Name: Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprende a aislar núcleos de tumores cerebrales congelados para estudios de RNA-seq y ATAC-seq de un solo núcleo. Este método eficiente facilita investigaciones sobre heterogeneidad tumoral y evolución del glioma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Single Cell Open Lab (scOpenLab) en el Centro Alemán del Cáncer (DKFZ) por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por la subvención número 70111964 (S.T.) de la Ayuda Alemana contra el Cáncer, Programa Max-Eder.

Se obtuvieron muestras frescas de glioma congeladas del banco de tejidos del Centro Nacional de Enfermedades Tumorales (NCT) en Heidelberg, Alemania. El uso de material para pacientes fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Heidelberg, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio.
1. Preparación experimental
<ol><li>Realice todos los pasos sobre hielo o a 4 °C.</li>
	<li>Tubos pre-fríos, platos, cuchillas de afeitar, Douncers y morteros a 4 °C.</li>
	<li>Prepare todos los búferes con anticipación. Estos tampones son estables a temperatura ambiente. Se recomienda la filtración estéril, especialmente para la sacarosa. Las preparaciones de stock se modifican a partir de Corces et al.19. Véanse los cuadros 1 a 7.</li>
	<li>Retire las muestras del almacenamiento en el congelador de nitrógeno líquido o -80 °C y manténgalo en hielo seco hasta el Paso 2.1.</li>
</ol>2. Disección y disociación tisular
<ol><li>Transfiera una muestra de tejido fresco congelado (10-60 mg) a una placa de Petri preenfriada. Picar / picar tejido fresco congelado con una cuchilla de afeitar a trozos pequeños en hielo.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de lisis de núcleos refrigerados a un tubo de 1,5 ml pre-refrigerado. Coloque las piezas de tejido en el tubo de 1,5 ml que contiene el tampón de lisis de núcleos y transfiéralos a un Douncer(Tabla de Materiales). NOTA: Hay dos morteros homogeneizadores Dounce: mortero "suelto" o "A" para la reducción inicial de la muestra y mortero "apretado" o "B" para la homogeneización completa de la muestra.</li>
	<li>Dobla las piezas de tejido con el mortero "suelto" durante unos 20 golpes, hasta que se reduzca la fricción. Si hay escombros, la muestra puede ser pre-limpiada por filtración con un colador de 100 mm.</li>
	<li>Donce con el mortero "apretado" durante 20 golpes para lograr la homogeneización completa del tejido.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado (aproximadamente 500 μL) a un tubo pre-enfriado de 2 ml. Añadir 1 ml de tampón de lisis refrigerado. Mezclar suavemente e incubar sobre hielo durante 5 min. Mezcle suavemente con una punta de pipeta de orificio ancho y repita 1-2 veces durante la incubación.</li>
	<li>Filtre todo el homogeneizado utilizando una malla de colador de 30 μm, recójalo en un tubo Falcon de 15 ml y transfiéralo de nuevo a un nuevo tubo preenfriado de 2 ml. Un solo colador suele ser suficiente para todo el homogeneizado.</li>
	<li>Verifique bajo un microscopio de luz para verificar la eliminación de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe distorsionarse. Si hay escombros, los núcleos se pueden volver a filtrar.</li>
	<li>Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de sobremesa. Retire el sobrenadante, dejando atrás ~ 50 μL con un gránulo que contenga los núcleos. Resuspenda suavemente el pellet en otro 1 ml de tampón de lisis de núcleos e incube durante 5 minutos en hielo.</li>
	<li>Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4°C. Retire el sobrenadante sin molestar el pellet, agregue 500 ml de tampón de homogeneización (HB) 1x(Tabla 4)e incube durante 5 min sin resusptar. Luego, resuspenda los núcleos en otros 1.0 mL de 1x HB.</li>
	<li>Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y resuspante suavemente los núcleos en 200 μL de 1x HB en un nuevo tubo de 2.0 mL.</li>
</ol>3. Centrifugación por gradiente
<ol><li>Añadir 200 μL de solución de iodixanol al 50% (Tabla 5) para dar una concentración final de iodixanol al 25%. Mezclar bien 10 veces con juego de pipetas a 300 ml.</li>
	<li>Añadir 300 μL de solución de iodixanol al 29% (Tabla 6) bajo la mezcla al 25%. Use una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas.</li>
	<li>Añadir 300 μl de solución de iodixanol al 35% (Tabla 7) debajo de la mezcla al 29%. Use una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas. Precaución: Este paso requiere la extracción gradual de la punta de la pipeta durante el pipeteo para evitar el desplazamiento excesivo del volumen.</li>
	<li>Coloque las muestras en una centrífuga de cucharón oscilante, gire durante 20 min a 3.500 x g a 4 ° C con el freno apagado.</li>
	<li>Retire suavemente las muestras sin agitar y observe bajo la luz. Una banda blanca clara de 95% de núcleos puros debe ser visible entre la segunda y tercera capa(Figura 1).</li>
</ol>4. Aislamiento de núcleos
<ol><li>Aspirar las capas superiores hasta la banda de núcleos blancos en la interfase de 29%-35%.</li>
	<li>Recoger la banda de núcleos en un volumen de 200 ml, transferir a un tubo fresco y filtrar con un filtro de 20 μm (Tabla de materiales). NOTA: Los núcleos no necesitan ser resuspendidos antes de la filtración.</li>
	<li>Verifique bajo un microscopio de luz para verificar la eliminación de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe distorsionarse.</li>
	<li>Cuente los núcleos utilizando la tinción azul de Tripano en un hemocitómetro y los núcleos alícuotas para snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. ARN de núcleos individuales y ATAC seq
<ol><li>Procese inmediatamente los núcleos utilizando los kits de expresión génica unicelular y reactivo ATACunicelular (Tabla de Materiales). NOTA: Las concentraciones de muestra de núcleos para el sistema 10x Genomics son 1500-3000 núcleos por μL para snRNA-seq, y 3500-7000 nucleis por m μL para snATAC-seq. Los núcleos se pueden diluir usando 1x PBS.</li>
	<li>Secuenciar las bibliotecas resultantes en el Genomics Core Facility.</li>
	<li>Realizar análisis de control de calidad de los datos. Los núcleos se incluyen para un análisis posterior si contienen Identificador Molecular Único (UMI) >1000, número de genes >500 y porcentaje de genes mitocondriales <5%, y están dentro de la media + tres desviaciones estándar de las UMI y los genes.</li>
</ol>

<ol><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+cancer%3A+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Filbin, M. G., Suva, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+Genomics+and+Epigenomics%3A+Arriving+at+the+Start+and+Knowing+It+for+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time.</a> Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).</li>
<li>Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+gliomas%3A+from+morphology+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archive%22%5BJournal%5D)">Characterization of gliomas: from morphology to molecules.</a> Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).</li>
<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Eckel-Passow, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+Groups+Based+on+1p%2F19q%2C+IDH%2C+and+TERT+Promoter+Mutations+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+and+clonal+architecture+in+grade+II+and+III+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas.</a> Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Noushmehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+CpG+island+methylator+phenotype+that+defines+a+distinct+subgroup+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma.</a> Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+and+IDH2+mutations+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">IDH1 and IDH2 mutations in gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).</li>
<li>Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+metabolic+enzymes+are+at+the+origin+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas.</a> Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>Tanay, A., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+single-cell+genomics+from+phenomenology+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism.</a> Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).</li>
<li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Cytometry+for+Single-Cell+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).</li>
<li>Schwartzman, O., Tanay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+techniques+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Multiomics%3A+Multiple+Measurements+from+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Mathys, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Al-Dalahmah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq+identifies+Huntington+disease+astrocyte+states%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).</li>
<li>Jakel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+human+oligodendrocyte+heterogeneity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis.</a> Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. , (2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+analysis+of+transcriptional+and+epigenetic+states+in+the+human+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain.</a> Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Bready, D., Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathogenesis+of+Low-Grade+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).</li>
<li>Venteicher, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+genetics%2C+lineages%2C+and+microenvironment+in+IDH-mutant+gliomas+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq.</a> Science. 355 (6332), (2017).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Weng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+Uncovers+Glial+Progenitor+Diversity+and+Cell+Fate+Determinants+during+Development+and+Gliomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).</li>
<li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrative+Model+of+Cellular+States%2C+Plasticity%2C+and+Genetics+for+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li>
<li>Al-Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+reveals+intratumoral+epigenetic+heterogeneity+in+IDH1+mutant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El campo de la heterogeneidad intramoral se encuentra en una etapa emocionante, con nuevos ensayos y plataformas que se están desarrollando para desafiar y expandir el conocimiento existente. La heterogeneidad intramoral es un factor crucial que contribuye a la progresión de la enfermedad y a la resistencia a las modalidades de tratamiento actuales en los gliomas28. Estudios recientes sobre tumores cerebrales se han centrado en este importante aspecto mediante el uso de ensayos transcriptómicos y ...

Los gliomas difusos de grado inferior (LGG), el tumor cerebral primario más común en adultos, son neoplasias infiltrativas que a menudo surgen en el hemisferio cerebral. Los LGG exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral, que no solo es impulsada por la población tumoral sino también por las células no malignas intrincadamente involucradas en el desarrollo y la progresión del tumor1,2,3,4,5.
Durante la última década, ha habido una avalancha de datos genómicos recopilados en el campo de los gliomas. Estos datos provienen principalmente de estudios de secuenciación tumoral a granel y han contribuido enormemente a la caracterización molecular, y a la clasificación actual de los tumores cerebrales5,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, a pesar de que estos estudios revelaron el amplio panorama molecular asociado con los gliomas, todavía hay una decepcionante falta de progreso con respecto a la intervención terapéutica. Uno de los obstáculos para la resistencia al tratamiento en los tumores cerebrales es la heterogeneidad intratitumoral. Para abordar este problema, diversos estudios se han centrado en la heterogeneidad genómica, transcriptómica, proteómica y epigenética presente dentro de un tumor a nivel de una sola célula12,13,14,15,16,17.
Aunque ha habido avances tecnológicos notables en el campo de una sola célula en los últimos años, uno de los principales factores limitantes es la disponibilidad de especímenes frescos necesarios para aislar las células y realizar estos experimentos. Para superar esta limitación, ha habido varios intentos exitosos de realizar ensayos, como snRNA-seq y snATAC-seq de tejidos congelados, utilizando núcleos en lugar de células18,19. La mayoría de estos métodos se basan en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o en estrategias de filtración. Tanto los enfoques de células individuales como de núcleos individuales tienen sus fortalezas e inconvenientes. Los enfoques de una sola célula mantienen las transcripciones mitocondriales, que aunque pueden ser informativas, también pueden reducir la cobertura del transcriptoma debido a su alta abundancia. Los enfoques de aislamiento de núcleos individuales eliminan un alto porcentaje de la fracción mitocondrial, lo que permite una cobertura más profunda de las transcripciones nucleares20.
Hay varias plataformas disponibles comercialmente que se han utilizado en los últimos años para analizar datos genómicos de células individuales, incluidos RNA-seq y ATAC-seq. Una de las plataformas más destacadas es la plataforma 10x Genomics Chromium para la expresión génica de una sola célula y el perfil ATAC de una sola célula. Como la plataforma funciona con la ayuda de cámaras microfluídicas, cualquier residuo o agregado puede obstruir el sistema, lo que lleva a la pérdida de datos, reactivos y muestras clínicas valiosas. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende en gran medida del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.
El protocolo que demostraremos aquí es una combinación ligeramente modificada de los protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq, y utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq para comprender los trastornos neurológicos y los tipos de células neuronales en el cerebro humano18,19,21,22,23,24. El protocolo utiliza una combinación de disociación enzimática/mecánica de muestras congeladas seguida de filtración y centrifugación por gradiente y permite un aislamiento rápido y preciso de núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados. Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar datos de snRNA-seq y snATAC-seq a partir de la misma preparación de núcleos a partir de muestras de tumores cerebrales.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td>Sigma 21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas</td><td>Motivo activo</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 352096 <td></td></tr><tr><td>Iodixanol (también conocido como Optiprep)</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td></td><td>Sigma 63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de núcleos: Núcleos EZ Prep</td><td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación (20 y micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de bloqueo seguro 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de bloqueo seguro 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Single Cell ATAC</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expresión génica de una sola célula</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de diámetro ancho (1000 y micro; L)</td> <td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de diámetro ancho (200 y micro; L)</td> <td>Themo Fisher Científico</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para rna-seq de un solo núcleo y atac-seq

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Los gliomas difusos adultos exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral. Hasta hace poco, la mayoría de los esfuerzos de perfiles moleculares a gran escala se han centrado en enfoques masivos que condujeron a la clasificación molecular de los tumores cerebrales. En los últimos cinco años, los enfoques de secuenciación de células individuales han destacado varias características importantes de los gliomas. La mayoría de estos estudios han utilizado muestras de tumores cerebrales frescos para aislar células individuales utilizando citometría de flujo o métodos de separación basados en anticuerpos. En el futuro, el uso de muestras de tejido fresco congelado de biobancos proporcionará una mayor flexibilidad a las aplicaciones de una sola célula. Además, a medida que avance el campo unicelular, el próximo desafío será generar datos multiómicos a partir de una sola célula o de la misma preparación de muestras para desentrañar mejor la complejidad del tumor. Por lo tanto, los protocolos simples y flexibles que permiten la generación de datos para diversos métodos, como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) serán importantes para el campo.
Los avances recientes en el campo de una sola célula, junto con instrumentos microfluídicos accesibles, como la plataforma genómica 10x, han facilitado las aplicaciones de células individuales en laboratorios de investigación. Para estudiar la heterogeneidad de los tumores cerebrales, desarrollamos un protocolo mejorado para el aislamiento de núcleos individuales de gliomas frescos congelados. Este protocolo combina los protocolos existentes de una sola célula y combina un paso de homogeneización seguido de filtración y centrifugación de gradiente mediado por tampón. Las muestras resultantes son suspensiones puras de núcleos individuales que se pueden utilizar para generar datos de expresión génica de un solo núcleo y accesibilidad a la cromatina a partir de la misma preparación de núcleos.

La genómica de núcleo único es un campo en evolución con datos y protocolos limitados. Un factor crítico que influye en el resultado de los ensayos de núcleos individuales es el aislamiento de núcleos puros e intactos. Combinamos dos protocolos publicados (protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq) para aislar núcleos puros y de alta calidad de bloques de tejido de glioma frescos congelados en un tiempo relativamente corto, manteniendo así la estabilidad de las transcripciones(Figura 1).
<p c...

La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.

Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

El objetivo de nuestro método es aislar núcleos de tumores frescos congelados y la misma preparación de núcleos se puede utilizar para estudios transcripcionales y epigenéticos. Por lo tanto, podemos hacernos varias preguntas clave como, ¿cómo evolucionan los tumores durante la progresión y cómo afectan las terapias a la composición tumoral? La mayor ventaja de este método es que es simple, reduce el tiempo de procesamiento y, lo que es más importante, produce núcleos de alta calidad.La ausencia de un paso de clasificación reduce la tensión en los núcleos. Y la otra ventaja es su capacidad para ser utilizado en tumores congelados de archivo. El responsable de la demostración del procedimiento correrá a cargo de Ashwin Narayanan, becario postdoctoral de mi laboratorio.Comience transfiriendo de 10 a 60 miligramos de muestra de tejido fresco congelado a una placa de Petri preenfriada. Picar o picar el pañuelo fresco congelado con una cuchilla de afeitar en trozos pequeños con hielo. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis de núcleos enfriados sobre el tejido en la placa de Petri.Luego transfiera la mezcla a un douncer. Rebote los trozos de tejido con el mortero suelto durante unos

nuclei-isolation-from-fresh-frozen-brain-tumors-for-single-nucleus

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe el protocolo para aislar núcleos individuales de tejido de glioma fresco congelado. Los núcleos individuales aislados se pueden utilizar como muestras para técnicas de secuenciación como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA) y el ensayo de un solo núcleo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATAC) para obtener una visión más profunda de la heterogeneidad inter e intratumoral observada en el glioma de los tejidos nerviosos centrales.

Aislamiento de núcleos de tejidos frescos congelados de glioma: un método para obtener núcleos intactos a partir de muestras de tumores de glioma

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

Hemos desarrollado un método que enriquece y aísla poblaciones de astrocitos humanos a partir de tejido fresco congelado para su uso en análisis moleculares posteriores.

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de alta calidad de riñones de ratones congelados que mejoran la representación de los tipos de células renales medulares y evitan los artefactos de expresión génica de la disociación enzimática del tejido.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de tejidos hepáticos archivados congelados por flash para RNA-seq de núcleo único, ATAC-seq y multiómica articular (RNA-seq y ATAC-seq).

Aislamiento de núcleos de tejido hepático congelado rápidamente para multiómica unicelular

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.

Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma

Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación y el análisis posterior de organoides cerebrales humanos utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo.

Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

Aprende a aislar núcleos de tumores cerebrales congelados para estudios de RNA-seq y ATAC-seq de un solo núcleo. Este método eficiente facilita investigaciones sobre heterogeneidad tumoral y evolución del glioma.

Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq

Explorar más videos