Mitigación de la fijación de células de flujo sanguíneo a implantes metálicos a través de la inmovilización de péptidos derivados de CD47

Este protocolo incluye una novedosa estrategia química para añadir péptidos terapéuticos a superficies metálicas, y tiene el potencial de mejorar la biocompatibilidad de una amplia gama de biomateriales metálicos. Esta es una técnica universal y robusta para añadir péptidos y proteínas terapéuticas a las superficies metálicas desnudas de los bioimplantes. Hemos utilizado esta tecnología para mejorar la biocompatibilidad de los stents metálicos añadiendo péptidos CD47 con el fin de prevenir las respuestas de inflamación que se desencadenan por el stent.

Comience lavando los cupones de papel de aluminio inoxidable o discos de malla con 2-isopropanol en una coctelera durante cinco minutos. Realice este lavado dos veces y luego lave las muestras dos veces con cloroformo durante 10 minutos por lavado. Coloque las muestras de acero inoxidable limpias en un horno a 220 grados Celsius durante 30 minutos.

Sumerja las láminas horneadas o los discos de malla en una solución acuosa del 0,5% de PABT y escóndalas en una coctelera durante una hora. Lave las muestras modificadas por PABT con agua destilada desionizada cinco veces. Transfiera las muestras a un vial nuevo y repita los lavados.

Tratar las muestras con TCEP durante 15 minutos a temperatura ambiente en una coctelera. Desgasaizó el agua destilada en un matraz de fondo redondo con un dispositivo generador de vacío, como un liofilizador, y lave las láminas o discos de malla con el agua desgasificada cinco veces. Transfiera las muestras a un vial nuevo y repita los lavados.

Preparar cinco mililitros de solución 1%PEI-PDT diluyendo 212,5 microlitros de la población PEI-PDT y 125 microlitros de 0,4 molar de acetato de sodio en el agua desgasal. Incubar las muestras de acero inoxidable lavadas con 1%PEI-PDT. Reemplace el aire con gas de argón, selle los viales herméticos y mezcle en una coctelera durante una hora.

Proceda inmediatamente con la conjugación del péptido o almacene las muestras en cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana. Preparar un miligramo por mililitro de solución de péptido humano CD47 disolviendo el péptido humano CD47 polvo en ácido acético desgasificación 50%, luego preparar la solución de trabajo disolviendo 500 microlitros de la acción en 4.5 mililitros de PBS desgased. Incubar las muestras lavadas con PEI-PDT con la solución de trabajo del péptido CD47 a temperatura ambiente con agitación durante una hora.

Cuando haya terminado, lave las muestras recubiertas con péptido CD47 como se describe en el manuscrito de texto. Después de recubrir las láminas de metal con péptido CD47 o péptido revuelto, corte tubos de PVC de cuarto de pulgada en tres piezas de 38 centímetros de largo e inserte hasta ocho láminas metálicas no modificadas, péptidos revueltos o péptidos cd47, en tres tubos diferentes. Recoger 30 mililitros de sangre de donantes humanos sanos libres de cualquier medicamento antiplaquetario, precargando la jeringa con un mililitro de 4%citrato de sodio para evitar la coagulación de la sangre recogida.

Coloque 10 mililitros de sangre en cada tubo con una jeringa de 10 mililitros y conecte los extremos con adaptadores metálicos. Coloque los tubos llenos de sangre en las ruedas del aparato de bucle Chandler y pase la sangre a lo largo de las láminas metálicas por rotación de la rueda a 37 grados Celsius durante cuatro horas. Escurra la sangre de los tubos y deséchela de acuerdo con los requisitos de la IRB, luego corte los tubos con un bisturí para recuperar las láminas.

Preparar una solución de glutaraldehído al 2%mediante la dilución de la solución del 70% en tampón de cacodilato sódico con cloruro de sodio molar 0,1. Incubar las láminas en la solución de glutaraldehído al 2% durante 15 minutos y almacenarlas a cuatro grados centígrados durante la noche. Antes de analizar las láminas metálicas, lávelas tres veces con PBS.

Caliente ocho mililitros de PBS en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Preparar 10 solución de material de tinte CFDA milimio añadiendo 90 microlitros de DMSO a un vial CFDA, luego prepare la solución de trabajo agregando 75 microlitros de la acción CFDA al PBS caliente. Invierta el tubo un par de veces para mezclarlo y cubrirlo con papel de aluminio.

Coloque cada lámina en un mililitro de tinte CFDA en una placa de 24 pozos. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos, luego lave las láminas tres veces en PBS e pídalas con un microscopio de fluorescencia. La concentración de péptido conjugado TAMRA unido covalentemente CD47 se cuantificó para determinar la densidad máxima de inmovilización del péptido en la superficie metálica.

La retención máxima de péptidos fue de aproximadamente 180 nanogramos por centímetro cuadrado, lo que se logró con una concentración de entrada de 100 microgramos por mililitro. La inmovilización del péptido conjugado TAMRA CD47 en las superficies metálicas modificadas fue corroborada por microscopía de fluorescencia, que mostró una fluorescencia uniforme emitida desde la superficie de los discos de malla conjugados con péptidos conjugados TAMRA CD47. Sólo se detectó una fluorescencia mínima en la superficie de las mallas de control que carecía de la modificación, excluyendo así un péptido conjugado TAMRA no específicamente enlazado CD47 como la principal fuente de fluorescencia.

También se confirmó que las superficies recubiertas de péptido CD47 muestran una reducción drástica en la fijación celular transmitida por la sangre en comparación con los controles de péptido modificados y no modificados revueltos. Los monocitos aislados de las células de la capa de rata se cultivaron en láminas de acero inoxidable modificadas en metal desnudo y péptidos CD47. Se observó una atenuación del 58% de la unión aguda de monocitos, su conversión a macrófagos y la proliferación de macrófagos en las superficies funcionalizadas.

Al intentar este protocolo, es muy importante realizar los pasos que implican agua desgasificación o reactivos que se realizarán lo más rápido posible y minimizar la exposición al oxígeno. Nuestra tecnología modula selectivamente la interacción celular con superficies metálicas y un ensayo típico de identificación de tipo celular, como RT-PCR, citometría de flujo e inmunofluorescencia, son compatibles con esta técnica. Cuando se desarrolla para una gama de péptidos bioactivos, esta tecnología puede ser fundamental para aumentar la biocompatibilidad en la interfaz del material tisular.