Un enfoque para estudiar la transcriptómica dependiente de la forma a un nivel de celda única
November 2nd, 2020
Este artículo presenta métodos para el crecimiento de miocitos cardíacos con diferentes formas, que representan diferentes patologías, y la clasificación de estos miocitos cardíacos adherentes en función de su morfología a un solo nivel celular. La plataforma propuesta proporciona un enfoque novedoso para el alto rendimiento y la detección de drogas para diferentes tipos de insuficiencia cardíaca.
Proponemos una nueva plataforma para investigar los efectos de la forma celular en la expresión génica, utilizando métodos para el cultivo y clasificación de adherencias con diferentes morfologías a nivel de célula única. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el estudio de alto rendimiento de la forma celular in vitro ya que comparar células con diferentes formas in vivo es técnicamente exigente. Para establecer un cultivo de cardiomiocitos con patrones, transfiera una suspensión de cardiomiocitos en la relación de aspecto de interés a un tubo de 15 mililitros para contar y diluir las células a una de las 10 a las cinco células por mililitro de concentración media de chapado adecuada.
Añadir dos mililitros de células a un chip recubierto de fibronectina sumergido en dos mililitros de medio de chapado caliente dentro de un plato Grenier Petri de 35 mililitros y colocar el plato en una incubadora de 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Al día siguiente, revise el chip por microscopía de luz para confirmar que la mayoría de las células se han unido. Retire el medio del plato para eliminar los escombros y las células muertas, y comenzando desde el centro y moviéndose hacia los lados de una manera gota, agregue suavemente PBS a las células.
Después del tercer lavado, reemplace el PBS por un medio de mantenimiento de cuatro mililitros y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Después de 72 horas, enjuague suavemente la superficie de la viruta dos veces con dos mililitros de PBS caliente de Dulbecco caliente por lavado como se ha demostrado y utilice fórceps para transferir inmediatamente el chip lavado a un nuevo plato estéril Grenier Petri de 35 mililitros. Agregue rápidamente 1,5 microlitros de vibrante dicycle verde diluido 1000 veces en DPBS al chip.
Fije una cámara sobre el chip y coloque el plato en el porta platos de la etapa del recolector de celdas. Inserte la tapa magnética y localice la cruz en la ventana de vista en vivo. Concéntrese en el punto de mira y, en la ventana de escaneado y clasificación, seleccione la calibración para la inyección automática y calibrar.
Sustituya el sobrenadante de la antena parabólica con 1,5 mililitros de una solución de triple E en DPBS para aflojar las células de la fibronectina y abrir la pestaña de exploración. Para escanear todo el chip, concéntrese en la esquina superior izquierda del chip en el campo de visión y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio. A continuación, concéntrese en la esquina inferior derecha del chip y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio.
En la ventana emergente, haga clic en establecer el plano más nítido y haga clic en ir a la parte superior derecha y vaya a los botones de la esquina inferior izquierda. A continuación, haga clic en Finalizar para iniciar el análisis. Una vez finalizada la exploración, abra la pestaña de análisis y haga clic en Mostrar mapa para seleccionar las celdas individuales que superan los criterios de estudio.
Centrar el microcapilar de vidrio en el centro de la vista en vivo del microscopio y abrir la pestaña de la bomba. Para crear un vacío, retraiga el émbolo de una jeringa de 50 mililitros número uno cuatro mililitros y abra la pestaña de clasificación. Para permitir que se seleccione una sola celda, configure la válvula dos para que se abra durante 120 milisegundos y la válvula uno se abra durante 20 milisegundos después de un lapso de tiempo de 200 milisegundos.
Para permitir que la celda recogida se entregue correctamente a su tubo PCR que contiene el búfer de lesis, configure la válvula que se abrirá durante 20 milisegundos y la válvula dos se abra durante 10 milisegundos después de un lapso de tiempo de 10 milisegundos. Cuando se haya ajustado la configuración de la válvula, haga clic en calcular la ruta. El software calculará la ruta más rápida de celda en celda para recoger e inyectar las celdas seleccionadas en todo el chip.
A continuación, enfoca el microscopio en un patrón en la superficie de la viruta. Utilice el joystick para mover el microcapilar hacia abajo con cuidado para que se pueda obtener la imagen más nítida de la punta del microcapilar sin tocar la superficie del chip y hacer clic en el conjunto. Se abrirá una nueva ventana que muestra la sección transversal microcapilar.
Para que el software registre el desplazamiento de la punta del capilar en las coordenadas X, Y y Z, haga clic en el centro exacto del capilar. A continuación, haga clic en Iniciar ordenación para iniciar la ordenación. En este análisis representativo de ADNc preamplificado a partir de una sola célula escogida, se observó una banda clara en el gel como la gráfica de densitometría correspondiente al pico en 1,852 pares base en el electroferograma.
El tamaño promedio de los fragmentos era de 1.588 pares base con un pequeño número de fragmentos que eran menores que 300 pares base, lo que indica la generación de una buena biblioteca de ADNc. También se pueden realizar tinciones y análisis inmunofluorescentes para evaluar la estructura de sarcomere dentro de los cardiomiocitos modelados. Esta plataforma allana el camino para el estudio de alto rendimiento y el cribado de fármacos de diferentes tipos de insuficiencia cardíaca.
Visión general
Este estudio introduce una plataforma novedosa para cultivar y clasificar los miocitos cardíacos basándose en su morfología a nivel de célula única. Este método permite la detección de fármacos de alto rendimiento para varios tipos de insuficiencia cardíaca.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Cultivo de miocitos cardíacos
- Análisis de la morfología celular
- Metodologías de detección de fármacos
Fundamentos
- Los miocitos cardíacos exhiben diversas formas que se correlacionan con diferentes patologías.
- Investigar los efectos de la forma celular en la expresión génica es un desafío in vivo.
- Las técnicas de alto rendimiento son esenciales para una detección efectiva de fármacos.
- Los métodos actuales carecen de eficiencia en la clasificación y análisis de células individuales basadas en la morfología.
Propósito del estudio
- Desarrollar una plataforma para estudiar el impacto de la forma celular en la expresión génica.
- Facilitar la clasificación de los miocitos cardíacos basada en su morfología.
- Mejorar los procesos de detección de fármacos para tratamientos de insuficiencia cardíaca.
Métodos utilizados
- Preparación y dilución de suspensión de cardiomiocitos.
- Uso de chips micropatroneados recubiertos de fibronectina para el cultivo celular.
- Microscopía óptica para confirmar la adhesión celular.
- Exploración y clasificación automatizadas de células individuales utilizando un sistema de microcapilar.
Principales resultados
- Adhesión y mantenimiento exitosos de cardiomiocitos estampados.
- Generación de una buena biblioteca de cDNA a partir de células individuales clasificadas.
- La tinción inmunofluorescente reveló estructuras de sarcómeros.
- La plataforma admite estudios de alto rendimiento y detección de fármacos.
Conclusiones
- La plataforma desarrollada ofrece un enfoque novedoso para el estudio de los miocitos cardíacos.
- Permite la clasificación y análisis eficiente de células basadas en la morfología.
- Este método puede avanzar significativamente la investigación en terapias para la insuficiencia cardíaca.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
