Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq
August 25th, 2020
La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.
El objetivo de nuestro método es aislar núcleos de tumores frescos congelados y la misma preparación de núcleos se puede utilizar para estudios transcripcionales y epigenéticos. Por lo tanto, podemos hacernos varias preguntas clave como, ¿cómo evolucionan los tumores durante la progresión y cómo afectan las terapias a la composición tumoral? La mayor ventaja de este método es que es simple, reduce el tiempo de procesamiento y, lo que es más importante, produce núcleos de alta calidad.
La ausencia de un paso de clasificación reduce la tensión en los núcleos. Y la otra ventaja es su capacidad para ser utilizado en tumores congelados de archivo. El responsable de la demostración del procedimiento correrá a cargo de Ashwin Narayanan, becario postdoctoral de mi laboratorio.
Comience transfiriendo de 10 a 60 miligramos de muestra de tejido fresco congelado a una placa de Petri preenfriada. Picar o picar el pañuelo fresco congelado con una cuchilla de afeitar en trozos pequeños con hielo. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis de núcleos enfriados sobre el tejido en la placa de Petri.
Luego transfiera la mezcla a un douncer. Rebote los trozos de tejido con el mortero suelto durante unos 20 golpes hasta que se reduzca la fricción. A continuación, se agita con el mortero apretado durante 20 pasadas para lograr una homogeneización completa del tejido.
Transfiera el homogeneizado a un tubo de dos mililitros preenfriado y agregue un mililitro de tampón de lisis enfriado en el dosificador, enjuáguelo y agréguelo al tubo. Mézclalo suavemente e incubalo en hielo durante cinco minutos, mezclando con una punta de pipeta de diámetro ancho una o dos veces durante la incubación. Filtre todo el homogeneizado con una malla coladora de 30 microlitros y recoja en un tubo Falcon de 15 mililitros.
Luego transfiéralo nuevamente a un nuevo tubo preenfriado de dos mililitros. Un solo colador suele ser suficiente para todo el homogeneizado. Examine la muestra bajo un microscopio óptico para verificar la eliminación de residuos grandes y la integridad de la membrana nuclear.
No es necesario que los núcleos sean redondos y que la membrana nuclear no esté distorsionada. Si hay residuos, repita la filtración. A continuación, centrifuga los núcleos en una centrífuga de sobremesa durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 50 microlitros de la pelletza que contiene núcleos. Vuelva a suspender suavemente el pellet en otro mililitro de tampón de lisis de núcleos e incube durante cinco minutos en hielo. Repita la centrifugación, luego retire el sobrenadante sin alterar el pellet.
Añadir 500 mililitros de HB e incubar la muestra durante cinco minutos sin volver a suspender. A continuación, vuelva a suspender los núcleos en otro mililitro de HB. Centrifugar durante otros cinco minutos, luego retire el sobrenadante. Resuspender los núcleos en 200 microlitros de HB y transferir la suspensión a un nuevo tubo de dos mililitros.
Agregue 200 microlitros de solución de yodixanol al 50% a los núcleos para obtener una concentración final de 25% de yodixanol y mezcle 10 veces con la pipeta ajustada a 300 microlitros. A continuación, añada 300 microlitros de solución de yodixanol al 29% bajo la mezcla al 25% utilizando una punta fina P1000 para evitar que se mezclen las capas. Agregue 300 microlitros de solución de yodixanol al 35% debajo de la mezcla al 29% con una punta fina P1000, luego retírela lentamente.
Coloque las muestras en una centrífuga de cubo oscilante y gírelas durante 20 minutos a 3.500 G a cuatro grados centígrados con la rotura. Retire suavemente las muestras sin agitarlas y obsérvelas a la luz. Una banda blanca clara de núcleos con una pureza del 95% debe ser visible entre la segunda y la tercera capa.
Para aislar los núcleos, aspire las capas superiores para exponer la banda de núcleos blancos en la interfaz. Recoja la banda de núcleos en un volumen de 200 mililitros y transfiérala a un tubo nuevo. A continuación, fíltralo con un filtro de 20 micrómetros.
Revise los núcleos bajo un microscopio óptico para verificar la remoción de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Deben ser redondas y la membrana nuclear no debe estar distorsionada. Cuente los núcleos usando la tinción con azul de tripano en un hemocitómetro y alículos para snRNA-seq o snATAC-seq.
Varios pasos de filtración, junto con la centrifugación en gradiente, permiten el aislamiento de núcleos puros con la mayoría de los desechos desechados. La misma preparación de núcleos aislados se puede utilizar tanto para RNA-seq de un solo núcleo como para ATAC-seq de un solo núcleo. Dado que los núcleos aislados provienen de la misma muestra, los datos generados se pueden coincrustar utilizando paquetes de R como el Seurat para generar clústeres y proporcionar una perspectiva multiómica.
Para determinar si el protocolo es comparable a los conjuntos de datos publicados, los datos obtenidos se compararon con cuatro estudios de secuenciación de ARN de un solo núcleo disponibles públicamente relacionados con el sistema nervioso central. Todos los conjuntos de datos se fusionaron y la distribución del número de UMI y genes se visualizó utilizando un diagrama de violín. El resultado indicó que el método es comparable al último protocolo snRNA-seq.
Al intentar este protocolo, es importante tener mucho cuidado y no mezclar las capas durante la centrifugación en gradiente y el aislamiento de núcleos.
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Visión general
Este estudio presenta un protocolo simple y eficiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma recién congelados. El método está diseñado para estudios de secuenciación de ARN y ATAC de núcleo único, abordando la heterogeneidad intratumoral en gliomas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Genómica
Antecedentes
- La heterogeneidad intratumoral es una característica común de los tumores.
- Entender la evolución del tumor y los efectos de la terapia es crucial para el tratamiento.
- El aislamiento de núcleos de alta calidad es esencial para un análisis preciso.
- Los tumores congelados archivados también pueden utilizarse con este método.
Propósito del estudio
- Aislar núcleos de tumores recién congelados para investigación.
- Facilitar estudios transcripcionales y epigenéticos.
- Explorar la evolución del tumor y la respuesta a las terapias.
Métodos utilizados
- Combinación de tampones y centrifugación de gradiente.
- Aislamiento de núcleos individuales de tejidos de glioma.
- Sin paso de clasificación para minimizar el estrés en los núcleos.
- Aplicable tanto a tumores frescos como archivados congelados.
Principales resultados
- El método produce núcleos de alta calidad adecuados para secuenciación.
- El tiempo de procesamiento se reduce significativamente.
- Demostrado por Ashwin Narayanan, un becario postdoctoral.
- Apoya múltiples aplicaciones posteriores en investigación de tumores.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para estudiar la heterogeneidad de gliomas.
- Mejora la comprensión de la dinámica tumoral.
- Proporciona una herramienta confiable para futuras investigaciones en oncología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolating high-quality nuclei from archival frozen brain tumor samples enables scalable multi-omics analysis without fresh tissue constraints. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in glioma drug discovery by providing reproducible molecular profiles from biobanked specimens. The method reduces processing time and technical variability, accelerating preclinical target characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor heterogeneity and clonal evolution from archival specimens.
- Operational Value: Eliminates need for fresh tissue processing, increasing sample throughput and biobank utilization.
- Predictive Value: Provides matched epigenomic and transcriptomic data for de-risking therapeutic targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized nuclei suspensions suitable for high-throughput snRNA-seq and snATAC-seq platforms.
- Operational Value: Uses gradient centrifugation and filtration to remove debris, ensuring assay-ready inputs.
- Scalability: Compatible with 10x Genomics and similar microfluidic systems for large-scale screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase molecular profiling to preclinical models using consistent sample preparation.
- Mechanistic De-risking: Enables co-embedding of chromatin accessibility and gene expression data to clarify regulatory mechanisms.
- Predictive Confidence: Supports biomarker-aligned target prioritization through multi-omics concordance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized input for multi-omic profiling of brain tumors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on tumor evolution and therapy response using archival cohorts.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible nuclei yields for downstream sequencing applications.
- Analytics: Enables UMI and gene distribution analysis for quality control and cross-study comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment through matched snRNA-seq and snATAC-seq from the same nuclei.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation workflow for frozen tumor biobanks across oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking chromatin state to transcriptional output in glioma.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation across sites, improving reproducibility and reducing pre-analytical variance.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling retrospective analysis of archival tumor collections.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target selection through multi-omic validation from preserved specimens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization and gradient centrifugation techniques.
- Dependent on access to swinging bucket centrifuges and iodixanol gradient preparation.
- Necessitates standardized filtration and staining protocols for nuclei quantification.
- Adaptation may be needed for non-glioma tumor types based on lysis buffer optimization.
- Practical limitation: Gradient purity depends on careful layer separation to avoid contamination.
