Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Este protocolo permite la obtención de imágenes no destructivas de micras de laboratorio intactas o blandas con una resolución de micras. Se puede utilizar para comprender los mecanismos de la fisiología, la anatomía y el desarrollo de los animales. Debido a que las moscas se obtienen en un estado intacto sin la necesidad de disección de tejido, la arquitectura espacial de los tejidos y órganos se mantiene en su estado nativo y se observa fácilmente.

La micro TC es una herramienta ideal para estudios destinados a modelar enfermedades humanas en moscas, o para comprender defectos de desarrollo que afectan la calidad de vida. También ha demostrado ser útil en otras disciplinas, como la ingeniería, la física, la ciencia de los materiales, la geología y la antropología. Después de seleccionar el punto de tiempo de desarrollo de interés para la obtención de imágenes, transfiera de 5 a 20 animales a un mililitro de PBST en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente con golpecitos periódicos para ayudar a eliminar el recubrimiento hidrofóbico y permitir que los animales se sumerjan por completo.

Al final de la incubación, reemplace el PBST con un mililitro de solución de Bouin y golpee el tubo para sumergir completamente las moscas. Para muestras de larvas y pupas, después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente, lavar a los animales tres veces durante cinco minutos y un mililitro de PBS fresco por lavado. Después del último lavado, transfiera las muestras a una placa de disección de pocillos múltiples que contenga PBS fresco por pocillo bajo un microscopio de disección, y use un pequeño alfiler de minuciento conectado a un soporte para hacer un agujero en la cutícula anterior y posterior de cada muestra, teniendo cuidado de no alterar el tejido blando subyacente.

Después de penetrar en las cutículas, incubar las muestras en un mililitro de solución fresca de Bouin en un tubo nuevo de 1,5 mililitros durante 24 horas a temperatura ambiente antes de lavar la muestra tres veces durante 30 minutos y un mililitro de un tampón de lavado micro CT por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de la solución de tinción adecuada al tubo e incube las muestras a temperatura ambiente durante dos a siete días. Si es necesaria una conservación de la imagen más prolongada, deshidrate las muestras dentro de la serie ascendente de etanol en un mililitro de etanol durante una hora por concentración, como se indica, para preparar las muestras para el secado en puntos críticos.

Para montar muestras secas de punto crítico, coloque las muestras en tubos capilares de plástico o vidrio antes de montar los tubos en el soporte de platina giratorio. Para el montaje de muestras hidratadas, llene una punta de pipeta P10 con agua y asegure el extremo estrecho con una película de parafina. Use pinzas para transferir una sola muestra a la punta de la pipeta y use un objeto largo y delgado para empujar cuidadosamente la muestra hacia abajo en la punta hasta que simplemente toque la pared de la punta para mantener la muestra en su lugar.

Después de cubrir el extremo abierto de la pipeta, monte la pipeta P10 en un soporte diseñado para encajar dentro del calzo de la platina giratoria. Para escanear, haga clic en el icono de puerta abierta en el software del escáner para acceder al calzo de la platina giratoria y apriete el collar alrededor de la base del portamuestras para sujetar la muestra. Configure los parámetros de escaneo en el software para obtener una resolución y un contraste óptimos y haga clic en Opciones y fuente de rayos X para abrir el control de energía de la fuente de rayos X.

Use las barras deslizantes para establecer el voltaje de rayos X a 30 a 40 kilovoltios y la corriente a 100 a 110 microamperios para producir un haz de rayos X con tres a cuatro vatios de potencia y un tamaño de punto pequeño. Para establecer el número de imágenes de proyección que se adquirirán durante los escaneos, seleccione Opciones y modos de adquisición para establecer el tiempo de exposición de la cámara de 500 a 800 milisegundos y utilice la barra deslizante para establecer el tamaño de píxel de la imagen deseado de acuerdo con la configuración y la posición de la cámara. Haga clic y arrastre la barra deslizante para mover la muestra a lo largo de su trayectoria de rotación de 360 grados, manteniendo la muestra dentro del campo de visión.

Haga clic en el icono de inicio de adquisición. Aparecerá un cuadro de diálogo que permite establecer parámetros de escaneo adicionales. Asigne un nombre al archivo y a la carpeta de salida en la que se guardará el análisis.

Establezca el movimiento aleatorio en 10 y el promedio en cuatro a seis fotogramas. El paso de rotación se calculará automáticamente en función de la configuración de la cámara utilizada y, a continuación, haga clic en Aceptar para comenzar la adquisición. Aparecerá un cuadro de diálogo de la barra de progreso que muestra el tiempo de escaneo y el escáner comenzará a adquirir una serie de imágenes de proyección de la muestra a lo largo de la trayectoria de rotación.

Para generar los tomogramas, abra las imágenes de proyección en el software de reconstrucción y seleccione el algoritmo de corrección de desplazamiento para realizar una alineación inicial de la imagen. Seleccione el mejor valor que alinee correctamente las imágenes de proyección y haga clic en Ajuste fino para ajustar cada parámetro de reconstrucción. Se generará una serie de vistas previas que se pueden utilizar para seleccionar los valores correctos.

Confirme que los valores óptimos de los parámetros se muestran en la pestaña Configuración y, en la pestaña Salida, ajuste los parámetros del archivo, como la profundidad de bits, el nombre del archivo y la carpeta donde se guardarán los datos. Una región de interés se puede utilizar para reconstruir solo las estructuras de interés. Si se requieren varias reconstrucciones, haga clic en Iniciar y Agregar al lote para agregar la imagen actual al administrador de lotes y repita la reconstrucción para las imágenes restantes.

Para el análisis morfométrico de las imágenes reconstruidas, en la pestaña Segmento, en un programa de software de análisis morfométrico adecuado, haga clic en Básico y Nuevo, asigne un nuevo nombre a la imagen y seleccione un color adecuado. Marque la casilla Definir rango y ajuste el control deslizante para ajustar el rango de umbral que abarca la estructura de interés. Para pintar un área definida por el umbral, mantenga pulsada la tecla Control mientras mantiene pulsada la tecla izquierda del ratón.

Para eliminar un área, mantenga presionada la tecla Mayús mientras mantiene presionada la tecla izquierda del mouse. Asegúrese de que las mediciones de la región de interés de la malla se muestren en el panel de información para el análisis morfométrico básico. Renderice el objeto de malla y toda la imagen del tomograma, y visualice la imagen resultante en 3D, luego haga clic con el botón derecho para seleccionar Mostrar Movie Maker para generar un video del objeto utilizando fotogramas individuales del visor.

En estas imágenes, se puede observar un embrión, una larva del tercer estadio, una pupa en la etapa adulta ferrata y una mosca hembra adulta teñida con yodo y fotografiada en el agua utilizando un escáner comercial de sobremesa. Es evidente una excelente conservación y una tinción uniforme del delicado tejido, lo que permite identificar fácilmente todos los órganos principales. Aquí, se muestra una comparación de la misma carcasa de mosca adulta, adquirida en el modo de escaneo de proyección lenta y rápida.

Es importante destacar que, aunque la resolución en las imágenes lentas es mayor, el análisis morfométrico no difiere entre los escaneos lentos y rápidos. Con el software de renderizado, se puede segmentar cualquier tejido u órgano de interés y utilizarlo para el análisis morfométrico y la visualización en 3D. En estas imágenes, se puede observar el abdomen de una mosca teñido con ácido fosfotúngstico y fotografiado mientras se hidrata con agua o después de un secado de punto crítico en un microscopio de rayos X.

Usando ácido fosfotúngstico, las células epiteliales individuales del intestino medio y los haces de espermatozoides dentro de los testículos se resuelven fácilmente. Si bien las imágenes de secado de puntos críticos muestran un aumento marginal de la resolución en comparación con la muestra hidratada, se logra una mejor preservación de la ultraestructura de los tejidos delicados con muestras hidratadas, como las células grasas cerca de la cutícula. Para obtener la mejor resolución, limite el movimiento de la muestra y el exceso de vibraciones.

Asegurar la muestra al escenario es fundamental para esto, aunque puede ser necesario la creatividad y el ingenio para lograrlo. Se pueden utilizar métodos de imagen adicionales, como la microscopía óptica y electrónica, como parte de un flujo de trabajo de imágenes para comprender una mutación genética determinada desde la nanoescala hasta todo el organismo.