Name: Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprenda a aislar y enriquecer células progenitoras epiteliales de pulmón humano mediante digestión enzimática y FACS. Este protocolo permite generar organoides 3D regionales para estudiar biología pulmonar y descubrimiento de fármacos.

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Agradecemos el apoyo de Mizuno Takako para IFC y tinción H y E, Vanessa García para la seccionamiento de tejidos y Anika S Chandrasekaran por ayudar con la preparación del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) y el Consorcio Celgene IDEAL.

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<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+progenitors+are+region+specific+and+show+differential+responses+to+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury.</a> Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos un método confiable para el aislamiento de subpoblaciones definidas de células pulmonares del tejido pulmonar humano para análisis molecular o funcional y modelado de enfermedades. Los elementos críticos de los métodos incluyen la capacidad de lograr la disociación tisular con la preservación de epítopos superficiales, que permiten el enriquecimiento mediado por anticuerpos de células recién aisladas, y la optimización de los métodos de cultivo para la generación eficiente de organoides epiteliales específico...

Los espacios aéreos del sistema respiratorio humano se pueden dividir ampliamente en zonas conductoras y respiratorias que median el transporte de gases y su posterior intercambio a través de la barrera epitelial-microvascular, respectivamente. Las vías respiratorias conductoras incluyen tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos terminales, mientras que los espacios de aire respiratorio incluyen bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y alvéolos. El revestimiento epitelial de estos espacios aéreos cambia de composición a lo largo del eje proximo-distal para adaptarse a los requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. El epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias traqueobronquiales está compuesto por tres tipos principales de células, basales, secretoras y ciliadas, además de los tipos celulares menos abundantes, incluidos el cepillo, el neuroendocrino y el ionocito 1,2,3. Las vías respiratorias bronquiolares albergan tipos de células epiteliales morfológicamente similares, aunque hay distinciones en su abundancia y propiedades funcionales. Por ejemplo, las células basales son menos abundantes dentro de las vías respiratorias bronquiolares, y las células secretoras incluyen una mayor proporción de células club frente a las células serosas y caliciformes que predominan en las vías respiratorias traqueobronquiales.  Las células epiteliales de la zona respiratoria incluyen un tipo de célula cuboidal mal definida en los bronquiolos respiratorios, además de las células alveolares tipo I (ATI) y tipo II (ATII) de los conductos alveolares y alvéolos 1,4.
La identidad de los tipos de células madre epiteliales y progenitoras que contribuyen al mantenimiento y renovación de los epitelios en cada zona se describe de forma incompleta y se infiere en gran medida de los estudios en modelos animales 5,6,7,8. Los estudios en ratones han demostrado que las células basales de las vías respiratorias pseudoestratificadas, o las células club de las vías respiratorias bronquiolares o las células ATII del epitelio alveolar, sirven como células madre epiteliales basadas en la capacidad de autorrenovación ilimitada y diferenciación multipotente 7,9,10,11,12 . A pesar de la incapacidad de realizar estudios de rastreo de linaje genético para evaluar el tallo de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas, la disponibilidad de modelos de cultivo basados en organoides para evaluar el potencial funcional de las células madre y progenitoras epiteliales proporciona una herramienta para estudios comparativos entre ratones y humanos 13,14,15,16,17.
Describimos métodos para el aislamiento de tipos de células epiteliales de diferentes regiones del pulmón humano y su cultivo utilizando un sistema organoide 3D para recapitular los tipos de células regionales. Se han desarrollado métodos similares para el análisis funcional y el modelado de enfermedades de células epiteliales de otros sistemas de órganos 18,19,20,21. Estos métodos proporcionan una plataforma para la identificación de células progenitoras epiteliales regionales, para realizar estudios mecanicistas que investiguen su regulación y microambiente, y para permitir el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Aunque los estudios de células progenitoras epiteliales pulmonares realizados en modelos animales pueden beneficiarse del análisis, ya sea in vivo o in vitro, los conocimientos sobre la identidad de las células progenitoras epiteliales pulmonares humanas han dependido en gran medida de la extrapolación de organismos modelo. Como tal, estos métodos proporcionan un puente para relacionar la identidad y el comportamiento de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas con sus estudios que investigan la regulación de las células madre / progenitoras.

<table><tbody><tr><td>Aislamiento</td><td></td><td></td><td></td></tr> celular <tr><td>10 mL Jeringas estériles, Luer-Lok Tip</td><td>Fisher scientific</td><td>BD 309646</td><td></td></tr><tr><td>30 mL Jeringas estériles, Luer-Lok Tip</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de riesgo biológico</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de riesgo biológico</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>anillo de conexión</td><td>Pluriselect</td><td>41-50000-03</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa (lote #SLBF7798V)</td><td>sigma Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri desechables</td><td>Corning/Falcon</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Embudo</td><td>Pluriselect</td><td>42-50000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Grado de investigación</td><td>sigma Aldrich 5401127001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aguja 16G</td><td>VWR</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>aguja 18G</td><td>VWR</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 100 &micro; m (Filtro de células)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50100-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 300 &micro; m (Filtro de celdas)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50300-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 40 &micro; m (Filtro de células)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50040-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 500 &micro; m (Filtro de celdas)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 70 &micro; m (Filtro de células)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50070-51</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Equipo' s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubos</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP 300s Procesador de tejidos</td> LS Columnas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand**</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS+ Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15290018</td><td>2ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0, sin RNasa</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>AM9260G</td><td>500&micro; l</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>10ml</td></tr><tr><td>HBSS Hank's Solución salina equilibrada 1X 500 ml</td><td>VWR</td><td>45000-456</td><td>Frasco de 500ml</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15630080</td><td>5ml</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (PSN) Mezcla antibiótica</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15640055</td><td>5ml</td></tr><tr><td>Lista de anticuerpos para FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-humano CD326 (EpCAM) Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>369820</td><td>1:50</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Conjunto de partículas de control negativo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB552843</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td>20&micro; l/ 107 células totales</td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>20&micro; l/ 107 células totales</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD235a</td><td>BioLegend</td><td>349104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD31</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD45</td><td>BioLegend</td><td>304054</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anti-ratón Anticuerpo IgM</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ratón IgM anti humano HT2-280</td><td>Terraza Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PE anti-humano CD271(NGFR)</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Composición de los medios</td><td></td><td></td><td></td>de cultivo de organoides</tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult -ALI Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Epitelial de Vías Respiratorias Pequeñas Medio de crecimiento celular</td><td>PromoCell</td><td>C-21170</td><td></td></tr><tr><td>ThinCert Insertos de cultivo de tejidos, estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662641</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibidor de ROCK) 100mM stock (1000x)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Medio basal:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15290018</td><td>50 &micro; l</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>11330032</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100X)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>41400045</td><td>500 &micro; l</td></tr><tr><td>Mezcla antibiótica de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15640055</td><td>500 y micro; l SB431542</td></tr><tr><td>TGF-&beta; inhibidor de la vía (stock 100 mM)</td><td>Célula madre</td><td>72234</td><td>5 y micro; l</td></tr><tr><td>Lista de anticuerpos para inmunohistoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de desenmascaramiento de antígenos, vector a base de ácido cítrico</td><td></td><td>H-3300</td><td>937 y micro; l en 100 ml de agua</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos</td><td></td><td></td><td></td>primarios</tr><tr><td>Anti HT2-280</td><td>Terracebiotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXJ1 Anticuerpo monoclonal (2A5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-9965-82</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Uteroglobina/SCGB1A1 humanos</td><td>Anticuerpo Sistemas de investigación y desarrollo</td><td>MAB4218</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Queratina 5 Anticuerpo policlonal de pollo, purificado [Poly9059]</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal MUC5AC (45M1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-12178</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PDPN / Anticuerpo Podoplanina (clon 8.1.1)</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C143022-100</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Ratón purificado Anti-E-Cadherin</td><td>BD biosciences</td><td>610182</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Sox-2</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-365964</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpos</td><td></td><td></td><td></td>secundarios</tr><tr><td>Burro anti-conejo lgG, 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FITC anti-ratón Anticuerpo IgM</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-Hámster IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21113</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG1 anti-ratón para cabras, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con adsorción cruzada IgG2a anti-ratón para cabras, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con adsorción cruzada IgG2a para ratones y cabras, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21134</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG2b anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21144</td><td>1:500</td></tr><tr><td>tampones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de bloqueo de inmunohistoquímica <td>3% BSA, o.4% Triton-x100 en TBS (solución salina basada en Tris)</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de incubación de inmunohistoquímica <td>3% BSA, ).1% Triton-X100 en TBS</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de lavado de inmunohistoquímica <td>TBS con 0,1% Tween 20</td></tr></tbody></table>

aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Los modelos organoides epiteliales sirven como herramientas valiosas para estudiar la biología básica de un sistema de órganos y para el modelado de enfermedades. Cuando se cultivan como organoides, las células progenitoras epiteliales pueden autorrenovarse y generar una progenie diferenciadora que exhibe funciones celulares similares a las de sus contrapartes in vivo . A continuación describimos un protocolo paso a paso para aislar progenitores específicos de la región del pulmón humano y generar cultivos organoides 3D como herramienta experimental y de validación. Definimos las regiones proximales y distales del pulmón con el objetivo de aislar las células progenitoras específicas de la región. Utilizamos una combinación de disociación enzimática y mecánica para aislar las células totales del pulmón y la tráquea. Las células progenitoras específicas se fraccionaron de las células de origen proximal o distal utilizando la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS) basada en marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR para clasificar las células basales y HTII-280 para clasificar las células alveolares tipo II. Se utilizaron progenitores basales o alveolares aislados de tipo II para generar cultivos organoides 3D. Tanto los progenitores distales como los proximales formaron organoides con una eficiencia de formación de colonias del 9-13% en la región distal y del 7-10% en la región proximal cuando se chapan 5000 células / pozo en el día 30. Los organoides distales mantuvieron las células alveolares tipo II HTII-280+ en cultivo, mientras que los organoides proximales se diferenciaron en células ciliadas y secretoras para el día 30. Estos cultivos organoides 3D se pueden utilizar como una herramienta experimental para estudiar la biología celular del epitelio pulmonar y las interacciones mesenquimales epiteliales, así como para el desarrollo y validación de estrategias terapéuticas dirigidas a la disfunción epitelial en una enfermedad.

Fuente de tejido pulmonar La tráquea y el bronquio extrapulmonar (Figura 1A) se utilizaron como tejido fuente para el aislamiento de las células epiteliales de las vías respiratorias proximales y la posterior generación de organoides proximales. Se utilizó tejido pulmonar distal que incluye tanto parénquima como vías respiratorias pequeñas de menos de 2 mm de diámetro (Figura 1A) para el aislamiento de células epiteliales alveolares y de vías...

Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Los cultivos de organoides 3D son proximales en el epitelio pulmonar distal desarrollados mediante este protocolo. Proporciona un modelo manejable para estudiar los mecanismos fundamentales del mantenimiento del tejido pulmonar o la remodelación asociada a la enfermedad, y sirve como una plataforma eficaz para el descubrimiento y la validación de fármacos. Este protocolo es compatible con otros enfoques de fraccionamiento celular por disociación tisular.Y dado que las células progenitoras epiteliales se aíslan de diferentes compartimentos anatómicos y mantienen su identidad posicional in vitro, se puede utilizar para modelar diferencias regionales en las respuestas pulmonares a estímulos exógenos o endógenos. Esta técnica de nivel se puede utilizar para el aislamiento de diferentes subpoblaciones de células epiteliales, incluidas las células progenitoras específicas de la región que se pueden cultivar para producir una progenie diferenciada especializada representativa de la región de origen. Al recibir el tejido pulmonar, separe la tráquea proximal y los bronquios del epitelio pulmonar distal, que contiene pequeñas vías respiratorias de dos milímetros de diámetro o menos, y el tejido parenquimatoso circundante.Coloque las muestras en placas de Petri estériles individuales de 150 por 15 milímetros y corte la muestra de tejido distal en trozos cúbicos de aproximadamente un centímetro. Coloque las piezas en un tubo limpio de 50 milímetros y lave los pañuelos tres veces con HBSS fresco y frío por lavado. Después del último lavado, transfiera los pañuelos a una nueva placa de Petri y seque las piezas con toallitas antipelusa estériles.A continuación, utilice fórceps y tijeras para extirpar la mayor cantidad posible de pleura visceral antes de picar los tejidos en fragmentos de aproximadamente dos milímetros de diámetro. Para la digestión de fragmentos de tejido, agregue 50 microgramos por mililitro de liberasa y 25 microgramos por mililitro de ADN en 25 mililitros de HBSS estéril en un tubo cónico de 50 mililitros. Y agregue aproximadamente dos a tres gramos del tejido picado al tubo.Luego coloque los tejidos a 37 grados centígrados con agitación continua a 900 revoluciones por minuto durante 40 a 60 minutos. Después de 30 minutos, use una jeringa de 10 mililitros para triturar el tejido digerido y evitar la formación de grumos. Al final de la incubación, use una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 16 para triturar el tejido cinco veces.A continuación, utilice una pipeta de diámetro ancho para pasar la suspensión a través de una serie de filtros de celda bajo presión de vacío como se indica. Después de lavar el último colador con 20 mililitros de HBSS plus para recoger las células restantes, centrifugar los filtrados para recoger las células aisladas. Después de desechar los sobrenadantes, agregue un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos a los gránulos con un pipeteo suave antes de incubar las células durante un minuto con hielo.Al final de la incubación, agregue de 10 a 20 mililitros de HBSS más tampón para neutralizar la lisis y recoger las células restantes por centrifugación. Deplegar las células endoteliales CD31 positivas y las células inmunitarias CD45 positivas del conjunto de células totales utilizando las microesferas CD31 y CD45 conjugadas con anticuerpos monoclonales antihumanos CD31 y CD45 y columnas LS de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Para la tinción de la superficie celular para FACS, agregue los anticuerpos primarios apropiados de interés a la concentración requerida e incube las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.Al final de la incubación, lavar las células con tres mililitros de HBSS plus y marcar las células con la concentración adecuada de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos para una incubación de 30 minutos en hielo, según corresponda. Al final de la incubación, lave las células con tres mililitros de HBSS plus y vuelva a suspender las células a una concentración de 10 a la séptima célula por mililitro de HBSS plus antes de filtrar las células en tubos de poliestireno de cinco mililitros a través de una tapa de filtro para asegurar la formación de una suspensión de una sola célula. A continuación, añada un microgramo por mililitro de DAPI para teñir las células permeables.Para el enriquecimiento de las células progenitoras epiteliales del tejido proximal, diseccione las vías respiratorias proximales de los pulmones y use tijeras para abrir las vías respiratorias a lo largo de su longitud para exponer la luz. Cubrir los tejidos con 50 microgramos por mililitro de liberasa para una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados con agitación continua en una batidora. Al final de la incubación, transfiera el tejido a un plato estéril de 150 por 15 milímetros y use un bisturí para raspar suavemente la superficie de las vías respiratorias para eliminar completamente las células epiteliales luminales del tejido.A continuación, lave el plato con cinco mililitros de HBSS estéril más tampón para recoger todas las células epiteliales luminales desprendidas y transfiera las células a un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros. Triturar sucesivamente la suspensión cinco veces con una pipeta de 10 mililitros para obtener una suspensión de una sola celda. A continuación, recoja la suspensión por centrifugación.A continuación, vuelva a suspender el pellet en HBSS fresco más tampón en hielo. Use tijeras para cortar el tejido traqueobronquial restante a lo largo de sus anillos para generar pequeñas tiras de tejido. En un plato nuevo, use una hoja de afeitar de un solo lado para picar las tiras en pedazos más pequeños y transfiera los pedazos de tejido a tubos C que contengan dos mililitros de liberasa por tubo.A continuación, utilice el protocolo de pulmón humano dos en un disociador automatizado gentleMACS para disociar mecánicamente el tejido aún más. Al final de la disociación, transfiera aproximadamente dos gramos de tejido proximal picado a tubos cónicos de 50 mililitros que contengan 50 microgramos por mililitro de liberasa y 25 microgramos por mililitro de solución de ADN. Al final de una incubación de 45 minutos a 37 grados centígrados con agitación, filtre la suspensión de tejido a través de una serie de filtros, como se ha demostrado para el tejido pulmonar distal, y agregue un volumen igual de HBSS más tampón al filtrado para detener la digestión.Agregue las células luminales aisladas de la vía aérea proximal al tubo y recoja las células por centrifugación. A continuación, las células pueden enriquecerse mediante el aislamiento de microesferas y teñirse para obtener marcadores de superficie celular de interés, como se ha demostrado para las células del tejido pulmonar distal. Las vías respiratorias proximales revestidas por un epitelio pseudoestratificado incluyen abundantes células progenitoras basales que son inmunorreactivas para la proteína de membrana NGFR.Por el contrario, las células epiteliales que recubren los alvéolos incluyen un subconjunto que muestra inmunorreactividad de la membrana apical con el anticuerpo monoclonal HTII-280, lo que sugiere su identidad celular alveolar de tipo II. El agotamiento magnético de las células infectadas de la sangre roja, el sistema inmunitario y las células endoteliales da lugar a un enriquecimiento significativo de las poblaciones de células epiteliales en muestras de tejido distal y proximal, con el correspondiente aumento de la eficiencia de FACS. Una mayor depleción de FACS conduce a poblaciones de células distales altamente enriquecidas que se pueden fraccionar adicionalmente en función de su tinción superficial NGFR o HTII-280.Los cultivos de células epiteliales pulmonares distales positivas para HTII-280 producen organoides en rápida expansión con una eficiencia promedio de formación de colonias del 10%La tinción con inmunofluorescencia de los cultivos del día 30 revela que los organoides que contienen luz están compuestos predominantemente por células epiteliales pulmonares distales positivas para HTII-280 y SPC. Los organoides epiteliales pulmonares proximales cultivados a partir de células NGFR positivas dan como resultado la formación de organoides que contienen luz en el día 30 de cultivo con una eficiencia promedio de formación de colonias del 7,8%La optimización empírica de la asociación de tejidos enzimáticos es crítica para la preservación de los epítopos de superficie, lo que permite la tinción con inmunofluorescencia y el enriquecimiento de subconjuntos de células epiteliales viables para la posterior generación de cultivos organizados específicos de la región. Este método se puede adaptar para la identificación y el enriquecimiento de subconjuntos de células inmunitarias, vasculares, estromales y epiteliales y el desarrollo de modelos de cocultivo utilizando plataformas de chips de organoides en 3D.Recientemente hemos descrito el uso de organoides alveolares generados mediante esta técnica como plataforma para estudiar la infección por SARS-CoV-2 en el epitelio pulmonar humano y para la validación de fármacos en COVID-19.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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