaria de ratón recién nacido
<ol><li>Transfiera hasta 5 calvarias a un tubo cónico de 50 ml que contenga 5 ml de solución de colagenasa de 2 mg/ml. Use una solución fresca de colagenasa preparada justo antes de usar.<ol><li>Para preparar una solución fresca de colagenasa, agregue polvo de colagenasa al tampón de aislamiento (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO 3, 60 mM de sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 5 mg/ml de glucosa y 25 mM de HEPES) a2mg/ml. Disuelva el polvo de colagenasa en un agitador magnético.</li>
		<li>Pase la solución de colagenasa a través de una unidad de filtro estéril de 0,22 μm en un tubo de 50 ml y manténgala en hielo durante todo el protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar la calvaria a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm para obtener la fracción 1.</li>
	<li>Deseche la digestión de la fracción 1, lave la calvaria con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deseche el lavado.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 5 mM que contenga 1 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,4 a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Recoja el digest en un tubo cónico de 50 ml. Lave la calvaria con 5 ml de PBS y agregue la solución de lavado al digerido. NOTA: En cada punto de recolección del digest y lavado, pipetear los huesos en su solución para separar las células del hueso y evitar dobletes y agregados celulares.</li>
	<li>Para obtener la fracción 2, centrifugar el digest a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 8 ml de medio esencial mínimo (MEM) de α que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina G y 100 μg / ml de estreptomicina. Semilla en una placa de cultivo de 10 cm. Incubar la fracción 2 a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 3, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 3 a 37 °C bajo 5% deCO2. NOTA: En este punto, los huesos se harán más pequeños y se reducirán a fragmentos. Para asegurarse de que ningún hueso se aspire accidentalmente en los digeridos, lo que conduce a la pérdida de células en el proceso, use una pipeta de punta pequeña para recolectar los resúmenes (puntas de pipeta de 1000-200 μL).</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 4, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 4 a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de 5 mM EDTA que contengan 1 mg/ml de BSA en PBS (pH 7,4) a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 5, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 5 a 37 °C bajo 5% deCO2. Los osteocitos pueden prepararse para la clasificación el mismo día o cultivarse hasta 24 h antes de la clasificación.</li>
</ol>3. Preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia
<ol><li>Aspirar el medio de cada fracción celular y lavar suavemente con 10 ml de PBS dos veces.</li>
	<li>Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,5% en PBS e incubar las células durante 5 min a 37 °C. Agregue 5 ml de FBS al 10% α-MEM y pipete para separar las células suavemente. Combine las células en cada fracción tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.</li>
	<li>Lave las células con 10 ml de PBS y recójalas tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agregue un 10% de FBS α-MEM al pellet. Ajustar la concentración celular a aproximadamente 1 x 107 células/ml.</li>
	<li>Filtre las celdas en un tubo tapado de malla de nylon de 35 μm. Las células ya están listas para el sistema de control del control de los bienes sobre el terreno.</li>
	<li>Para este protocolo, utilice una boquilla de tamaño de 100 μm. El fluido de recolección debe consistir en un 10% de FBS α-MEM. Conservar la muestra que se está clasificando en agitación y, si es posible, a 4 °C durante toda la clasificación.</li>
	<li>Antes de la clasificación, optimice la activación para eliminar artefactos y celdas ajustando el área de dispersión lateral (SSC) y el área de dispersión directa (FSC). Elimine los dobletes ajustando SSC-width vs SSC-Height y FSC-area vs FSC-width. Los osteocitos GFP negativos deben utilizarse como control para ajustar los parámetros del instrumento de clasificación.</li>
	<li>Una vez completada la recolección de células, centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Lave las celdas con PBS. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender las celdas y ajuste el número como desee utilizando 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El primer osteocito aislado fue de una calvaria de pollo 7 aislada mediante el uso (OB7.3) o la variante aviantede PHEX; Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de anticuerpos viables, ya que se deben fabricar anticuerpos específicos de osteocitos que también son específicos de la especie. Los investigadores utilizaron una modificación diferente del proceso enzimático secuencial para obtener osteocitos de huesos largos de ratón y rata; La pureza reportada de estas culturas se ...

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas de progenitores osteoblásticos que se incrustaron en su matriz secretada1. Son las células más abundantes y longevas entre las poblaciones de células óseas. Residen dentro de lagunas y tienen una morfología estrellada característica con dendritas que se extienden a través de canales llamados canalículos formando una extensa red de comunicación e intercambio metabólico con su entorno circundante y la superficie ósea2. Los osteocitos coreografian tanto osteoblastos como osteoclastos en la remodelación ósea, son las células mecanosensoriales primarias que confieren adaptación a la carga mecánica3, intervienen en la homeostasis del fosfato4 y en la mineralización de la matriz ósea5, y junto con el sistema lacunocanalicular, actúan como órgano endocrino que señala tejidos distantes6.
Los osteocitos están situados dentro de una matriz mineralizada, lo que limita la accesibilidad y dificulta su aislamiento, lo que dificulta la investigación in vitro. Uno de los primeros métodos de aislamiento describió osteocitos aislados de calvaria de pollo utilizando un anticuerpo monoclonal específico de osteocitos (OB7.3)7 que más tarde se supo que era la variante aviar de PHEX (gen regulador de PHosphate con homología a endopeptidasas en el cromosoma X)8. Otros investigadores utilizaron la digestión secuencial de huesos largos de rata 9 o ratón 10 para obtener fracciones ricas en osteocitos en las que se informó que la pureza de los osteocitos era de alrededor del70%9. Las limitaciones de este procedimiento incluyen la pureza subóptima de los cultivos contaminados con otros tipos de células además de los osteocitos y que los osteocitos podrían ser potencialmente sobrecultivados por otras células en cultivo ya que los osteocitos han perdido la capacidad de dividirse. Estos desafíos restringen la usabilidad de las culturas a largo plazo.
Para superar estas limitaciones, se desarrollaron diferentes líneas celulares de osteocitos. La línea celular MLO-Y411 y la línea celular MLO-A512 son, en particular, las líneas celulares más estudiadas que son útiles para el estudio de los osteocitos en etapa temprana; sin embargo, son menos útiles para estudiar la señalización de osteocitos maduros, ya que expresan bajos niveles de esclerostina y FGF2313, los cuales son marcadores de osteocitos maduros. Otras líneas celulares, incluidas IDG-SW314 y Ocy45415, expresan altos niveles de esclerostina y FGF23 y son útiles para estudiar la etapa tardía de osteocitos. Las líneas celulares demuestran ser herramientas de investigación útiles; Sin embargo, no vienen sin limitaciones, ya que no representan completamente la biología de la célula primaria. Diferentes líneas celulares representan diferentes etapas de desarrollo del espectro de madurez de los osteocitos, y las líneas celulares no representan la heterogeneidad de los osteocitos primarios16,17.
Para obtener cultivos puros de osteocitos primarios, los investigadores aprovecharon el modelo de ratón cre en el que se utiliza el promotor dmp1 de 8 kb para impulsar la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en osteocitos18,19. Para obtener poblaciones de osteocitos se han utilizado ratones transgénicos duales (pOB-Col 2.3-GFP-cian y DMP1-GFP-topaz) por Paic et al.19 y ratones transgénicos dmp1-topacio por Nakashima et al.20. En el que emplearon digestión secuencial y FACS de osteocitos que expresan GFP para adquirir cultivos de osteocitos primarios19,20. Se demostró que la dirección de cre en el ratón reportero dmp1 de 10 kb Ai9, que activa la proteína tdTomato, está presente en osteocitos, osteoblastos, músculos y células dentro de la médula ósea. El promotor dmp1 de 8 kb tenía el mismo patrón de expresión, pero sólo una proporción de osteoblastos y células de médula ósea expresaba la proteína, lo que indica que el promotor dmp1 de 8 kb es más específico21. A pesar de esto, los resultados obtenidos utilizando el promotor dmp1 de 8 kb deben interpretarse con precaución, y los perfiles de expresión génica deben llevarse a cabo de forma rutinaria utilizando marcadores específicos de osteocitos frente a osteoblastos para garantizar que la población obtenida sea de pureza lo suficientemente alta.
Los marcadores de osteoclastos OSCAR y Dcstamp se encontraron en poblaciones hematopoyéticas de osteocitos no agotados frente a poblaciones de osteocitos agotados, este hallazgo llevó a los autores a concluir que los digerios obtenidos del fraccionamiento de la calvaria neonatal de 8 kb dmp1-topacio y la clasificación de GFP están contaminados con células hematopoyéticas. La contaminación con células hematopoyéticas podría haberse mitigado apretando la puerta de clasificación de GFP, ya que las células hematopoyéticas positivas para GFP tenían una intensidad de GFP razonablemente menor que las células mesenquimales positivas para GFP (osteocitos)22.
Los métodos para estudiar los osteocitos in vitro han contribuido a la reciente riqueza de información sobre la biología de los osteocitos. Sin embargo, el aislamiento de osteocitos sigue siendo un procedimiento laborioso y prolongado con bajos rendimientos celulares. El método descrito de digestión ósea utilizando colagenasa y EDTA a menudo hasta la fracción 823, toma varias horas en las que se grava la viabilidad de los osteocitos. Los investigadores han reportado el uso de fracciones (2-20125) para la clasificación celular 20, y han demostrado que el perfil de expresión de genes asociados con los osteocitos frente a los de los osteoblastos confirma el éxito de aislar poblaciones de osteocitos puros20. En este artículo, describimos el proceso de obtención de fracciones (2-0125), y comparamos el rendimiento de los osteocitos de cada fracción comenzando con la fracción 1 a la 8 para determinar el retorno de los osteocitos en cada fracción. También describimos la disección de la calvaria del ratón dmp1-topacio recién nacido y la digestión calvarial utilizando colagenasa y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), así como la preparación de células para FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td>Adquisición y análisis</td>de <td></td> datos</tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tubo con tapón de filtro de células, 35 &mu; m Malla de nylon.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr>.<td>Colgenasa</td><td>Wako, Osaka, Japón</td><td>034-22363</td><td>0,2% (p/v), mezcla cruda de colagenasa procedente de C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japón</td><td></td><td>5 mM de EDTA preparado con 0,1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de aislamiento <td>70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO, 60 mM de sorbitol, 3 mM de K2HPO4, 1 mM de CaCl2, 0,1 % (p/v) de BSA, 0,5 % (p/v) de glucosa y 25 mM</td></tr><tr><td>Unidad de filtro estéril HEPES Millex</td><td>Merck Millipore, Irlanda</td><td>SLGV033RS</td><td>0,22&mu; m</td></tr><tr><td>Colador de celdas de nylon</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, EE.UU</td><td></td><td>. 0,5% x10. diluido a x1 en PBS</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japón</td><td></td><td>Con un 10% de suero fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina G y 100 &mu; g/ml de estreptomicina</td></tr></tbody></table>

obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan gfp

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

El osteocito, que una vez se pensó que era un residente pasivo del hueso dada la función detrás del escenario de detectar la carga mecánica, ahora se pone en el centro de atención y se ha demostrado que tiene múltiples funciones principales, como modificar activamente la matriz extracelular y formar un órgano endocrino con el sistema lacunocanalicular que lo encierra enviando mensajes a sitios distantes. Debido a los métodos que permitieron probar el osteocito in vitro desde el aislamiento de osteocitos primarios hasta líneas celulares similares a los osteocitos, los osteocitos están experimentando un interés rotundo y una oleada de conocimiento sobre estructura y función. Muchos aspectos de la biología de los osteocitos y la interacción con otros componentes moleculares aún no se han descubierto. En este protocolo, describimos en detalle el aislamiento eficiente de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio, que expresan la proteína verde fluorescente en los osteocitos, mediante fraccionamiento celular y posteriormente adquiriendo cultivos de osteocitos primarios por FACS.

El propósito de este protocolo es demostrar el proceso de obtención de cultivos de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio a través de un proceso de fraccionamiento utilizando colagenasa para degradar la matriz de colágeno y EDTA para la quelación del calcio, después de lo cual las células se preparan para FACS para separar los osteocitos de otras poblaciones celulares.
Los métodos para obtener osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal a menudo describen el uso...

Este protocolo describe la disección de calvaria de ratón dmp1-topacio neonatal y el aislamiento de osteocitos que expresan la proteína verde fluorescente a través de la digestión celular y el fraccionamiento, además de la preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

El aislamiento primario de osteocitos es un procedimiento prolongado que a menudo se deja fuera en áreas de células bajas. Este protocolo proporciona métodos eficientes para aislar un alto número de osteocitos primarios que expresan GFP. Este protocolo reduce el tiempo de manipulación y permite obtener un mayor número de osteocitos en un solo procedimiento con una mínima contaminación de células hematopoyéticas o mesenquimales.Para el aislamiento de los osteocitos que expresan GFP, se coloquen las crías de ratón transgénico eutanasiadas en el sexto o séptimo día postnatal en una placa de cultivo no tratada, y se utilizan tijeras y pinzas para agarrar la piel de la base del cráneo. Use las tijeras para hacer una incisión inicial en la piel levantada, seguida de cortes a lo largo de ambos lados del cráneo frente a las orejas. Retirar la piel para exponer la calvaria y sujetando la cabeza desde el puente nasal, cortar la calvaria a lo largo de la sutura lamboides y a lo largo de los bordes de los huesos parietales hasta la parte frontal del tejido.Separe la pantorrilla del tejido cerebral subyacente y coloque los huesos con el lado cóncavo hacia arriba en PBS. Para obtener la fracción uno, se agrupan hasta cinco calvarias por tubo de 50 mililitros en cinco mililitros de colagenasa de dos miligramos por mililitro recién preparada, y se incuban los tejidos a 37 grados centígrados y 300 revoluciones por minuto durante 20 minutos. Al final de la incubación, deseche el digesto de la fracción uno y lave la calvaria con cinco mililitros de PBS.Sustituya el lavado por cinco mililitros de EDTA de cinco milimolares suplementado con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina en PBS durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación. Al final de la incubación, transfiera el digesto a un tubo cónico de 50 mililitros y lave la calveria con cinco mililitros de PBS. Luego transfiera la solución de lavado a la digestión.Para obtener la fracción dos, coloque el digesto para centrifugación y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en ocho mililitros de medio alfa mínimo esencial que contenga un 10% de suero bovino fetal, o FBS, y antibióticos, y siembre las células en una placa de cultivo de 10 centímetros. A continuación, coloque las células de la fracción dos en la incubadora de cultivos celulares.Después de recolectar y cultivar las fracciones tres y cuatro como se acaba de demostrar. Incubar la calveria en cinco mililitros de EDTA de cinco milimolares suplementado con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina en PBS durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación. Al final de la incubación, recoja y cultive la fracción cinco, como se ha demostrado para las fracciones dos, tres y cuatro.Inmediatamente después del fraccionamiento, recoja las celdas para clasificarlas. Alternativamente, recoja las células después de 24 horas de cultivo aspirando el medio y lave suavemente las células dos veces con 10 mililitros de PBS por plato por lavado. Después del segundo lavado, tratar las células con cinco mililitros de tripsina EDTA al 0,5% en PBS por placa.Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, agregue cinco mililitros de medio esencial mínimo alfa completo a cada placa y separe suavemente las celdas con pipeteo. Para combinar las células de cada fracción, filtre las suspensiones celulares a través de un filtro celular de 40 micras en un solo tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros. Después de lavar las células con 10 mililitros de PBS, agréguelas al tubo.Filtre las células a través de un colador y recoja las células por centrifugación. Una vez que las células se hayan granulado, vuelva a suspender el pellet en un medio esencial mínimo completo a una concentración de una vez 10 a la séptima celdas por mililitro de medio y filtre las células a través de un tubo con tapa de malla de nailon de 35 micras. Para probar la eficiencia de este método, las fracciones se clasificaron por separado y se cultivaron durante 24 horas para determinar el porcentaje y el rendimiento de osteocitos de cada fracción.La densidad de los osteocitos en las fracciones dos a cinco fue mayor que la observada en la fracción uno y disminuyó notablemente en las fracciones seis, siete y ocho. Aunque el porcentaje de osteocitos obtenidos entre todas las fracciones no es estadísticamente significativo, la densidad de los osteocitos difiere drásticamente entre fracciones. Aquí se muestra la estrategia de compuerta para aislar osteocitos positivos para GFP de sus homólogos negativos para GFP mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia.Después de la clasificación, los osteocitos se pueden analizar para determinar la expresión de marcadores de osteocitos de interés. En este análisis, los genes marcadores de osteocitos se expresaron en niveles más altos en los osteocitos aislados positivos para GFP en comparación con la fracción dos preclasificada, que se conoce como fracción osteoblástica alta. Aquí se puede observar la morfología de un osteocito GFP positivo que conserva una forma estrellada con dendritas que se extienden desde el cuerpo celular después de 24 horas de cultivo en una placa de cultivo de plástico, después de la clasificación.Preste atención al aspirar los digestos, ya que la calvería se reducirá a gránulos diminutos. Recuerde utilizar un aspirador de punta pequeña para evitar la pérdida de células. Los osteocitos han sido enigmáticos porque están sepultados en el hueso.Esta técnica ha allanado el camino para estudiar las interacciones moleculares de los osteocitos y su control sobre osteoclastos y osteoblastos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Tratamiento de los osteoblastos primarios de ratón con ácido retinoico produce una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos. El método supera la dificultad de obtención y mantenimiento de osteocitos primarios en cultivo, y puede ser ventajoso para estudiar las células derivadas de los modelos transgénicos.

La aplicación de ácido retinoico para obtener cultivos de osteocitos principal del ratón osteoblastos

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

El presente artículo describe la realización de un enfoque de imagen intravital para observar la señalización de calcio inducida mecánicamente de osteocitos incrustados in vivo en tiempo real en respuesta a la carga mecánica a nivel tisular del tercer metatarsiano del ratón.

Un enfoque de imagen intravital fluorescente para estudiar la dinámica de señalización de calcio inducida por la carga en osteocitos de ratón

Este estudio describe el método para visualizar y desarrollar modelos tridimensionales (3D) de osteocitos dentro de la red lacunar-canalicular (LCN) para el análisis de dinámica de fluidos computacional (CFD). Los modelos generados utilizando este método ayudan a comprender la mecanosensación de los osteocitos en huesos sanos o enfermos.

Análisis e imagen de osteocitos

La microscopía intravital permite el estudio de procesos biológicos dinámicos como la regeneración de tejidos y el desarrollo de tumores. La médula ósea del calvario, un tejido altamente dinámico, ofrece información sobre la hematopoyesis y la función vascular. El uso de un implante de fijación de cabeza biocompatible impreso en 3D permite obtener imágenes longitudinales repetitivas, lo que mejora nuestra comprensión de la dinámica de los tejidos y el microambiente tumoral.

Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

Aprende a aislar osteocitos primarios GFP-positivos de cráneos murinos neonatales mediante FACS. Este protocolo optimizado reduce el tiempo de manipulación y maximiza el rendimiento celular con mínima contaminación.

Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP

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