Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados

La terapia de educador de células madre fue desarrollada para tratar la diabetes tipo I y la otra enfermedad autoinmune. Este método fue desarrollado para explorar el mecanismo de molécula subyacente a la moderación inmune de la terapia de educador de células madre a través de EXOsomas liberados CB-SC. Este protocolo proporciona orientación sobre cómo purificar exosomas de cultivos de células madre de sangre de cordón umbilical humano y determinar su modulación inmune de monocitos.

Demostrando el procedimiento estará Wei Hu, un estudiante de doctorado, de mi laboratorio. Para empezar, centrifugar el medio condicionado derivado de CB-SC tres veces como se describe en el manuscrito de texto, recogiendo el sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros después de cada centrifugación. Después de la tercera centrifugación, filtre el sobrenadante obtenido con un filtro de microlitro de 0,22 microlitros y transfiera 15 mililitros de medios a cada unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton.

Centrífugas a 4.000 x g durante 30 minutos para aislar los medios exosoma concentrados. Transfiera los exosomas concentrados a un tubo de ultracentrífuga. Luego pele los exosomas a 100.000 x g durante 80 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend los exosomas peletados en 10 mililitros de PBS. Realizar una ultracentrifugación final para recoger el pellet de exomo y resuspend en 200 microlitros de PBS. Añadir 30 millones de PBMC humanos a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Resuspender las células en 300 microlitros de PBS frío y añadir 60 microlitros de microperlas CD14. Mezclar bien e incubar las células sobre hielo durante 15 minutos. Añadir seis mililitros más de PBS frío y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, resuspender las células peletizadoras en 500 microlitros de búfer de funcionamiento en frío. Coloque la columna de separación en el separador de imán y lávela tres veces con dos mililitros de búfer de funcionamiento en frío. Transfiera las celdas resuspendidas a la columna de separación y déjelas pasar.

Una vez más, lave la columna tres veces con dos mililitros de tampón de funcionamiento por lavado. A continuación, levante la columna del separador de imán y colóquela sobre un tubo centrífuga de 15 mililitros sobre hielo. Eluda las células positivas CD14 con dos mililitros de tampón de funcionamiento en frío y centrifugado a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para peletizar las células.

Resuspender el pellet en dos mililitros de medio sérico definido por productos químicos fríos y transferir 50 microlitros de él en un tubo de 1,5 mililitros. Mancha las células obtenidas con 10 microlitros de anticuerpos monoclonales CD14 conjugados con naranja Krome durante 20 minutos. Añadir un mililitro de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos para peletizar las células.

Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS y transferirlo a un tubo de cinco mililitros. Determinar la pureza de los monocitos CD14+ por citometría de flujo. Semilla de un millón de los monocitos purificados obtenidos en un cultivo de tejido tratado placa de seis pozos e incubar durante dos horas a 37 grados Celsius bajo 5% dióxido de carbono.

Después de la incubación desechar el sobrenadante y añadir suavemente dos mililitros de medio de cultivo libre de suero precalentado de 37 grados, luego añadir 80 microgramos de los exosomas derivados de CB-SC al cultivo de monocitos en la placa de seis pocillos con un volumen total de dos mililitros. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante tres a cuatro días. A continuación, imagine la morfología celular usando un microscopio invertido con aumento de 200X.

Agregue un mililitro de búfer de disociación celular basado en PBS para separar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y cosechar las células restantes con un rascador de celdas. Recoger las células centrifugando a 1, 690 x g durante cinco minutos y resuspend sus alrededores en 200 microlitros de PBS. Agregue cinco microlitros de bloqueador FC para bloquear la unión no específica y, a continuación, agregue los anticuerpos.

Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añadir un mililitro de PBS a las células incubadas y centrifugarlas a 300 x g durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS y añadir cinco microlitros de yoduro propdium por muestra.

Transfiera las células a un nuevo tubo de flujo de cinco mililitros y realice la citometría de flujo para evaluar los niveles de expresión CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209. El fenotipo y la pureza de los CB-SC fueron examinados por citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC. El análisis mostró altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero no se observó ninguna expresión de CD34.

El análisis de citometría de flujo también confirma la expresión de marcadores específicos de exomas, CD9, CD 81 y CD63 en exosomas derivados de CB-SC. La morfología del tamaño de los exosomas se caracterizó por TEM y la distribución del tamaño fue determinada por DLS. La mancha occidental prueba además la expresión del marcador asociado al exoma Alix sin expresión del marcador asociado a ER, calnexina.

Se observó la interacción directa de CB-SC-Exo con PBMC con diofilo mediante microscopía de fluorescencia. Para definir mejor qué población de células interactuó con el dial con la etiqueta CB-SC-Exo, se ensuñaron diferentes compartimentos celulares con marcadores específicos de la célula, como CD3 para células T, CD11C para células dendríticas mieloides, CD14 para monocitos, CD19 para células B y CD56 para células NK. Los monocitos fueron blanco principalmente de los exosomas derivados de CB-SC, ya que mostraban intensidades de fluorescencia media más altas que las de otras células inmunitarias.

Los monocitos tratados con exosomas se diferencian con éxito en morfologías similares a los de un husillo. Hubo una regulación ascendente en el nivel de los marcadores asociados a M2, como CD163, CD206 y CD209 después del tratamiento con exosomas derivados de CB-SC. La comparación fenotípica entre los macrófagos M2 convencionales y los macrófagos M2 inducidos por exomas CB-SC no mostró diferencias significativas.

El paso clave en este protocolo es agregar exosomas derivados de CB-SC al monocitos del cultivo en placa de seis pozos e incubarlo durante tres a cuatro días, lo que se necesitó para la diferenciación de la célula a otros macrófagos de tipo 2 con morfología similar a un husillo. A continuación, vamos a explorar los componentes de moléculas dentro de los exosomas derivados de CB-SC que contribuyeron a la inducción de la diferenciación de monocitos en macrófagos tipo 2.