Name: Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a utilizar nanohilos de silicio para la bio-modulación óptica intracelular con alta resolución espacial. Este método permite investigar la comunicación eléctrica entre células cardíacas y cerebrales in vitro e in vivo.

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Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Para garantizar el cumplimiento de las normas éticas, todos los procedimientos animales relacionados con el aislamiento de cardiomiocitos de corazones de roedores fueron aprobados por primera vez por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (IACUC). Además, todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la orientación de la IACUC de la Universidad de Chicago.
1. Preparación de híbridos cell-SiNWs
<ol><li>Aísle los cardiomiocitos primarios (CM) utilizando un kit comercial siguiendo las pautas del fabricante.</li>
	<li>Preparar DMEM completo para el aislamiento de células primarias complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina-estreptomicina, y 1% L-glutamina.</li>
	<li>Para aislar el miofibroblasto (MF) de la suspensión MFs-CM, pre-placa las células aisladas en un plato de cultivo de tejido (células aisladas de 2 corazones del paso 1.1. por plato de 100 mm) para 1 h. Como los CM necesitan una fibronectina o una superficie tratada con colágeno para adherirse, solo los MF se unen a la superficie de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Aspirar la suspensión de células de CM enriquecidas. Estos CM se pueden utilizar para experimentos de acoplamiento heterocelular como se describe en la sección 3. Enjuague los MFs con DMEM para eliminar los CM restantes de la antena MFs.</li>
	<li>Añadir medio de cultivo fresco a los MF y permitir que proliferen hasta que sean confluentes del 80% (2-4 días). Cambia el medio cada dos días.</li>
	<li>Cuando las células estén listas (80% confluentes), prepare siNWs para el paso de hibridación a continuación (paso 1.7). NOTA: Para ello se pueden utilizar muchos tipos de SiNW. En este experimento, los SINW que fueron cultivados por deposición de vapor químico (CVD) con una configuración de unión p-i-n de núcleo-shell se utilizaron como se describió anteriormente16. Durante el crecimiento de la ECV, los SiNW se cultivan sobre un sustrato de obleas de silicio, y finalmente se mantienen como chips de silicio cubiertos con SINWs.</li>
	<li>Corte un chip de 3 mm x 3 mm de una oblea con siNWs cultivados en CVD utilizando un escriba de diamante. Utilice fórceps afilados para manejar la oblea y minimizar el área de superficie que se toca con los fórceps, ya que esto puede romper los SiNW.</li>
	<li>Esterilice el chip enjuagando con 70% de etanol y permitiendo que el etanol se seque durante 30 minutos bajo la luz UV en una campana de flujo laminar de bioseguridad.</li>
	<li>Transfiera el chip a un tubo de microcentrífuga estéril y enjuague el exceso de etanol utilizando medios de cultivo completos.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medios de cultivo y sonicar el chip en el baño de sonicación durante 1-10 min. Los medios deben nublarse a medida que los SINW se liberan en los medios. NOTA: El tiempo y la potencia de sonicación deben optimizarse para diferentes sonicadores o células diferentes, ya que las duraciones más cortas y las potencias más bajas producirán siNW más largos.</li>
	<li>Añadir la suspensión siNWs en 5 ml de medios de cultivo y sembrar en el plato de cultivo de tejido de 100 mm con MF. Permita que los SiNWs internalicen durante 4 h y enjuague el exceso de SiNWs de 5x con medios. Permita que los SINW parcialmente internalizados completen la internalización permitiéndoles sentarse durante otra 1 hora antes de su uso. NOTA: Diferentes tipos de células pueden necesitar diferentes tiempos de concentración y/o internalización de SiNWs.</li>
	<li>Preparar la solución de recubrimiento de colágeno diluyendo la solución de cola de colágeno (3 mg/ml) con ácido acético estéril de 20 mM en una proporción de 1:50. Añadir una solución de recubrimiento de 0,5 ml a un plato inferior de vidrio de 35 mm y dejar reposar durante 1 h en 37 oC. Retire la solución y enjuague el plato con PBS estéril.</li>
	<li>Cosecha los híbridos cell-SiNWs tratando las células con 3 ml de trippsina durante 2 min a 37oC. Añadir 10 ml de medios de cultivo y enjuagar los híbridos vigorosamente pipeteando. Centrifugar las células suavemente a 200 x g durante 5 min para evitar dañar las células con los SINW internalizados. Retire el exceso de medios, suspenda las células con 1 ml de medios y se las semilla en el plato inferior de vidrio tratado con colágeno. NOTA: Los híbridos pueden ser sembrados solos, para investigar el acoplamiento intracelular o intercelular o con CM para investigar el acoplamiento heterocelular in vitro.</li>
	<li>Realizar una verificación final de la internalización de SiNW mediante el etiquetado de citosol de las células (calceína-AM, 4 m) y la membrana (marcador de membrana, 2 m) durante 30 minutos a 37 oC, e imágenes de la célula mediante microscopía confocal. Como los SiNW son altamente reflectantes, se puede utilizar la luz reflejada en lugar de la fluorescencia para visualizarlos.</li>
</ol>2. Preparación de células para investigaciones intra e intercelulares
<ol><li>Preparar la solución de recubrimiento de colágeno como en 1.12</li>
	<li>Para la estimulación eléctrica intracelular, híbridos de cultivo con densidades de siembra bajas. Utilice un hemocitociómetro estándar para contar las células de la sección 1.11. y sembrar 50.000 células en un plato inferior de vidrio de 35 mm en medios de cultivo. Para las investigaciones intercelulares, utilice densidades celulares más altas (500.000 células por plato). Para el acoplamiento intercelular entre CM y MFs, co-cultivo de los híbridos con CM recién aislados.</li>
	<li>Permita que las células se adhieran durante la noche antes de realizar experimentos de estimulación óptica. Para las investigaciones intercelulares, permita 48 h a 37 oC para que las células expresen las uniones de separación intercelular antes de que se lleve a cabo el experimento.</li>
	<li>Preparar la solución de material de colorante sensible al calcio (puede mantenerse en -20 oC) añadiendo 50 ml de DMSO a 50 g de Fluo-4 AM. Preparar la solución de tinción diluyendo 1 ml de tinte en 1 ml de DMEM.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo de las células y añadir 1 ml de solución de tinción. Permita que el tinte se internalice en las células durante 20-30 min a 37 oC. Aspirar el tinte y enjuagar dos veces con PBS estéril.</li>
	<li>Por último, añadir 1 ml de dmEM media DMEM libre de fenol-rojo precalejado, y permitir que el Fluo-4 intracelular se someta a des-esterificación durante 30 min en 37 oC.</li>
	<li>Transfiera las células al microscopio para la toma de imágenes y la estimulación.</li>
</ol>3. Imagen óptica y estimulación
<ol><li>Precalentar un microincubador humidificado a 37oC y una mezcla de burbujas de aire-CO2 (95:5).</li>
	<li>Utilice un microscopio con una línea láser colimada acoplada a la trayectoria de la luz para obtener imágenes de calcio y estimulación óptica. NOTA: Un microscopio confocal de escaneo es la opción más sencilla debido a sus capacidades de estimulación de puntos. Sin embargo, este procedimiento se puede realizar utilizando cualquier microscopio de florescencia estándar acoplando un rayo láser colimado en el espacio infinito de la trayectoria de luz utilizando un divisor de haz. Cualquier objetivo del microscopio está diseñado para que un láser colimado pasado a través de él se enfoque a un punto láser limitado de difracción en el plano focal. La longitud de onda del láser debe estar cerca de la luz de excitación, por lo que será reflejada por el espejo dicroico y pasada por el filtro de excitación.</li>
	<li>Visualice los SiNW y determine el sitio de estimulación utilizando microscopía de campo brillante, luz transmitida o luz reflectante. A continuación, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del SiNW.</li>
	<li>Validar la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso para cada tamaño y tipo de célula SiNW, para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas. Para un protocolo de estimulación típico, realice un registro basal de 2-10 s de la actividad de calcio intracelular. A continuación, aplique un solo pulso láser de 1-10 mW de potencia y 1-10 ms de duración (correspondiente a 30-300 kW/mm2) para estimular el SiNW, y registre la onda de calcio resultante para otros 2-10 s. NOTA: Es esencial optimizar la potencia óptica y la longitud del pulso para cada tamaño y células SiNW. Esto es necesario para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas.</li>
	<li>Transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica, si es necesario, para su posterior análisis.</li>
</ol>4. Procesamiento de vídeo
<ol><li>Visualice los cambios en la fluorescencia Fluo-4 utilizando la macro "dF sobre F"17 disponible para ImageJ18, que calcula el cambio en los recuentos de fluorescencia para cada píxel y normaliza por el valor medio de la línea base en reposo. Convierta la salida (formato de punto flotante) en 8 bits para su posterior procesamiento.</li>
	<li>Procese la película dF/F más adelante utilizando el filtro de mediana selectiva"Eliminar valores atípicos"disponible en ImageJ. Defina parámetros para eliminar píxeles donde su valor esté más de 10 por encima del valor mediano en un radio de 2 píxeles y reemplace ese valor de píxel por la mediana.</li>
	<li>Calcule el flujo óptico en cada fotograma a través del algoritmo Lucas-Kanade, tal como se implementa en la caja de herramientas Matlab Computer Vision. La salida de esta función era un campo vectorial que contenía los componentes x e y del flujo óptico en cada punto de cada imagen (el código está disponible en el archivo suplementario 1). NOTA: El flujo óptico medio dentro de una célula, <->, corresponde al desarrollo del flujo de calcio dentro de una célula. El diferencial del flujo óptico, "<">, proporciona el punto de tiempo en el que se activó la señalización de calcio, identificando dónde se maximizó la señal. Además, la magnitud de la onda de calcio en su máximo se correlaciona con la velocidad a la que el frente de onda de calcio progresa a través de la célula.</li>
	<li>Calcular la velocidad intercelular de la transmisión de calcio de acuerdo con la siguiente ecuación. vCa2+ á rij / ( tmax,j á tmax,i ), donde tmax,j y tmax,i son los tiempos de activación para las celdas j e i, respectivamente, y rij es la distancia entre los centroides de las celdas.</li>
</ol>

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<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
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<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la estimulación e...

Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular1, neuroinmunidad2,3,4, y la diferenciación de células madre5.
En las últimas décadas, el campo de la bioelectricidad ha generado un creciente nivel de interés, lo que ha contribuido al desarrollo de numerosas tecnologías para interfaces bioelectrónicas. Las pipetas de parches de microelectrodo son el estándar de oro de la grabación y estimulación intracelular6. En esta metodología, una pipeta de vidrio se tira en condiciones específicas para formar un borde afilado con un tamaño de poro de pocos micras. Esta pipeta se rellena con un tampón y la pipeta permite el contacto directo del tampón con el volumen intracelular. Esto da como resultado una interfaz bioeléctrica que produce relaciones de señal a ruido extremadamente altas, control preciso sobre la actividad eléctrica celular y una resolución temporal extremadamente alta. Aunque esta metodología es una herramienta extremadamente potente, que recientemente se redujo a una configuración de nano-pipeta7,se asocia con varias limitaciones técnicas importantes. El efecto de dilución delcitosol 8,así como las vibraciones mecánicas, limita su utilidad a los interrogatorios a corto plazo, y requiere costosos equipos especializados y un alto nivel de habilidad técnica. Además, su voluminosidad limita el número de células que se pueden registrar o estimular simultáneamente, y debido a su invasividad, no puede ser reconfigurada a lo largo de un experimento. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron matrices de microelectrodos, pero el tamaño de los electrodos limita la resolución espacial, así como el acceso intracelular. Las matrices de nanoelectrodos permiten el registro y la estimulación intracelulares, pero requieren electroporación abrasiva para acceder alcitosol 9,10. Además, todas estas metodologías están unidas al sustrato y, por lo tanto, se limitan a cultivos celulares in vitro, o a células superficiales externas, sin acceso a células que están dentro de un tejido tridimensional (3D).
Optogenetics11 se utiliza ampliamente para abordar estas limitaciones 3D e in vivo. Sin embargo, los métodos optogenéticos se basan en las perturbaciones de los canales iónicos de membrana plasmática activados por la luz que se distribuyen en la membrana plasmática, limitando la resolución espacial 3D12 y las capacidades intracelulares.
Recientemente hemos demostrado que los nanohilos de silicio (SiNW) se pueden utilizar para realizar interrogaciones bioeléctricas intracelulares con resolución espacial submicrónico con diferentes células no excitables, a saber, miofibroblastos cardíacos y oligodendrocitos13. Por otra parte, utilizamos estos SINW para realizar interrogatorios específicos de células ex-vivo dentro de un tejido cardíaco 3D, para investigar cómo las células cardíacas se acoplan eléctricamente in vivo14. Una de las principales ventajas de esta metodología es su simplicidad; no requiere ninguna modificación genética o instrumentación voluminosa. Muchas células internalizarán espontáneamente siNWs foto-sensibles sin necesidad de sonicación o electroporación15. Además, escaparán espontáneamente de la encapsulación endosomal y formarán una integración perfecta con el citosol y los orgánulos intracelulares13,15. Estos compuestos cell-SiNWs, llamados híbridos de silicio celular, poseen la naturaleza dinámica, suave y versátil de la célula original, así como las capacidades optoeléctricas de los SiNW. Después de la hibridación, el híbrido cell-SiNW se puede cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y se utiliza para diversas aplicaciones como la estimulación bioeléctrica intracelular; estudio del acoplamiento bioeléctrico intercelular in vitro; y para el interrogatorio específico de la célula in vivo. Como una estimulación eficaz requiere la co-localización de altas densidades de potencia óptica y SiNWs, se puede lograr una alta resolución espacial tanto en 2D como en 3D. En este protocolo describimos en detalle la metodología, así como cómo se pueden analizar los resultados. El enfoque se centra en la investigación intra e intercelular in vitro, pero la implementación in vivo de esta metodología puede ser utilizada directamente para muchos otros escenarios biológicos.

<table><tbody><tr><td>35 mm Platos con fondo de vidrio</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Disco Giratorio Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Naranja Membrana plasmática Tinción</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, cola de rata</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Rotero de Trazado de Diamantes</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO,</td><td>Invitrogen</td> Anhidro <td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar Falcon</td><td></td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Humana de Fibronectina, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Series Limpiador ultrasónico avanzado</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, permeant celular</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO cámara de control ambiental completa (constante temperatura, humedad y CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.

La capacidad de esta metodología para permitir el acceso directo al citosol intracelular depende de la internalización espontánea del SiNW en las células. Aunque los SINW se someterán a una internalización espontánea en muchos tipos celulares15,algunas células, como los cardiomiocitos y las neuronas, necesitarán que los SINW sean tratados para permitir su internalización19. En este protocolo describimos el proceso de internalización de los SiNW p-i-n con un diámetro de 200-...

Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.

Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Esta técnica permite el interrogatorio bioeléctrico intracelular con una resolución espacial extremadamente alta y especificidad celular utilizando sólo microscopía óptica estándar. Este método facilita la estimulación y el interrogatorio eléctrico de las células y ubicaciones específicas dentro de las células y se puede realizar in vitro, así como en preparaciones de tejido ex vivo 3D. Esta técnica permite la investigación biotécnica de muchas arenas celulares como células cardíacas o cerebrales, así como la comunicación eléctrica entre todas nuestras células no excitables.Para aislar los miofibroblastos de una suspensión cardiomiocitos de miofibroblasto, pre-placa las células aisladas en una placa de cultivo de tejido de 100 milímetros durante una hora, ya que los cardiomiocitos necesitan una superficie de fibra cubierta y tratada para adherirse. Al final de la incubación, recoger el cardiomiocito enriquecido que contiene sobrenadante para el co-cultivo aguas abajo. Enjuague los miofibroblastos con DMEM para eliminar los cardiomiocitos restantes y alimentar las células con un medio de cultivo fresco antes de dos a cuatro días adicionales de incubación.Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, utilice un escriba de diamante para cortar un chip de tres por tres milímetros de una oblea con nanohilos de silicio cultivados por deposición de vapor químico. Y usa fórceps afilados para enjuagar las virutas en 70%etanol. Después del enjuague, seque al aire las virutas durante 30 minutos bajo la luz ultravioleta en una campana de flujo laminar de biosegura, antes de transferir las virutas a un tubo de micro centrífuga estéril.Utilice un enjuague completo del medio de cultivo celular para eliminar cualquier etanol restante, antes de sonicar las virutas en un mililitro de medio de cultivo fresco en un baño de sonicación durante uno a 10 minutos. El sobrenadante debe nublarse a medida que se liberan los nanohilos. Mezcle la suspensión de nanohilos de silicio en cinco mililitros de medio de cultivo fresco y sembrar la solución de nanoalimbramiento en el plato de los miofibroblastos.Después de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, enjuague el plato cinco veces con un medio de cultivo fresco para eliminar los nanohilos noenterizados y continúe incubando las células durante otra hora para permitir que los nanohilos parcialmente internalizados se incorporen completamente. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de recubrimiento de colágeno recién preparada a un plato inferior de vidrio de 35 milímetros. Después de una hora de incubación a 37 grados centígrados, enjuague el plato con PBS estéril y cosecha los híbridos de miofibroblast de nanocólica de silicio, con tres mililitros de trippsina, durante dos minutos a 37 grados centígrados.Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo, enjuague vigorosamente por pipeteo y no centrifugar más de 200 G para evitar dañar las células. Luego vuelva a suspender los pellets de células híbridas en un mililitro de medio fresco, y sembrar las células en el plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Para verificar la internalización del nanofondo, etiquete las células con citosol fluorescente y tintes de membrana, de acuerdo con los protocolos estándar, y utilice un microscopio confocal para tomar imágenes de las células.Como los nanohilos de silicio son altamente reflectantes, se puede utilizar luz reflejada en lugar de fluorescencia para su visualización. Para establecer un co-cultivo de cardiomiocitos híbrido de nanohilo de silicio miofibroblasto, sembrar el número adecuado de cada tipo de célula en un plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Y cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 48 horas, para permitir que las células formen uniones de brecha intercelular.El día del experimento, reemplace el sobrenadante de cultivo por un mililitro de medio de cultivo complementado con un tinte sensible al calcio recién preparado, para una incubación de 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lave la placa dos veces con PBS estéril, antes de tratar las células con un mililitro de DMEM libre de rojo fenol precalentó. Luego permita que el tinte de calcio intracelular se someta a des-esterificación durante 30 minutos a 37 grados Celsius, antes de adquirir imágenes basales.Antes de la toma de imágenes ópticas y la estimulación, precalentar una micro-incubadora humidificada en un microscopio con una línea láser colimada acoplada en la trayectoria de la luz, para la toma de imágenes de calcio y la estimulación óptica a 37 grados Celsius y una mezcla de dióxido de carbono de la era de la burbuja del 5%. Cuando el microscopio esté listo, coloque el co-cultivo híbrido de miofibroblastos en la micro incubadora y visualice los nanohilos mediante microscopía de campo brillante para localizar un sitio de estimulación adecuado. Cuando se haya identificado un sitio, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del nanoeléducido, y valide la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso, para cada tamaño de nanohilo de silicio y tipo de célula.Adquiera un registro de dos a diez segundos de la actividad basal de calcio intracelular, antes de estimular el nanoamátro con un solo pulso láser de uno a 10 melowatts de potencia y una duración de uno a 10 milisegundos, registrando la onda de calcio resultante durante otros dos a 10 segundos. Al final del experimento transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica al programa de software adecuado, para un análisis adicional. Utilizando la óptica de contraste de fase estándar, las células de confluencia se ven fácilmente mediante microscopía de luz.Los nanohilos de silicio, sin embargo, apenas son visibles, haciendo que sus ubicaciones sean imposibles de definir por este método. La super imposición de imágenes de campo claro y oscuro, sin embargo, permite la visualización de la disposición nuclear Perry de los nanohilos de silicio reflectante de luz. La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar membranas de citosol y plasma manchadas por marcadores fluorescentes, haciendo que la ubicación intracelular de los nanohilos de silicio sea más evidente.Usando la microscopía estándar, se puede obtener una imagen de campo brillante para identificar la ubicación del nanohilo de silicio que se va a estimular. A continuación, se puede obtener un breve vídeo de referencia de los cardiomiocitos que golpean espontáneamente y los miofibroblastos en reposo. Después de la estimulación, se puede registrar la propagación del calcio dentro del co-cultivo.El tiempo en el que las diferentes células se excitan puede ser determinado por el punto en el que el cambio en el flujo óptico promedio alcanza su máximo. El flujo óptico se puede calcular para ayudar en la identificación del tiempo de activación dentro de cada región de celda. Las velocidades intracelulares se pueden determinar para cada célula utilizando gráficos de Khaimah, con la pendiente de la línea que representa la inversa de la velocidad de propagación intracelular.Por ejemplo, aquí, se puede observar un resumen de las diferentes velocidades inter e intracelulares medidas para las interacciones celulares dentro de un único co-cultivo. Este método se puede utilizar para estudios in vivo inyectando la célula híbridos de silicio directamente en el tejido y utilizando preparaciones ex vivo 3D para estudiar la compañía eléctrica in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo se ilustra cómo los tintes sensibles al voltaje activar la grabación óptica de la actividad eléctrica de las redes neuronales intactos como los plexos de la cobaya sistema nervioso entérico, con una resolución ajustable que va desde una sola de las células ganglionares de varios circuitos.

Grabación óptica de la actividad eléctrica en el conejillo de Indias Redes entérica con tintes sensibles al voltaje

Adultos nacidos en las neuronas que expresan ChR2 puede ser manipulado en los preparativos rebanada electrofisiológicos para examinar su contribución a la función olfativa de los circuitos neuronales.

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Se describen métodos para la gran escala de grabación de múltiples unidades individuales y potencial del campo local en comportando los roedores con sondas de silicio. Unidad de fabricación, el apego de la sonda a la unidad y los procesos de implantación de la sonda se ilustran con suficiente detalle para facilitar la réplica.

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

Este video demuestra el uso de un chip microfluídico recubierto de matriz extracelular para diferenciar células madre neurales y progenitoras o NPC a través de la estimulación eléctrica. Después de sembrarse y adherirse a la región recubierta, las NPC crecen y la aplicación de una corriente continua desencadena su diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Diferenciación inducida por estimulación eléctrica de células madre neurales y progenitoras

La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

Este protocolo describe cómo utilizar el calentamiento transitorio asociado con la absorción óptica de nanovarillas de oro para estimular la diferenciación y la actividad del calcio intracelular en las células neuronales. Estos resultados abren potencialmente nuevas aplicaciones en prótesis neurales y estudios fundamentales en neurociencia.

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Se describe un método para la estimulación de la actividad eléctrica de cultivos celulares in vitro con luz visible, basado en el uso de polímeros semiconductores orgánicos.

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cultivos neuronales son un buen modelo para el estudio de las técnicas de estimulación del cerebro emergentes a través de su efecto sobre las neuronas individuales o una población de neuronas. Aquí se presentan los diferentes métodos para la estimulación de cultivos neuronales estampadas por un campo eléctrico producido directamente por los electrodos de baño o inducida por un campo magnético variable en el tiempo.

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Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.

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El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

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Este protocolo describe la fabricación avanzada de materiales y los métodos ex vivo de corazón de rata para la biointerfaz bidireccional óptica y eléctrica, lo que permite una estimulación cardíaca precisa, registro y modelado de infartos para la investigación bioelectrónica.

Interfaces eléctricas y optoelectrónicas bidireccionales en corazones de rata ex vivo sanos e isquémicos

Aprende a utilizar nanohilos de silicio para la bio-modulación óptica intracelular con alta resolución espacial. Este método permite investigar la comunicación eléctrica entre células cardíacas y cerebrales in vitro e in vivo.

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