Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante
22 de septiembre de 2020
En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.
El xenotrasplante es un método factible para tratar Sin embargo, el monitoreo eficaz del rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos y los investigadores. Este protocolo es un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune de la xenotransmutación. Esta técnica se puede utilizar en el campo del xenotrasplante, incluyendo el trasplante de islote de cerdo a humano, trasplante de riñón, trasplante de hígado y trasplante de corazón.
Comience por transferir 500 microlitros de muestras de sangre a diferentes tubos de micro centrífuga. Añadir 20 microlitros de proteasa K y 500 microlitros de tampón de lelisis en los tubos. A continuación, agítelos a fondo para mezclar.
Poner los tubos en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 10 minutos, sacudiéndolos de dos a tres veces durante la incubación hasta que la solución se convierte en centrifugarlos claramente para eliminar las perlas líquidas de la pared interna de las cubiertas del tubo. A continuación, agregue 500 microlitros de alcohol anhidro, alcohol etílico, y agitar bien. Transfiera la mezcla a la columna de adsorción.
A continuación, centrifugar la columna durante dos minutos y deseche el líquido de desecho. Agregue 800 microlitros de solución de enjuague a cada columna de adsorción y centrifugar durante un minuto. dejar las columnas a temperatura ambiente durante unos minutos para secar la solución de enjuague restante.
Transfiera las columnas de absorción a un tubo centrífugo limpio. Agregue 50 microlitros de tampón de elución a la mitad de las películas de adsorción y colóquelos a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, luego centrifugarlas durante un minuto. Prepare la mezcla maestra de PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego agregue 23 microlitros de la mezcla en cada tubo de micro centrífuga de 0,6 mililitros.
Añadir dos microlitros de ADN genómico a cada tubo y cuidadosamente Cabot. A continuación, mezcle brevemente y centrifugar. Coloque los tubos en un ciclor pcR e inicie la amplificación.
Cuando la reacción haya terminado, realice la electroforesis de Agarrose. Añadir 1,2 gramos de Agarrose en un matraz que contenga cien milímetros de TAE y hervirlo durante cinco minutos en el microondas. Una vez que la Agaria se haya enfriado a aproximadamente 70 grados Celsius, añadir cinco microlitros de tinte de ácido nucleico en el matraz, lentamente, verter en la placa y dejarlo a temperatura ambiente hasta que se solidifique en un gel.
Añadir cinco microlitros de cada muestra y Escalera de ADN de 2 registros o Marcador de ADN 1, en los pozos del gel de Agarosa y electroforesis en 120 millones de muelles hasta que las bandas estén separadas. Visualice el gel con un imágenes ultravioletas. Después de realizar la transformación como se describe en el manuscrito de texto, verifique los plásmidos por digestión enzimática de doble restricción con EcoR I y Bam HI. Separe los productos digeridos con electroforesis de 1%agarosa y exponga el gel a la luz UV.
Diluir el plásmido concentrado con el fragmento de ADN porcino a dos veces 10 a la 11a copias por mililitro para la solución estándar de partida, Utilizando agua destilada doble. Para establecer una curva estándar, prepare una mezcla maestra qPCR, como se describe en el manuscrito de texto, y agregue 40 microlitros de la mezcla en cada tubo de una tira de ocho tubos. Añadir 10 microlitros de ADN estándar de diferentes concentraciones, tapar los tubos y luego mezclar brevemente y centrifugarlos.
Coloque los tubos en la máquina qPCR y realice la amplificación. Utilice tubos EDTA para recoger muestras de sangre de aproximadamente 400 microlitros de los modelos de parches de arteria de cerdo a mono, o 100 microlitros de los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. A continuación, transfiera las muestras a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.
Retire las células sanguíneas de las muestras de sangre por centrifugación a baja temperatura y alta velocidad. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y retire los desechos celulares por centrifugación a 16.000 veces G durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y extraiga el ADN circulante utilizando un suero comercial mientras circula el kit de extracción de ADN.
Condensa el volumen de ADN circulante a 40 microlitros y guárdalo en 20 grados Celsius negativos. Realice qPCR para cuantificar el ADN específico del cerdo circulante. Las imprimaciones específicas de porcino fueron diseñadas y utilizadas para cuantificar el ADN específico de cerdo circulante por qPCR, en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y parche de arteria de cerdo a mono, modelos de trasplante.
La electroforesis de agarosa se utilizó para aislar fragmentos de ADN amplificados. Utilizando PCR, se identificaron las imprimaciones específicas para el ADN genómico porcino amplificado. A continuación, se confirmaron las especificidades de las especies de estas imprimaciones en la cohorte de ADN genómico humano o mono o en la cohorte de ADN genómico de ratón.
Finalmente se utilizaron dos imprimaciones específicas de especies, para amplificar el ADN de cerdo en el parche de la arteria de cerdo a mono y los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es que se debe prevenir la contaminación de todo tipo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas dentro del xenotrasplante porque es un método simple de bajo costo y no invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para monitorear el rechazo inmune en xenotrasplantes utilizando cebadores específicos de cerdo y qPCR. Está diseñado para ser sencillo, rentable y mínimamente invasivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Xenotrasplante
- Inmunología
- Ingeniería genética
Antecedentes
- El xenotrasplante consiste en trasplantar órganos o tejidos de una especie a otra.
- La monitorización del rechazo inmunitario es fundamental para el éxito de los xenotrasplantes.
- Los métodos actuales pueden ser invasivos o costosos.
- Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una técnica de monitorización más accesible.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para cuantificar el ADN porcino en modelos receptores.
- Facilitar el monitoreo de las respuestas inmunitarias en xenotrasplantes.
- Mejorar la viabilidad del xenotrasplante en entornos clínicos.
Métodos Utilizados
- Diseñar cebadores específicos para cerdos.
- Construir plásmidos que contengan fragmentos de ADN porcino.
- Establecer curvas estándar para la cuantificación de ADN.
- Utilizar la qPCR para cuantificar el ADN de cps en diversos modelos de trasplante.
Resultados principales
- Cuantificación exitosa de ADN porcino en modelos de trasplante de cerdo a ratón y de cerdo a mono.
- Establecimiento de curvas estándar confiables para mediciones precisas.
- Demostación de la eficacia del método en el monitoreo del rechazo inmune.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método de bajo costo y menos invasivo para el monitoreo de la xenotrasplantación.
- Tiene aplicaciones potenciales en varios tipos de trasplante de órganos.
- Este enfoque podría mejorar la comprensión de las respuestas inmunitarias en la xenotrasplantación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El monitoreo del rechazo inmunitario en la xenotrasplantación sigue siendo un desafío crítico para el desarrollo preclínico y la toma de decisiones traslacionales. Un método basado en qPCR no invasivo para cuantificar el ADN específico de cerdo en circulación permite la detección temprana del daño del injerto y la activación inmunitaria. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar un biomarcador traslacional vinculado a la viabilidad del xenoinjerto, orientando las decisiones de avance o interrupción en las líneas de reemplazo de órganos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de los mecanismos de rechazo de xenoinjertos mediante el seguimiento longitudinal de la liberación de ADN específico por especie.
- Valor operativo: Proporciona una lectura estandarizada y cuantificable para evaluar intervenciones inmunomoduladoras en modelos preclínicos.
- Valor predictivo: Apoya la validación de dianas al correlacionar los niveles de ADN circulante con el daño inmunitario al injerto, reduciendo los falsos positivos en las terapias prometedoras.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Preparación del ensayo: Establece un flujo de trabajo reproducible de qPCR con cebadores específicos para cada especie y curvas estándar para la cuantificación precisa de cpsDNA en diferentes modelos.
- Escalabilidad: Compatible con el procesamiento de muestras de alto rendimiento procedentes de estudios de xenotrasplante en roedores y primates no humanos.
- Resultado analítico: Genera datos cuantitativos de concentración de ADN que permiten el análisis de respuesta a la dosis y de la evolución temporal de la integridad del injerto.
Investigación Translacional y Preclínica
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Aplicable a modelos de trasplante de cerdo a ratón y de cerdo a mono, reflejando la dinámica inmunitaria interespecífica relevante para la xenotrasplantación humana.
- Continuidad Translacional: El ADN circulante sirve como biomarcador no invasivo que conecta el descubrimiento con la evaluación preclínica de seguridad.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite el monitoreo longitudinal para orientar los esquemas de dosificación y la eficacia de la inmunosupresión antes de los estudios GLP.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar una lectura molecular del estado del injerto que complementa los puntos finales funcionales e histológicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías inmunitarias que provocan la pérdida de xenoinjertos mediante la cinética medible de liberación de ADN.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos para evaluar biológicos o moléculas pequeñas dirigidas a mecanismos de rechazo.
- Análisis: La cuantificación de ADNcp derivada de qPCR ofrece un rango dinámico sensible para detectar lesión temprana del injerto antes del deterioro funcional.
- Investigación Traducional: La correlación del biomarcador con estrategias clínicas de monitoreo de ADN circulante mejora la confianza predictiva para aplicaciones humanas.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de qPCR puede adaptarse a diversos programas de xenotrasplante (islotes, riñón, hígado, corazón) con el rediseño de cebadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de rechazo al proporcionar una medida directa y cuantificable de la muerte celular porcina.
- Valor operativo: Minimiza el uso de animales mediante muestreos sanguíneos seriados en lugar de análisis en puntos finales terminales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la interrupción temprana de candidatos inmunomoduladores ineficaces.
- Impacto en la cartera: Facilita el avance con estratificación de riesgos basado en métricas objetivas de integridad del injerto.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la extracción de ácidos nucleicos, optimización de qPCR y generación de curvas estándar.
- Depende del acceso a instrumentación de qPCR, herramientas de validación mediante electroforesis en gel de agarosa y flujos de trabajo controlados para evitar contaminación.
- Necesita una estandarización entre equipos para garantizar la coherencia longitudinal en el manejo de animales, procesamiento de muestras y análisis.
- La adaptación a sistemas modelo alternativos requiere la revalidación de la especificidad de los cebadores y la eficiencia de la extracción de ADN.
- Las limitaciones prácticas incluyen posibles factores de confusión derivados de fuentes no injertadas de ADN porcino y la sensibilidad del ensayo en las etapas tempranas de rechazo.
