Evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base mediados por CRISPR

Al inducir eficientemente mutaciones puntuales utilizando el editor de bases de citosina mediada por CRISPR, se puede identificar la funcionalidad de las variantes brca1, que es importante para la prevención y el diagnóstico de enfermedades. La ventaja de esta técnica es que muta directamente brca1 expresado endógenamente, que supera la limitación de la evaluación funcional utilizando BRCA1 expresado exógeno. La identificación de la pérdida de mutaciones funcionales de BRCA1 se puede utilizar para predecir la posibilidad de desarrollar cánceres asociados con mutaciones brca1, como cánceres de mama, ovario, próstata y páncreas.

También se puede utilizar para encontrar objetivos potenciales de fármacos mediante la búsqueda de genes esenciales cuya viabilidad se reduce a través del agotamiento funcional. Para empezar, obtenga la secuencia del genoma BRCA1 de GenBank en NCBI y busque en los 20 sitios objetivo del par base con la secuencia de motivos adyacentes protoespaciales, NGGNCCN, alrededor de la mutación de interés. La mutación de interés debe ubicarse dentro de cuatro a ocho nucleótidos en el extremo PAM-distal de las secuencias objetivo de ARN guía.

Pida dos oligonucleótidos gratuitos por ARN guía. Para los oligonucleótidos delanteros, agregue CACCG al 5'final de la secuencia guía y para los oligonucleótidos inversos, agregue AAC al 5'end y C al 3'end. Después de recibir los oligonucleótidos, los resuspendieron en agua destilada a una concentración final de 100 micromolares.

Mezcle los dos oligonucleótidos gratuitos a una concentración final de 10 micromolares con tampón de ligadura T4 y calentarlos a 95 grados Celsius durante cinco minutos y luego enfríe a temperatura ambiente para recocido. Digerir pRG2 usando la enzima de restricción Bsa1 durante una hora a 37 grados Celsius, luego ejecutar el producto digerido en un gel de 1% de agarose y purificar la banda de tamaño adecuado. Ligar el dúplex de oligonucleótido recocido al ADN vectorial utilizando el ligasa de ADN comprado de acuerdo con el protocolo del fabricante y transformarlos en células competentes DH5-alfa.

Agregue los transformadores a una placa de agar que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina e incubar la placa durante la noche a 37 grados Centígrados. Purifique el ADN plasmático de varios transformadores y analice sus secuencias de ARN guía por secuenciación de Sanger con imprimaciones que primen en el promotor U6. Sembrar cinco veces 10 a la quinta células HAP1-BE3 por pozo en placas de 24 pozos un día antes de la transfección y cultivo de ellos para llegar al 70 a 80% de confluencia para la transfección.

Transfecta la guía de segmentación BRCA1 RNAs utilizando los reactivos de transfección comprados de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice un microgramos de RNA guía de segmentación BRCA1 para inducir la conversión de CG a TA en los sitios objetivo brca1 y luego incubar las células a 37 grados Celsius y subcultura cada tres a cuatro días. Cosecha los pellets celulares tres, 10 y 24 días después de la transfección para analizar la eficiencia de edición de la base.

Extraiga ADN genómico usando el kit de purificación genómica del ADN. Diseñe las primeras imprimaciones pcr para amplificar los sitios de destino BRCA1. Aunque no hay ninguna restricción en el tamaño del primer producto PCR, se recomienda un tamaño de producto de menos de un kilobases para amplificar eficientemente una región específica.

Diseñe las segundas imprimaciones PCR ubicadas dentro del primer producto PCR, teniendo en cuenta el tamaño del amplificador de acuerdo con la longitud de lectura NGS. Para adjuntar secuencias esenciales para el análisis NGS, agregue secuencias adicionales a los 5'extremos de las segundas imprimaciones PCR. Amplificar los sitios objetivo BRCA1 en el ADN genómico obtenido de los tres puntos de tiempo utilizando polimerasa de alta fidelidad.

Para la primera reacción PCR, utilice 100 nanogramos de ADN genómico para amplificación durante 15 ciclos. Para la segunda reacción PCR, utilice un microlitro del primer producto PCR para amplificación durante 20 ciclos. Ejecute cinco microlitros del segundo producto PCR en gel de 2% agarose y confirme el tamaño.

A continuación, adjunte las secuencias esenciales para el análisis NGS amplificando el segundo producto PCR utilizando las imprimaciones enumeradas en el manuscrito de texto. Amplifica cada muestra usando diferentes conjuntos de imprimación. Utilice un microlitro del segundo producto PCR para hasta 30 ciclos de amplificación con una polimerasa de alta fidelidad.

Ejecute cinco microlitros del producto PCR en gel de 2% agarose para confirmar el tamaño y purificar el amplificador utilizando un kit comercial de limpieza de PCR. Mezcle cada muestra en cantidades iguales para crear una biblioteca NGS. Cuantificar la biblioteca NGS usando un espectrofotómetro y diluirla a una concentración de un nanomolar utilizando búfer de resuspensión o Tris-HCl de 10 mililitros a pH 8.5.

Preparar 100 microlitros de la biblioteca diluidos a la concentración de carga adecuada. Como control combinó PhiX con la muestra diluida. Cargue la biblioteca en el cartucho y ejecute NGS de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Obtenga más de 10.000 lecturas por amplificador objetivo para un análisis en profundidad de la eficiencia de edición base. Este protocolo se utilizó para realizar una evaluación funcional de las variantes endógenas BRCA1 generadas por editores base de citosina basados en CRISPR. Cas-9 y RNA guía fueron transfectados en líneas celulares HAP1 para interrumpir BRCA1, y se analizaron las frecuencias de mutación.

Las frecuencias de mutación disminuyeron significativamente con el tiempo en las líneas celulares HAP1, lo que indica que BRCA1 es un gen esencial para la viabilidad celular en estas células. Para investigar si las variantes sustituidas por CG a TA afectan la función de BRCA1, se transfectaron los plásmidos de ADN y los RNA de guía de codificación que podrían inducir cada mutación a tener líneas celulares HAP1-BE3. Y se analizaron las frecuencias de sustitución.

Las frecuencias de sustitución relativas de 3598C a T, una variante patógena que induce una mutación sin sentido, disminuyeron drásticamente. Mientras que los de 4527C a T, una variante benigna que induce una mutación sin sentido, se mantuvieron similares con el tiempo. Se encontró que las frecuencias de sustitución de nucleótidos de estas tres variantes disminuyeron de manera dependiente del tiempo.

Dado que es necesario obtener una alta frecuencia de mutación inicial para reconocer claramente el cambio en la viabilidad celular con el paso de la fecha, es una prioridad establecer condiciones de transfección optimizadas. Este procedimiento se puede aplicar para verificar otras variantes genéticas desconocidas como BRCA VUS. Puede proporcionar pistas sobre la patogenicidad de las variantes desconocidas derivadas del paciente y su tratamiento.