Habilitación de la compensación en tiempo real en oxidaciones fotoquímicas rápidas de proteínas para la determinación de los cambios en la topografía proteica

El método facilita la medición de la confirmación de proteínas y las interacciones proteicas. La composición del tampón, la pureza de la muestra y los requisitos de concentración de proteínas son flexibles, lo que permite que el método aborde problemas estructurales desafiantes. Esta técnica permite una compresión de muestras en una amplia variedad de diferentes sistemas de búfer.

Usando nuestro método de dosimetría, los investigadores pueden monitorear qué tan bien están funcionando sus reacciones de etiquetado en tiempo real. Una aplicación de esta tecnología es en el desarrollo de fármacos porque permite a los investigadores probar formulaciones de fármacos muy diferentes y cómo afectan la estructura de proteínas. Para preparar el banco óptico FPOP.

Primero encienda el láser y ajuste el láser al gatillo externo, energía constante y sin reemplazo de gas. Cuando el láser se ha calentado, ajuste la energía láser por pulso a entre 80 y 120 miligramos por pulso y utilice una antorcha de butano para quemar suavemente la codificación de poliimida del capilar en el punto en el que el dosímetro en línea leerá la señal absorbente a 265 nanómetros después de la exposición al láser. Utilice una toallita sin pelusas y metanol para limpiar suavemente los desechos del capilar y coloque el capilar limpio a través de la trayectoria del haz del láser y en el dosímetro en línea.

Presione la palanca en la parte superior del dosímetro en línea para abrir la bisagra y retirar los soportes magnéticos. Coloque el capilar en la ranura de la máquina del dosímetro en línea utilizando los soportes magnéticos para mantener el capilar en su lugar y cierre la bisagra del dosímetro sobre el capilar presionando la bisagra hasta que la palanca encaje en su lugar. Haga clic en el botón de flash de inicio en el software de dosimetría para comenzar a disparar el láser excimer y establecer la velocidad de repetición preestablecida entre 10 y 20 Hertz en el software de dosimetría con el disparo láser mover la etapa motorizada a través de su rango de movimiento, asegurando que el haz se mantenga centrado en la apertura y que la silueta del capilar se pueda observar a lo largo.

A continuación, enjuague el capilar con agua a 20 microlitros por minuto durante al menos un minuto y haga clic en los datos de inicio más cero automático en el software del dosímetro para poner a cero el dosímetro al agua antes de comenzar la recopilación de datos. Para realizar un experimento FPOP añadir dos microlitros de peróxido de hidrógeno a 18 microlitros de solución FPOP y utilizar una pipeta para mezclar suavemente la solución recoger rápidamente la solución en la parte inferior del tubo por centrifugación e inmediatamente utilizar una jeringa hermética de gas para cargar la solución en una bomba de jeringa. Haga clic en la bomba de arranque e inicie los datos en el software del dosímetro para iniciar el flujo de la bomba de jeringa al caudal adecuado y utilice el dosímetro en línea para supervisar la lectura de adenina en tiempo real hasta que la señal absorbente a 265 nanómetros se estabilice la recogida de la muestra en un contenedor de residuos.

Para comenzar a disparar el láser a la velocidad de repetición preestablecida, haga clic en el botón de flash de inicio en el software del dosímetro y utilice el dosímetro en línea para supervisar la lectura de adenina en tiempo real. La diferencia en la absorbancia a 265 nanómetros con el láser apagado y el láser encendido serán los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura. Asegurar que los radicales hidroxilo comparables estén disponibles para reaccionar con proteínas a través de diferentes muestras.

Compare los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura obtenidos con el dosímetro en línea con los absorbentes delta deseados a 265 nanómetros de lectura obtenidos de experimentos o controles anteriores. Si la lectura está en el nivel deseado, recoja la muestra inmediatamente después del láser o la radiación en el búfer de enfriamiento. Para compensar la dosis radical efectiva para igualar las lecturas de absorbancia, cambie la concentración de peróxido de hidrógeno, cambie la energía láser por pulso o cambie el plano focal de la lente de enfoque para aumentar la fluidez láser.

Para hacer un cambio de unidad de absorción de más de 10 mililia en la lectura de absorbentes delta rehace la muestra con más o menos peróxido de hidrógeno y vuelva a ejecutar la muestra como se ha demostrado. Para realizar un pequeño cambio en la lectura de absorbancia en tiempo real, utilice la etapa motorizada de 50 milímetros para ajustar la posición de la lente de enfoque para ajustar el plano focal del haz incidente. Medir la cantidad efectiva de radical hidroxilo presente en la muestra después de monitorizar la radiación láser, los absorbentes delta de adenina a 265 nanómetros en tiempo real con un detector capilar UV en línea utilizando la etapa motorizada para ajustar la posición de la lente hasta que los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura sea igual a la lectura deseada.

La comparación de la huella de péptido de cadena pesada del adilumumab biosimilar en tampón de fosfato y después del calentamiento a 55 grados Celsius durante una hora revela que las regiones de péptidos indicadas demuestran una protección significativa contra los disolventes cuando la proteína se calienta para formar agregados. El uso de un dosímetro en línea en tiempo real para monitorear la diferencia en los absorbentes de adenina antes y después del láser o la radiación indica que se observa un cambio comparable en el nivel de absorbentes de adenina en el tampón MES en comparación con el tampón de fosfato. Mientras que la oxidación media de los péptidos es menor en presencia de tampón MES en comparación con el tampón de fosfato.

Sin embargo, como la fluidez láser se incrementa para tener una respuesta de dosimetría de adenina igual, los valores medios de oxidación del péptido son casi los mismos después de FPOP y MES buffer y fosfato buffer. Como la lectura de la dosimetría se ve afectada por la concentración de peróxido de fluencia láser, así como por el carroñero radical. Tenga cuidado de que la respuesta de dosimetría entre la encuesta de muestra cerca una de la otra.

La mutagénesis dirigida por el sitio se utiliza a menudo para sondear sitios protegidos en FPOP. Esto permite a los investigadores determinar si los cambios se deben a Alistair. Esta técnica facilita la comparación de proteínas en diferentes tampones o formulaciones permitiendo a los investigadores determinar el efecto de diferentes aditivos en la confirmación de proteínas.