Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A
8 de julio de 2020
Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.
Este método se puede utilizar para verificar fácilmente el cambio de microARN en la nefropatía por IGA utilizando un modelo animal pequeño, lo que permite estudiar la nefropatía por IGA sin una biopsia de riñón humano. El protocolo puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la genética de la nefropatía por IGA, lo que potencialmente puede ayudar en el descubrimiento de nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos para la enfermedad renal. Después de asegurarse de que el ratón esté correctamente anestesiado, use tijeras quirúrgicas y fórceps para hacer una incisión de tres a cuatro centímetros en la línea media del ratón e identificar ambos lados del riñón.
Haga una incisión en las costillas y el diafragma para exponer el corazón. Después de incidir la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido, lo que indica que todo el cuerpo del ratón está perfundido con PBS. Cortar la arteria renal, la vena renal y el uréter, y luego extirpar el riñón.
Homogeneizar las muestras de riñón de 30 miligramos utilizando un homogeneizador de silicio y 700 microlitros de reactivo de lisis a base de fenol guanidina a temperatura ambiente. Transfiera el lisado a la columna de centrifugación de biopolímero y centrifugue a 15.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Continúe con la purificación de RBNA siguiendo las instrucciones del manuscrito.
Después del lavado final, agregue 30 microlitros de agua libre de nucleasas a la columna de centrifugación basada en membrana de sílice y centrifugue a 8.000 G durante un minuto para eluir el ARN. Para la síntesis de ADNc, prepare una mezcla maestra con dos microlitros de mezcla de ácido nucleico, dos microlitros de mezcla de transcriptasa inversa y cuatro microlitros de tampón en un total de ocho microlitros por muestra. Agregue ocho microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de una tira de tubo de ocho pocillos.
Diluir el ARN total en agua libre de nucleasas. Luego, agregue 12 microlitros de la solución de ARN total a cada pocillo de la tira. Coloque las muestras en el termociclador e incube a 37 grados centígrados durante 60 minutos, luego a 95 grados centígrados durante cinco minutos.
Para realizar una PCR cuantitativa en tiempo real, prepare la mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y, a continuación, añada 22,5 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos. Agregue 2,5 microlitros del ADNc preparado a cada pocillo. Coloque la placa de reacción en el instrumento de PCR en tiempo real.
Luego, prográmelo para una activación inicial a 95 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94 grados Celsius durante 15 segundos, recocido a 55 grados Celsius durante 30 segundos y extensión a 70 grados Celsius durante 30 segundos. Cuantificar la expresión génica mediante el método de TC delta-delta. Este protocolo se utilizó para investigar los niveles de expresión de microRNAs en los riñones de ratones HIGA utilizando los riñones de ratones Balb/c como control.
Se midieron los niveles de expresión de tres microRNAs asociados a la nefropatía por IGA. Los niveles relativos de expresión de microARN de los dos grupos se compararon mediante una prueba T, siendo un P inferior a 0,05 estadísticamente significativo. miR-155-5p se expresó a niveles 3,3 veces más altos en el grupo HIGA en comparación con el grupo de control, y miR-21-5p se expresó a niveles 1,58 veces más altos.
La expresión de miR-1461-5p no difirió significativamente entre los dos grupos. Al intentar este protocolo, es importante usar una mascarilla, guantes y gorra y mantener limpias la mesa y las herramientas del laboratorio para evitar que la nucleasa en el medio ambiente afecte el experimento. Este método experimental se utiliza actualmente en la práctica en nuestro laboratorio.
Su objetivo es establecer nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos para la nefropatía por IGA.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio presenta un método confiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo murino de nefropatía por IgA. El método permite investigar la participación de los microARN en la nefropatía por IgA sin necesidad de biopsias renales humanas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nefrología
- Investigación de microARN
- Modelos animales
Antecedentes
- La nefropatía por IgA es una enfermedad renal caracterizada por el depósito de IgA en los glomérulos.
- Los microARN desempeñan un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades, incluidos los trastornos renales.
- Comprender la expresión de microARN puede proporcionar información sobre los mecanismos de las enfermedades.
- Los métodos actuales para estudiar los microARN a menudo requieren procedimientos invasivos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para evaluar los niveles de microARN en un modelo murino de nefropatía por IgA.
- Facilitar la investigación sobre los aspectos genéticos de la nefropatía por IgA.
- Explorar posibles enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades renales.
Métodos Utilizados
- Uso de ratones HIGA como modelo para la nefropatía por IgA.
- Administración de anestesia al ratón antes de la cirugía.
- Técnicas quirúrgicas para acceder a los riñones, incluyendo incisión media y extracción del órgano.
- Perfusión del ratón con PBS para preparar la extracción renal.
Resultados principales
- El método desarrollado permite una verificación sencilla de los cambios en microARN en la nefropatía por IgA.
- Los conocimientos obtenidos mediante este método pueden conducir al desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas.
- Potencial para descubrir nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la nefropatía por IgA.
- Eliminación de la necesidad de biopsias renales humanas en estudios preliminares.
Conclusiones
- Este método mejora la comprensión de la participación de los microARN en la nefropatía por IgA.
- Abre nuevas vías de investigación en la genética de las enfermedades renales.
- Este enfoque podría tener un impacto significativo en el desarrollo futuro de diagnósticos y terapias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los equipos de I+D de biofármacos analizar la expresión de microARN en un modelo murino validado de nefropatía por IgA, apoyando la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en programas para enfermedades renales. Al proporcionar un método reproducible para detectar niveles alterados de microARN sin necesidad de biopsias humanas, facilita el descubrimiento temprano de biomarcadores y dianas terapéuticas con una mayor confianza predictiva. El enfoque se alinea con los esfuerzos en fase de descubrimiento para investigar los mecanismos de la enfermedad y priorizar candidatos para el desarrollo preclínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de cambios en la expresión de miARN asociados a la enfermedad en ratones HIGA frente a los controles.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo confiable para la validación funcional de dianas utilizando qRT-PCR para medir los niveles de miR-155-5p, miR-21-5p y miR-146a-5p.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al identificar miARN con cambios significativos en su expresión (por ejemplo, 3,3 veces para miR-155-5p) como posibles biomarcadores o dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de expresión de miARN adecuados para la estandarización de ensayos en campañas de cribado de descubrimiento.
- Valor operativo: Establece un protocolo estandarizado de purificación de ARN y síntesis de ADNc compatible con plataformas de qRT-PCR de alto rendimiento.
- Preparación del ensayo: Genera valores de CT normalizados mediante el método delta-delta CT, lo que permite la comparación entre muestras y la confirmación de resultados positivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Utiliza un modelo murino HIGA relevante para la enfermedad para vincular hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica de vías mediadas por miARN.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite evaluar los cambios en la expresión de miARN asociados al depósito de IgA, reduciendo la ambigüedad en el mecanismo del blanco antes de la identificación del candidato principal.
- Continuidad preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar lecturas consistentes y cuantificables del tejido renal en todos los grupos del estudio.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la comprobación de hipótesis en la validación de dianas y generando resultados cuantitativos para flujos de trabajo de cribado y análisis que orientan las decisiones de identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Permite aclarar vías al medir los cambios en la expresión de miARN asociados con la patogénesis de la nefropatía por IgA en un modelo genético de ratón.
- Cribado: Genera datos cuantitativos estandarizados de miARN adecuados para evaluar los efectos de compuestos sobre vías diana en ensayos posteriores.
- Análisis: Produce valores delta-delta CT y métricas de cambio relativo que permiten a los equipos comparar condiciones y evaluar la significancia estadística mediante pruebas T.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos de miARN en fase de descubrimiento con la continuidad preclínica mediante el uso de un modelo validado de nefropatía por IgA con relevancia fenotípica.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable de extracción de ARN y qRT-PCR aplicable a múltiples dianas de miARN en diversos proyectos de enfermedades renales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la medición directa de la disregulación de miARN en un modelo de enfermedad.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y la estandarización mediante parámetros definidos de purificación de ARN, síntesis de ADNc y qRT-PCR (por ejemplo, centrifugación a 8.000 G, incubación a 37 °C).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos de expresión estadísticamente significativos (p<0,05) para priorizar dianas con fuerte asociación a la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de biomarcadores o dianas terapéuticas basados en miARN, según la magnitud del cambio en el número de copias y la reproducibilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de roedores, manipulación de ARN y qRT-PCR para prevenir la degradación por nucleasas y garantizar la integridad de las muestras.
- Depende del acceso a equipos de homogenización, centrífuga, termociclador e instrumento de PCR en tiempo real con detección de fluorescencia.
- Necesita estandarización entre los equipos para la cantidad de ARN utilizado (30 mg de riñón), volúmenes de reactivos (700 μL de reactivo de lisis) y condiciones de ciclado (activación a 95°C, 40 ciclos).
- Requiere adaptación de los conjuntos de cebadores para dianas específicas de miARN, manteniendo temperaturas constantes de hibridación (55°C) y extensión (70°C).
- Limitado al análisis de ARN en punto final; no proporciona resolución espacial ni a nivel de célula individual en el tejido renal sin metodologías adicionales.
