Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

Nuestro protocolo combina un método accesible para preparar liposomas cargados de tesaglitazar con un enfoque exhaustivo para evaluar la absorción de liposomas a nivel celular. Esta técnica proporciona un método imparcial para evaluar la absorción de liposomas marcados con fluorescencia que se preparan a bajas temperaturas y equipos fáciles de adquirir. Para preparar liposomas marcados con fluorescencia cargados de acetato de calcio y tesaglitazar, primero se utiliza una sonda de media pulgada para emulsionar una solución de éter cloroformo de lípidos mediante sonicación durante 30 segundos a temperatura ambiente, 20 kilohercios y 50% de potencia.

Transfiera inmediatamente la solución de emulsión de agua y aceite homogeneizada a un evaporador rotativo con un adaptador especial, un manómetro nanométrico y una válvula reguladora de presión y conecte el evaporador a una línea de vacío. Para eliminar los disolventes orgánicos, ajuste la velocidad de rotación a 100 revoluciones por minuto y el vacío a 0,5 atmósferas. Después de que se forme y desaparezca un gel, aumente el vacío a 0,9 atmósferas y filtre la dispersión acuosa de liposomas de un lado a otro a través de un filtro de policarbonato de vertido de 200 nanómetros en una extrusora de liposomas equipada con dos jeringas herméticas al gas varias veces.

Después de verificar la distribución del tamaño mediante la dispersión dinámica de la luz, utilice una columna de centrifugado de dos mililitros para eliminar cualquier tesaglitazar no atrapado de los liposomas y utilice un espectrofotómetro para determinar la concentración del fármaco atrapado. A continuación, no añada más de 500 microlitros de muestra de liposomas al lecho de gel de columna seca. Para administrar los liposomas por inyección retroorbitaria, presione suavemente la piel por encima y por debajo del ojo expuesto para levantar el ojo por encima del plano de la cara.

Luego, inserte con cuidado la punta de la aguja en la esquina frontal del ojo, asegurándose de que la aguja esté debajo del orbe sin tocarlo, e inyecte lentamente los liposomas en el espacio retroorbital. Para recolectar la muestra de sangre, en el punto final experimental apropiado, haga cuidadosamente una incisión en la piel en el borde del extremo caudal de la caja torácica del ratón y corte una línea recta de un centímetro hacia la cabeza del animal hasta que los músculos pectorales queden expuestos. En el sitio de la incisión inicial, haga dos cortes pequeños perpendiculares a la línea hacia la cabeza y corte cuidadosamente el músculo pectoral en un lado de la caja torácica en el área expuesta para permitir un mejor acceso y visualización del sitio de inserción de la aguja.

Inserte la aguja entre la tercera y la cuarta costilla, manteniéndola lo más cerca posible de la línea central de la caja torácica, y tire suavemente de la jeringa hacia arriba para comenzar a recolectar sangre. Cuando se haya recogido el mayor volumen posible, transfiera la sangre a un tubo de microcentrífuga que contenga 10 microlitros de EDTA 0,5 molar en hielo. Para extraer la almohadilla inguinal de post-tejido de cada lado del ratón, use un juego de pinzas para sujetar la membrana peritoneal hacia el lado derecho y el segundo juego de pinzas para sostener el borde de la piel por encima de la membrana peritoneal en el otro.

Tire suavemente de la piel para separar las capas entre sí. Sujete con alfileres el borde exterior de la piel para acceder mejor al depósito adiposo y localizar el depósito de tejido adiposo inguinal a lo largo de la piel. Y ubique el ganglio linfático inguinal en el centro del depósito adiposo con pinzas y tijeras para extirpar el ganglio linfático según sea necesario.

Después de que se haya extirpado el ganglio linfático, use las pinzas para agarrar cuidadosamente el extremo del depósito adiposo más cercano al punto inmovilizado y comience a hacer pequeños cortes en la membrana conectiva entre el tejido adiposo y la piel. Levante el tejido adiposo de la piel mientras hace cortes para un mejor acceso a la membrana, y coloque el depósito en un vial de polietileno que contenga tampón HEPES en hielo. Para extraer los depósitos adiposos del epidídimo del extremo caudal de la cavidad peritoneal, utilice fórceps para extraer suavemente el primer depósito adiposo del epidídimo del extremo dorsal del ratón y localizar el epidídimo y los conductos deferentes unidos a este depósito.

A continuación, corte con cuidado entre el depósito adiposo y el epidídimo y los conductos deferentes para separar el tejido adiposo de los demás tejidos y coloque el depo en un vial de polietileno con tampón HEPES en hielo. Cuando se hayan recolectado todos los tejidos, use uno o dos pares de tijeras para picar las muestras de tejido adiposo en fragmentos de tejido de 0,5 milímetros. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de colagenasa de dos miligramos por mililitro a los viales de trozos de tejido adiposo y coloque los viales en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados y 150 revoluciones por minuto durante 30 a 45 minutos.

Después de 30 minutos, use una pipeta de un mililitro para triturar las muestras varias veces. Si las piezas de tejido aún son demasiado grandes para facilitar el pipeteo, devuelva las muestras a la incubadora durante 15 minutos más. Una vez que las muestras estén completamente digeridas, triture los fragmentos otras 10 veces para asegurar la creación de una suspensión de una sola célula y cuele cada muestra a través de filtros individuales de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros por muestra.

Enjuague cada lima con cinco mililitros de tampón FACS para recoger las células restantes y filtre cada lavado en el vial apropiado de muestra de células con hielo. Cuando se hayan filtrado todas las muestras, recoja las células por centrifugación y aspire el sobrenadante de adipocitos de las muestras. A continuación, aspire cuidadosamente los sobrenadantes dejando intactos los gránulos de la fracción vascular estromal y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón FACS por tubo.

A continuación, transfiera las suspensiones a nuevos tubos de 1,5 o 1,7 mililitros en hielo hasta el análisis citométrico de flujo mediante protocolos estándar. La dispersión dinámica de la luz revela un diámetro medio de liposoma de 163,2 nanómetros y un potencial zeta de menos 19,2 milivoltios. Las imágenes de microscopía electrónica criogénica revelan liposomas circulares con una desviación estándar relativamente pequeña obtenida del diámetro promedio medido por dispersión dinámica de la luz.

El análisis de citometría de flujo de muestras de ratones tratados con PBS se puede utilizar como un control de fluorescencia DiD menos uno con el que crear puertas positivas de DiD. Como se ilustra en este análisis representativo, una concentración de carga de liposomas de DiD de 10 miligramos por mililitro es demasiado alta, superando el rango cuantificable del citómetro en los tres tejidos analizados. Una concentración de 0,1 miligramos por mililitro demuestra alguna señal, pero no se observa una población clara más allá de las células tratadas con PBS.

Por lo tanto, se recomienda el uso de la concentración de un miligramo por mililitro, que demuestra una clara distinción del control PBS y que sigue siendo legible por el analizador, en la preparación de liposomas. Se requieren estrategias de activación ligeramente diferentes para cada tipo de tejido, pero la mayoría de los mismos tipos de células se pueden identificar en cada uno. Una vez que se identifican las poblaciones específicas de interés, se puede cuantificar el tamaño total de cada población celular y la frecuencia con la que son DiD positivas.

La preparación de los reactivos y el equipo y la anticipación de los resultados de cada paso son cruciales. Los resultados inesperados desde el principio pueden arruinar los resultados futuros. Los métodos histológicos se pueden utilizar para evaluar la localización de los liposomas dentro de todo el tejido, mientras que la citometría de flujo por imágenes se puede utilizar para verificar la internalización de los liposomas por célula.