Name: Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a preparar liposomas marcados con fluoróforo y evaluar su captación celular in vivo mediante citometría de flujo. Este protocolo utiliza sonicación y evaporación rotatoria para sintetizar nanopartículas de 163 nm.

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Los autores desean agradecer a Michael Solga y al resto del personal del Núcleo de Citometría de Flujo por proporcionar capacitación y servicios de citometría de flujo. Los autores también desean agradecer a Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye y Prasad Srikakulapu por su ayuda con la preparación de liposomas (SSKD, DKB), las cosechas de tejidos (MAM, JCG) y la tinción por citometría de flujo y la adquisición de muestras (AU, PS, CM). Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 y R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 y T32 HL007284.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un protocolo de tres partes para (i) preparar liposomas marcados con un colorante lipídico fluorescente y cargados con un compuesto antidiabético, tesaglitazar, (ii) administrar liposomas a un ratón mediante inyección retroorbitaria, y (iii) cosechar, procesar y teñir tejidos para detectar la absorción de liposomas a nivel celular mediante citometría de flujo. Este protocolo revisa la preparación de liposomas de aproximadamente 150 μm y la evaluación de la captación en tejido adiposo, sangre y bazo. La preparación de liposomas es escalable, se realiza principalmente a temperatura ambiente y utiliza la evaporación de fase inversa para maximizar la carga de fármaco y la eliminación de disolventes orgánicos. Usando este protocolo, se puede alcanzar una concentración de tesaglitazar de hasta 2 mg/ml en la muestra de liposoma purificada. Los liposomas preparados pueden almacenarse en tampón HEPES a 4 °C durante más de un año. En nuestra experiencia, demostraron una variación mínima del tamaño medio de partícula. Menos del 10% de pérdida de contenido de fármaco se demostró espectrofotométricamente, después de la separación por ultrafiltración de liposomas de fármaco externo con un filtro centrífugo de 10 kDa.
Durante la preparación de los liposomas, hay algunos pasos críticos y factores a considerar. En primer lugar, el orden de los pasos del protocolo es importante y debe cumplirse. En segundo lugar, el pH de la solución utilizada al cargar tesaglitazar debe mantenerse en 7.4 para maximizar la solubilidad y la carga efectiva. En tercer lugar, el montaje adecuado de equipos y filtros garantiza que la salida de cada paso sea del tamaño y la pureza adecuados. Por ejemplo, si los filtros de 100 y 200 nm no se ensamblan correctamente, puede resultar un lote de liposomas más heterogéneo y de tamaño incorrecto. En cuarto lugar, se necesita la eliminación completa del acetato de Ca-antes de la carga del fármaco para maximizar la transferencia de tesaglitazar a los liposomas. Para probar la eliminación completa del acetato de Ca, use sedimentación de alta velocidad para eliminar los liposomas y luego mida los niveles de acetato de Ca-en la solución no liposomal. En quinto lugar, es importante pesar y registrar la masa de todos los materiales añadidos a la preparación de liposomas en cada paso. Esto garantiza que se puedan calcular las concentraciones adecuadas y que se mantengan las proporciones necesarias de materiales. Finalmente, si la técnica no se ejecuta correctamente, puede haber un nivel indeseable de heterogeneidad. Es importante verificar minuciosamente este parámetro utilizando DLS y otros enfoques como la microscopía electrónica. Para mejorar la homogeneidad, considere ajustar el tamaño del filtro seleccionado o apilar dos filtros.
Además, es fundamental que los controles y un panel de anticuerpos para la citometría de flujo se planifiquen y optimicen antes de realizar este protocolo en su totalidad (Tabla 1, Tabla 3). Los anticuerpos deben probarse para garantizar que se utilicen las concentraciones adecuadas para la tinción y que la superposición entre los fluoróforos sea mínima. La excitación y emisión del tinte utilizado durante la preparación de liposomas también debe tenerse en cuenta en la planificación del panel. En nuestros resultados, utilizamos DiD, que tiene una excitación y emisión similares a los fluoróforos como la aloficocianina (APC) y AlexaFluor 647. Por lo tanto, no seleccionamos anticuerpos conjugados a estos fluoróforos en nuestro panel de anticuerpos. Además, los controles de isotipo no están incluidos en este protocolo. Esto se debe a que los anticuerpos seleccionados para este protocolo son anticuerpos bien validados y disponibles comercialmente. Sin embargo, si está interesado en usar un anticuerpo que no se haya optimizado previamente, considere probar el anticuerpo contra un control de isotipo en los tejidos de interés antes de realizar el experimento completo.
Si bien este protocolo demuestra cómo extraer y procesar la sangre, el bazo, el tejido adiposo inguinal y el tejido adiposo epididimario del ratón después del tratamiento, este enfoque general se puede aplicar a otros tejidos. Dependiendo del tejido de interés, puede ser necesario alterar los protocolos de procesamiento y digestión como se publica para los siguientes tejidos: pulmón21, hígado22, cavidad peritoneal 3, médula ósea3,23, cerebro 24.
Una limitación importante de este método a considerar es que la absorción solo puede evaluarse en un punto de tiempo por animal. Por lo tanto, puede ser ventajoso acoplar este protocolo con otras técnicas de imagen no invasivas o planificar en consecuencia para garantizar recursos suficientes para realizar la evaluación. El momento de la absorción celular y el cambio celular son factores importantes a considerar: los liposomas circularán por todo el cuerpo en las primeras 24 h y, dependiendo de la vida útil de las células que absorben los liposomas o de cómo responden a la absorción, puede ocurrir la muerte celular o una fagocitosis adicional. Nuestro estudio previo demostró cambios en las características poblacionales de las poblaciones de DiD+ en diferentes puntos temporales3. Por esa razón, es importante evaluar la absorción en puntos de tiempo anteriores o puntos de tiempo más relevantes para la biología del mecanismo de interés. Además, aunque la cuantificación de la captación celular en todo el tejido se puede realizar con este protocolo, la citometría de flujo no puede revelar la localización del tejido. Combinar este enfoque con métodos histológicos puede ayudar a abordar esta limitación.
En general, este protocolo complementa la metodología existente, como la histología y las imágenes de fluorescencia de cuerpo entero. Con los continuos avances en las herramientas y métodos de citometría de flujo, será posible el desarrollo de paneles más grandes para poblaciones celulares cada vez más específicas. Sugerimos que este protocolo se utilice además de los métodos antes mencionados, ya que esto mejorará la evaluación de la captación celular y también brindará la oportunidad de validar los resultados observados por citometría de flujo. Por ejemplo, ¿debería encontrarse que la mayoría de las partículas en el tejido adiposo fueron absorbidas por macrófagos por citometría de flujo? La inmunofluorescencia de una alícuota adicional del mismo tejido adiposo podría guardarse, fijarse, seccionarse y teñirse para los marcadores de macrófagos para verificar que el tipo de célula realmente absorbe liposomas. Este enfoque debería agregar rigor a los ensayos de biodistribución de nanopartículas realizados: validar la orientación específica de la célula, cuantificar la absorción celular, identificar la absorción fuera del objetivo y, con suerte, proporcionar información para generar hipótesis mecanicistas para los resultados terapéuticos observados. Este protocolo también se puede adaptar para futuros estudios utilizando diferentes liposomas, investigando la captación en otros tejidos y probando nuevos compuestos en el contexto de la obesidad y el dismetabolismo o cualquier otra enfermedad en la que la administración de nanopartículas sea una opción terapéutica factible.

A medida que crece el interés en el desarrollo de terapias que utilicen la administración de fármacos con nanopartículas, los métodos para preparar y evaluar la distribución y absorción de partículas deben continuar avanzando, expandiéndose y siendo accesibles para la comunidad de investigación 1,2. Este protocolo fue desarrollado para evaluar los tipos celulares exactos que absorbieron liposomas in vivo después de un tratamiento con liposomas marcados con DiD cargados con tesaglitazar, un agonista del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR)-α/γ 3,4. En estos estudios, pudimos evaluar qué tipos de células se vieron directamente afectados por el tratamiento liposomal con tesaglitazar, la eficacia de dirigirse a las mitades y generar hipótesis para explicar los resultados del tratamiento que observamos. Además, las funciones biológicas establecidas en una variedad de tipos de células sugieren que las células fagocíticas como los macrófagos, las células dendríticas y las células de Kupffer específicas del hígado absorben la mayoría de los liposomas 5,6,7. Utilizando este protocolo, hemos demostrado que los fagocitos no clásicos también podrían absorber liposomas 3,4.
Este protocolo presenta un método optimizado para solubilizar tesaglitazar, preparar liposomas por evaporación en fase inversa y usar acetato de calcio como atrayente para la carga remota de fármacos. Los métodos presentados son accesibles para muchos laboratorios y carecen de materiales difíciles de adquirir y pasos que requieren altas temperaturas. El protocolo produce liposomas de tamaños que son óptimos para el aumento de la circulación in vivo8. Además, como resumen Su et al., hasta la fecha, los métodos para evaluar la distribución de liposomas in vivo y la absorción tisular han sido estudiados y probados en profundidad9. Los métodos de tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética (RM) y tomografía molecular de fluorescencia (TMF) se aplican para cuantificar la biodistribución y captación específicas del tejido 9,10,11. Si bien estos métodos se han optimizado para maximizar la detección in vivo, aún carecen de la capacidad de cuantificar la absorción de liposomas in vivo a resolución celular. El protocolo presentado aquí tiene como objetivo lograr esta necesidad mediante el uso de la citometría de flujo. Finalmente, para este protocolo, la captación celular se redujo a unos pocos tejidos, incluido el tejido adiposo. Existe un creciente cuerpo de literatura que investiga el potencial de uso de nanopartículas para administrar terapias en el contexto de la obesidad, el dismetabolismo y la inflamación 12,13,14,15,16,17. Como tal, sentimos que era importante compartir un protocolo con métodos efectivos para procesar y analizar el tejido adiposo, uno de los tejidos que juega un papel importante en estas patologías.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 25, estéril para inyección retroorbital</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 27, estéril para inyección retroorbitaria</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Antiratón B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clon RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clon AFS98</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11b PerCP Cy5.5</td><td>anticuerpo BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clon M1/70</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c APC ef780 anticuerpo</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clon N418</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clon 1D3</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD3 FITC anticuerpo</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clon 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clon 390</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>557235 Clon 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-ratón F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clon BM8</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Columna</td> <td>de centrifugación desalinizanteThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba columna de espín</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de luz, Nicomp 370</td><td>Sistema de dimensionamiento de partículas, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & Kit de permeabilización celular PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de liposomas</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante oftálmico</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz</td></tr><tr><td>Paraformaldehído estéril, 16% p/v aq. soln., sin metanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Vial de polietileno para picado</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Bomba y almohadilla de terapia de calor</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato grabadas en pista</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Membranas hidrofílicas de policarbonato Nuclepore</td></tr><tr><td>Sistema ZetaSizer/DLS-ELS</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Existe un creciente interés en el uso de liposomas para administrar compuestos in vivo, particularmente para enfoques de tratamiento dirigidos. Dependiendo de la formulación del liposoma, los liposomas pueden ser absorbidos preferentemente por diferentes tipos de células en el cuerpo. Esto puede influir en la eficacia de la partícula terapéutica, ya que la progresión de diferentes enfermedades es específica del tejido y del tipo celular. En este protocolo, presentamos un método para sintetizar y etiquetar fluorescentemente liposomas utilizando DSPC, colesterol y PEG-2000 DSPE y el colorante lipídico DiD como marcador fluorescente. Este protocolo también presenta un enfoque para administrar liposomas in vivo y evaluar la absorción de liposomas específicos de células mediante citometría de flujo. Este enfoque se puede utilizar para determinar los tipos de células que absorben liposomas y cuantificar la distribución y la proporción de la absorción de liposomas entre los tipos de células y tejidos. Si bien no se mencionan en este protocolo, los ensayos adicionales, como la inmunofluorescencia y las imágenes de fluorescencia unicelular en un citómetro, fortalecerán cualquier hallazgo o conclusión que se haga, ya que permiten la evaluación de la tinción intracelular. Los protocolos también pueden necesitar ser adaptados dependiendo de los tejidos de interés.

Producción de liposomas
Los resultados publicados aquí son similares a los de nuestro trabajo publicado anteriormente 3,4,20. Utilizando el protocolo presentado aquí, esperamos producir liposomas de aproximadamente 150\u2012160 nm de tamaño. DLS revela un diámetro promedio de liposomas de 163.2 nm y un potencial zeta de -19.2 mV (Figura 1A). Las imágenes de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) revelan liposomas circulares (Figura 1B) y el diagrama DLS revela una desviación estándar relativamente pequeña del diámetro promedio (Figura 1C).
La unión positiva a liposomas requiere un control tratado con PBS
Estudios previos de nuestro grupo que emplea este protocolo investigaron qué subconjuntos celulares en SVF adiposo, bazo y sangre se unieron a los liposomas después de una semana de administración in vivo 3,4. Usando un ratón tratado con PBS, la cavidad peritoneal y las células del bazo se tiñeron con el mismo panel de anticuerpos utilizado en muestras de ratones tratados con liposomas. Los tejidos se recolectaron después de una semana de tratamientos (Figura 2A). Las muestras del ratón tratado con PBS sirvieron como un DiD FMO con el que crear puertas DiD positivas (Figura 2B, C). Se puede crear una puerta positiva utilizando una señal DiD-positiva, pero las muestras que carecen de señal DiD también deben usarse para verificar que la puerta positiva no incluya ninguna muestra DiD-negativa.
Las valoraciones son necesarias para optimizar las señales de fluorescencia
Antes de ejecutar un experimento completo, se deben optimizar varias condiciones, incluida la concentración de anticuerpos conjugados fluorescentes utilizados durante la tinción celular y del colorante lipídico utilizado durante la preparación de liposomas. Los citómetros de flujo tienen un límite superior de detección de la intensidad de fluorescencia, por lo que demasiado colorante incorporado en los liposomas conducirá a niveles no cuantificables de señal DiD en muestras que pasan por el citómetro. Además, demasiado DiD en los liposomas puede conducir a altos niveles de transferencia de tinte no específico, lo que podría sesgar los resultados de captación celular. La Figura 3 informa los resultados de un experimento en el que se ajustaron concentraciones de colorante lipídico para identificar la concentración que produciría una señal óptima dentro del rango de detección del citómetro de flujo que se utilizó. Esto se realizó en los tejidos de interés para el experimento final: Sangre (Figura 3A), SVF adiposa inguinal (Figura 3B) y SVF adiposa epididimaria (Figura 3C). Las concentraciones seleccionadas para la prueba fueron 10 mg de DiD (alto, rojo), 1 mg de DiD (medio, azul) o 0,1 mg de DiD (bajo, gris) por 1 ml de liposomas. La concentración más alta utilizada en los liposomas fue demasiado alta y superó el rango cuantificable del citómetro en los tres tejidos (Figura 3A\u2012C, rojo). La concentración más baja de DiD mostró alguna señal (Figura 3 A\u2012C, gris), pero no se observó una población clara más allá de las células tratadas con PBS (Figura 3A\u2012C, negra). Cuando se cuantificó, la media aritmética de la DiD MFI para cada tejido y concentración demostró una clara distinción entre los controles de PBS y la concentración media de DiD (Figura 3D). Por lo tanto, como se indica en el protocolo, seleccionamos la concentración media (Figura 3, azul) para usar en nuestra preparación de liposomas.
El uso de un panel de anticuerpos múltiples permite la identificación de la captación de liposomas por diferentes subconjuntos celulares
Usando el panel descrito en la Tabla 3, las células se tiñeron con anticuerpos contra marcadores para macrófagos a, células B, células T, células dendríticas, monocitos y células endoteliales (Figura 4). Se requieren estrategias de compuerta ligeramente diferentes para cada tipo de tejido, pero la mayoría de los mismos tipos de células se pueden identificar en cada uno. Algunas excepciones incluyen las células endoteliales, que normalmente no se encuentran en la sangre, y los monocitos, que suelen tener una frecuencia más alta en la sangre que otros tejidos. Una vez que se identifican las poblaciones, se puede cuantificar el tamaño total de cada población celular y la frecuencia con la que son DiD +. Se pueden realizar cálculos adicionales para caracterizar la población de DiD +: qué porcentaje de células DiD + son macrófagos, células endoteliales, etc. Tenga en cuenta que estas son estrategias de compuerta de ejemplo, pero no la única forma de analizar las muestras. El análisis será dictado por el panel seleccionado y el citómetro de flujo disponible.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplo de características de los liposomas preparados. (A) El tamaño y el potencial zeta se midieron como se describió anteriormente y se han informado en forma de tabla. Cada parámetro se presenta como la media ± la desviación estándar. (B) Se utilizó Cryo-EM para obtener imágenes de los liposomas preparados. La barra de escala blanca tiene una longitud de 50 nm. (C) Se utilizó DLS para generar un histograma del diámetro de los liposomas en esta preparación. Esta figura está adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Tinción DiD representativa de ratones tratados con PBS o liposomas. (A) Esquema experimental para PBS y tratamientos liposómicos. PBS o liposomas se inyectaron tres veces en el transcurso de una semana. Los tejidos se cosecharon el día 8 de tratamiento. (B, C) Los diagramas de flujo representativos revelan tinción DiD positiva en ratones tratados con liposomas (C), pero no tratados con PBS (B). FSC, dispersión hacia adelante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titulación de DiD en liposomas. Los liposomas se prepararon con tres concentraciones diferentes de DiD y se inyectaron en ratones. El gris indica la baja concentración a 0,1 mg de DiD por 1 ml de liposomas, el azul indica la concentración media a 1 mg de liposomas DiD/ml y el rojo indica la alta concentración a 10 mg de liposomas DiD/ml. Se utilizó un ratón tratado con PBS como control negativo (negro). La sangre (A, círculo), adiposo inguinal (B, triángulo) y el adiposo epididimario (C, cuadrado) se recolectaron 24 h después de la inyección y se procesaron para aislar una suspensión unicelular. Estas muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo hasta el nivel de DiD detectable. Se presentan histogramas específicos de tejido con superposiciones de cada grupo de tratamiento para demostrar la intensidad de fluorescencia por concentración (A\u2012C). La media aritmética de DiD también se cuantificó para cada tejido y concentración y se graficó (D). SSC = dispersión lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Análisis de citometría de flujo representativa de subconjuntos celulares en SVF adiposo, sangre y bazo. (A\u2012C) Esquema representativo de la estrategia de compuerta para identificar subconjuntos celulares y células DiD+ en SVF adiposo (A), bazo (B) y sangre (C). Abreviaturas: FSC = dispersión hacia adelante; LD = vivo/muerto; L-DC = células dendríticas linfoides; M-DC = células dendríticas mieloides; SSC = dispersión lateral. Esta figura está adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Control</td>
			<td>Propósito</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Ratón tratado con PBS o solución salina</td>
			<td>Utilice las células de este ratón para los siguientes controles de citometría de flujo:</td>
		</tr><tr><td>1. Células no teñidas</td>
		</tr><tr><td>2. Mancha única viva/muerta</td>
		</tr><tr><td>3. Células teñidas con el panel completo, pero que carecen de la fluorescencia del liposoma para determinar la señal positiva del liposoma durante el análisis</td>
		</tr><tr><td>Este / estos ratones / ratones también se utilizarán para determinar si los liposomas tienen algún efecto in vivo, ya que tendrá un control no liposomático en su experimento.</td>
		</tr><tr><td>Liposomas descargados</td>
			<td>Si está cargando un compuesto en sus liposomas, una porción de su lote de liposomas debe sintetizarse sin el compuesto. Esto explica cualquier efecto in vivo de los liposomas solos.</td>
		</tr><tr><td>DiD solo</td>
			<td>Dado que DiD también puede ser absorbido por las membranas celulares, la asignación de algunos ratones para recibir tinte libre en una cantidad igual a la que se encuentra en los liposomas ayudará a explicar cualquier tinción de membrana de fondo.</td>
		</tr><tr><td>Controles de fluorescencia menos uno (FMO)</td>
			<td>Estas son células teñidas con todos menos uno de los anticuerpos en su panel. Al igual que # 3 en el cuadro anterior, esto ayuda a determinar la verdadera señal positiva para ese anticuerpo durante el análisis.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Controles a utilizar en este protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solución</td>
			<td>Componentes</td>
			<td>Volumen aproximado necesario por lote/ratón</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparación de liposomas</td>
		</tr><tr><td>Acetato de calcio</td>
			<td>1 M de acetato de calcio enH2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Búfer HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES enH2O, pH 7.4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar en HEPES</td>
			<td>en HEPES de 10 mM</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Cosecha, procesamiento y tinción de tejidos</td>
		</tr><tr><td>Solución tamponada con fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 en H 2O destilado</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparina</td>
			<td>Heparina de 0,1 mM en PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Búfer HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES en PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampón de digestión</td>
			<td>2 mg/ml de colagenasa tipo I en tampón HEPES</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lisis AKC</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA en ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampón FACS</td>
			<td>1% BSA, 0.05% NaN3 en PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Bloque Fc (diluido)</td>
			<td>Bloque Fc 1:50 en búfer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Tampón de fijación</td>
			<td>Paraformaldehído al 2% en PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Soluciones para preparar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tinción extracelular (mezcla de anticuerpos 2x)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volumen Ab por ensayo de 100 μL</td>
			<td>Volumen total necesario:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Columna C x 1.2 x Total # muestras</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/prueba) x (1,2) x (# muestras)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/prueba) x (1,2) x (# muestras)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/prueba) x (1,2) x (# muestras)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/prueba) x (1,2) x (# muestras)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PEI</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Para crear su mezcla de anticuerpos, combine los anticuerpos calculados en la columna D con tampón FACS o tampón de tinción violeta brillante* hasta un volumen final de (50 μL x 1.2 x Total # muestras)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tinción viva/muerta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Muerto</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volumen L/D por ensayo de 200 uL</td>
			<td>Volumen total necesario:</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Muerto</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Columna C x 1.2 x Total # muestras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tinción intracelular (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volumen Ab por ensayo de 50 μL</td>
			<td>Volumen total necesario:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Columna C x 1.2 x Total # muestras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Se debe usar el tampón de tinción violeta brillante si se usa más de un anticuerpo conjugado con un fluoróforo violeta brillante en su panel.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Ejemplo de panel de anticuerpos y cálculos de mezclas de tinción para usar para la tinción de flujo.

El objetivo de este protocolo es sintetizar liposomas marcados con fluorescencia y utilizar la citometría de flujo para identificar la localización in vivo de liposomas a nivel celular.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Nuestro protocolo combina un método accesible para preparar liposomas cargados de tesaglitazar con un enfoque exhaustivo para evaluar la absorción de liposomas a nivel celular. Esta técnica proporciona un método imparcial para evaluar la absorción de liposomas marcados con fluorescencia que se preparan a bajas temperaturas y equipos fáciles de adquirir. Para preparar liposomas marcados con fluorescencia cargados de acetato de calcio y tesaglitazar, primero se utiliza una sonda de media pulgada para emulsionar una solución de éter cloroformo de lípidos mediante sonicación durante 30 segundos a temperatura ambiente, 20 kilohercios y 50% de potencia.Transfiera inmediatamente la solución de emulsión de agua y aceite homogeneizada a un evaporador rotativo con un adaptador especial, un manómetro nanométrico y una válvula reguladora de presión y conecte el evaporador a una línea de vacío. Para eliminar los disolventes orgánicos, ajuste la velocidad de rotación a 100 revoluciones por minuto y el vacío a 0,5 atmósferas. Después de que se forme y desaparezca un gel, aumente el vacío a 0,9 atmósferas y filtre la dispersión acuosa de liposomas de un lado a otro a través de un filtro de policarbonato de vertido de 200 nanómetros en una extrusora de liposomas equipada con dos jeringas herméticas al gas varias veces.Después de verificar la distribución del tamaño mediante la dispersión dinámica de la luz, utilice una columna de centrifugado de dos mililitros para eliminar cualquier tesaglitazar no atrapado de los liposomas y utilice un espectrofotómetro para determinar la concentración del fármaco atrapado. A continuación, no añada más de 500 microlitros de muestra de liposomas al lecho de gel de columna seca. Para administrar los liposomas por inyección retroorbitaria, presione suavemente la piel por encima y por debajo del ojo expuesto para levantar el ojo por encima del plano de la cara.Luego, inserte con cuidado la punta de la aguja en la esquina frontal del ojo, asegurándose de que la aguja esté debajo del orbe sin tocarlo, e inyecte lentamente los liposomas en el espacio retroorbital. Para recolectar la muestra de sangre, en el punto final experimental apropiado, haga cuidadosamente una incisión en la piel en el borde del extremo caudal de la caja torácica del ratón y corte una línea recta de un centímetro hacia la cabeza del animal hasta que los músculos pectorales queden expuestos. En el sitio de la incisión inicial, haga dos cortes pequeños perpendiculares a la línea hacia la cabeza y corte cuidadosamente el músculo pectoral en un lado de la caja torácica en el área expuesta para permitir un mejor acceso y visualización del sitio de inserción de la aguja.Inserte la aguja entre la tercera y la cuarta costilla, manteniéndola lo más cerca posible de la línea central de la caja torácica, y tire suavemente de la jeringa hacia arriba para comenzar a recolectar sangre. Cuando se haya recogido el mayor volumen posible, transfiera la sangre a un tubo de microcentrífuga que contenga 10 microlitros de EDTA 0,5 molar en hielo. Para extraer la almohadilla inguinal de post-tejido de cada lado del ratón, use un juego de pinzas para sujetar la membrana peritoneal hacia el lado derecho y el segundo juego de pinzas para sostener el borde de la piel por encima de la membrana peritoneal en el otro.Tire suavemente de la piel para separar las capas entre sí. Sujete con alfileres el borde exterior de la piel para acceder mejor al depósito adiposo y localizar el depósito de tejido adiposo inguinal a lo largo de la piel. Y ubique el ganglio linfático inguinal en el centro del depósito adiposo con pinzas y tijeras para extirpar el ganglio linfático según sea necesario.Después de que se haya extirpado el ganglio linfático, use las pinzas para agarrar cuidadosamente el extremo del depósito adiposo más cercano al punto inmovilizado y comience a hacer pequeños cortes en la membrana conectiva entre el tejido adiposo y la piel. Levante el tejido adiposo de la piel mientras hace cortes para un mejor acceso a la membrana, y coloque el depósito en un vial de polietileno que contenga tampón HEPES en hielo. Para extraer los depósitos adiposos del epidídimo del extremo caudal de la cavidad peritoneal, utilice fórceps para extraer suavemente el primer depósito adiposo del epidídimo del extremo dorsal del ratón y localizar el epidídimo y los conductos deferentes unidos a este depósito.A continuación, corte con cuidado entre el depósito adiposo y el epidídimo y los conductos deferentes para separar el tejido adiposo de los demás tejidos y coloque el depo en un vial de polietileno con tampón HEPES en hielo. Cuando se hayan recolectado todos los tejidos, use uno o dos pares de tijeras para picar las muestras de tejido adiposo en fragmentos de tejido de 0,5 milímetros. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de colagenasa de dos miligramos por mililitro a los viales de trozos de tejido adiposo y coloque los viales en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados y 150 revoluciones por minuto durante 30 a 45 minutos.Después de 30 minutos, use una pipeta de un mililitro para triturar las muestras varias veces. Si las piezas de tejido aún son demasiado grandes para facilitar el pipeteo, devuelva las muestras a la incubadora durante 15 minutos más. Una vez que las muestras estén completamente digeridas, triture los fragmentos otras 10 veces para asegurar la creación de una suspensión de una sola célula y cuele cada muestra a través de filtros individuales de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros por muestra.Enjuague cada lima con cinco mililitros de tampón FACS para recoger las células restantes y filtre cada lavado en el vial apropiado de muestra de células con hielo. Cuando se hayan filtrado todas las muestras, recoja las células por centrifugación y aspire el sobrenadante de adipocitos de las muestras. A continuación, aspire cuidadosamente los sobrenadantes dejando intactos los gránulos de la fracción vascular estromal y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón FACS por tubo.A continuación, transfiera las suspensiones a nuevos tubos de 1,5 o 1,7 mililitros en hielo hasta el análisis citométrico de flujo mediante protocolos estándar. La dispersión dinámica de la luz revela un diámetro medio de liposoma de 163,2 nanómetros y un potencial zeta de menos 19,2 milivoltios. Las imágenes de microscopía electrónica criogénica revelan liposomas circulares con una desviación estándar relativamente pequeña obtenida del diámetro promedio medido por dispersión dinámica de la luz.El análisis de citometría de flujo de muestras de ratones tratados con PBS se puede utilizar como un control de fluorescencia DiD menos uno con el que crear puertas positivas de DiD. Como se ilustra en este análisis representativo, una concentración de carga de liposomas de DiD de 10 miligramos por mililitro es demasiado alta, superando el rango cuantificable del citómetro en los tres tejidos analizados. Una concentración de 0,1 miligramos por mililitro demuestra alguna señal, pero no se observa una población clara más allá de las células tratadas con PBS.Por lo tanto, se recomienda el uso de la concentración de un miligramo por mililitro, que demuestra una clara distinción del control PBS y que sigue siendo legible por el analizador, en la preparación de liposomas. Se requieren estrategias de activación ligeramente diferentes para cada tipo de tejido, pero la mayoría de los mismos tipos de células se pueden identificar en cada uno. Una vez que se identifican las poblaciones específicas de interés, se puede cuantificar el tamaño total de cada población celular y la frecuencia con la que son DiD positivas.La preparación de los reactivos y el equipo y la anticipación de los resultados de cada paso son cruciales. Los resultados inesperados desde el principio pueden arruinar los resultados futuros. Los métodos histológicos se pueden utilizar para evaluar la localización de los liposomas dentro de todo el tejido, mientras que la citometría de flujo por imágenes se puede utilizar para verificar la internalización de los liposomas por célula.

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