Name: Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprende a preparar y microinyectar embriones de Drosophila para microscopía de células vivas mediante un analizador automatizado de alto contenido. Este método permite la adquisición simultánea de múltiples embriones para análisis cuantitativo de la reorganización del retículo endoplásmico durante la mitosis.

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UD, WFM y BR cuentan con el apoyo del Centro para la Construcción Celular, un Centro de Ciencia y Tecnología de la National Science Foundation (NSF), en virtud del acuerdo de subvención DBI-1548297. BR también es compatible con un premio NSF CAREER, 1553695.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí es altamente versátil y fácilmente adaptable para el estudio de eventos biológicos en una variedad de etapas en el desarrollo embrionario de Drosophila. Este protocolo es adecuado para el estudio de procesos biológicos que se producen durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, los estudios de celularización29,30 o la formación de dominios de heterocromtina en Drosophila31,32 podrían beneficiarse de la utilización de los métodos descritos en este protocolo ya que estos procesos se producen durante un período prolongado de tiempo. Además, el tamaño de la muestra se puede aumentar disminuyendo el aumento para estudiar preguntas que requieren menos resolución óptica, como el tiempo entre las divisiones sincitiales33 o la duración de la gastrulación34.  Del mismo modo, un objetivo de 20x permite que dos embriones se toten dentro de un plano de imagen. Los métodos de este protocolo proporcionan una plataforma dinámica para hacer preguntas biológicas utilizando el desarrollo embrionario como sistema modelo para el análisis cuantitativo.
Hay 3 pasos críticos en este protocolo. Post descorionación en 50% lejía es imperativo que los embriones se enjuaguen y se secan vigorosamente 5 veces (2.3.4). Este paso elimina cualquier resto de pequeños trozos de chorion. La tarea sobrante obstruirá el campo de visión al tomar imágenes del embrión. Al montar los embriones en el cubreobjetos de vidrio (3.5), es importante presionar los embriones sobre el pegamento con una presión uniforme. Esto colocará los embriones en el mismo plano z. Al abrir la aguja de microinyección, es importante retraer el émbolo inmediatamente para ajustar el caudal de la aguja o perderá todo el inyector.
Nuestro estudio estuvo limitado por dos factores. El primer factor fue no tener un proceso de segmentación automatizado. Diseñamos un script de segmentación manual usando MATLAB, sin embargo; con un marcador de husillo genéticamente codificado este proceso podría ser automatizado. En el futuro nos gustaría producir CNN-RFP21,Rtln1-GFP y CNN-RFP; Líneas transgénicas ReepB-GFP para permitir la segmentación automatizada del husillo. Para obtener más información sobre nuestro script y canalización de análisis de MATLAB, consulte materiales suplementarios de Diaz et al.15. En segundo lugar, también estábamos limitados por nuestro intervalo de adquisición de 35 s, que sólo nos permitió imaginar 6 embriones simultáneamente. Un intervalo de adquisición más largo nos permitiría hacer una imagen simultánea de más embriones. Aunque el rendimiento de la entrega de medicamentos puede aumentar mediante la sustitución de la microinyección por un paso de permeación, nos pareció innecesario ya que nuestro tamaño de la muestra ya estaba limitado por el intervalo de adquisición.
Si bien este protocolo se utilizó para crear imágenes del desarrollo embrionario de Drosophila, el enfoque general es adaptable para estudiar el desarrollo embrionario en otros sistemas de modelos multicelulares, como C. elegans,Sea Urchins y Xenopus. Los embriones son extremadamente útiles para el análisis cuantitativo, ya que se sincronizan fácilmente a través de la recolección o fertilización. Además, los embriones no se alejan ni nadan lejos de un campo de visión, lo que permite el uso de un software simple con capacidad de adquisición multipunto para producir múltiples videos de lapso de tiempo para el análisis cuantitativo. Aunque utilizamos un analizador de alto contenido en nuestro estudio, cualquier sistema de microscopio invertido capaz de adquisición multipunto puede ser emparejado con los métodos mencionados en el presente documento.
Se pueden obtener resultados similares utilizando un microscopio confocal invertido capaz de adquisición multipunto; sin embargo, las ventajas de un analizador de alto contenido surgen a medida que se aumenta el tamaño de la muestra para estudiar preguntas que requieren menos resolución en el tiempo. Una ventaja obvia al usar un analizador de alto contenido es la capacidad de crear imágenes de 4 diapositivas separadas simultáneamente en comparación con 1 diapositiva en sistemas tradicionales. Con un conjunto completo de 4 diapositivas y 40 embriones en cada diapositiva, 160 embriones se pueden obtener imágenes durante varias horas, siempre y cuando el intervalo de adquisición sea de al menos 15 minutos entre fotogramas. Otra ventaja importante del uso de un analizador de alto contenido es que las muestras están completamente selladas de cualquier fuente de luz externa, lo que es necesario para las mediciones basadas en la intensidad de fluorescencia. Por último, el analizador de alto contenido utilizado en nuestro estudio tiene una cámara CMOS de 5,5 megapíxeles que proporciona un generoso campo de visión de 221,87 m con un aumento de 60x. Este campo de visión más grande nos permitió imaginar la mitad de un embrión por punto de adquisición.

En los últimos 30 años, los avances en tecnologías de imagen y sondas moleculares para imágenes de células vivas han avanzado en nuestra comprensión de la complejidad y el funcionamiento interno de la célula. Acompañando este avance en la tecnología es una mayor dependencia del uso de modelos de cultivo celular ex vivo para la adquisición de datos de imágenes de alto rendimiento. Los modelos de cultivo celular proporcionan varias ventajas, incluido el control del microambiente a través de sistemas microfluídicos, y la capacidad de tomar imágenes simultáneamente de varias células, lo que permite el uso de enfoques cuantitativos necesarios para el cribado de alto rendimiento1,2. Sin embargo, también hay desventajas significativas asociadas con los modelos de cultivo celular en el contexto de estudios morfológicos, tales como vidrio bidimensional o superficies plásticas que producen efectos confusos sobre la morfología celular y su regulación3,4,5. Estos efectos pueden proporcionar datos falsos o engañosos con respecto al estudio de procesos biológicos que regulan la morfología celular.
Aunque la alternativa ha sido estudiar la morfología celular en el contexto de un organismo intacto6, pocos organismos intactos adecuados facilitan la toma de imágenes cuantitativas de células vivas de alto rendimiento debido a las dificultades para mantener vivos los organismos enteros a través de imágenes, y los desafíos asociados con la imagen dentro de un gran organismo multicelular. Como resultado, los estudios biológicos celulares en organismos intactos generalmente se han centrado en observar un solo organismo a lo largo del tiempo, lo que limita en gran medida el tamaño de la muestra. Además, esta limitación de un animal a la vez hace que la imagen en vivo sea difícil y costosa de emplear en forma de pantalla y restringe la capacidad de aplicar herramientas analíticas cuantitativas, ya que el número de muestras es generalmente demasiado pequeño. Por lo tanto, surge la necesidad de un organismo modelo multicelular que se puede utilizar para enfoques cuantitativos basados en alto contenido.
Este protocolo adapta el embrión Drosophila para imágenes de alto contenido basadas en placas para generar tamaños de muestra experimentales lo suficientemente grandes como para el análisis cuantitativo. Drosophila melanogaster es comúnmente conocido como el primer organismo modelo. La investigación con Drosophila ha dado lugar a avances en biología celular y molecular, incluyendo la transmisión de información genética, la identificación de vías de señalización celular y los requisitos genéticos del desarrollo embrionario7,8,9. Además, el embrión Drosophila se ha utilizado para explorar la dinámica de microtúbulos in vivo durante la división celular10,11,12. El uso de microinyección para entregar moléculas pequeñas y sondas moleculares proporciona un control temporal que hace que el desarrollo embrionario de Drosophila sea particularmente potente para sondear procesos celulares in vivo13,14. Sin embargo, generar un número significativo de repeticiones experimentales con un enfoque de imagen tradicional es extremadamente laborioso y tiene un uso limitado en pantallas de imágenes de alto rendimiento y análisis cuantitativo. Nuestro enfoque hace uso de un analizador de alto contenido normalmente reservado para el análisis de una sola célula y adapta el análisis de imágenes in vivo en el sincitio de los primeros Drosophila embryo.
Este protocolo se utilizó para recoger, escenificar y microinyectar embriones Drosophila para explorar los mecanismos que impulsan los cambios morfológicos en el Retículo Endoplasmático (ER) durante la mitosis15. Aunque muchos estudios han esbozado la naturaleza dinámica de la sala de emergencias durante el ciclo celular16,17,18,19, ha sido difícil comparar los efectos de múltiples perturbaciones a través del tiempo en la morfología de er er. Para identificar los componentes que impulsan los cambios en la morfología de ER a través de la división celular, los métodos enumerados en este protocolo se utilizaron para sondear el papel de los microtúbulos y otros factores citoesqueléticos en la reorganización mitótica de la ER utilizando la división sincitial cortical en el embrión de Drosophila temprano. En conjunto, la disponibilidad de perturbación genética dentro de la comunidad Drosophila, la capacidad de microinyección de fármacos y sondas moleculares en momentos precisos durante el desarrollo, y el costo económico de trabajar con Drosophila hace que este enfoque sea altamente susceptible de cribado basado en imágenes de alto rendimiento. Los métodos descritos aquí son aplicables para el estudio de una amplia variedad de procesos celulares y de desarrollo in vivo utilizando el embrión Drosophila 20. Específicamente, este protocolo está bien adaptado para estudiar eventos biológicos que ocurren durante un período prolongado y dentro de 100 micras de la corteza embrionaria de Drosophila.

<table><tbody><tr><td>10 x 35mm Micro Plato</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10799-192</td><td>N/A</td></tr><tr><td>100% Jugo de Uva Concentrado</td><td>Welch's, 100% Concentrado Jugo de Uva</td><td>N/A</td><td>Compra en la tienda de comestibles</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 250 ml, boca estrecha</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10536-914</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tamiz no metálico de 3" No. 140</td><td>Gilson Company</td><td>SV-165 #140</td><td>N/A</td></tr><tr><td>4 Imágenes de portaobjetos Bandeja</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 400104</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ACROS Organics, n-heptano, 99+%, para espectroscopía</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: AC411255000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, Etanol, 99.5%, reactivo ACS, absoluto, 200 pruebas</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# : AC615095000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, 4-hidroxibenzoato de metilo, 99% . (metilparabeno)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: AC126961000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cubrecubierta, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Vidrio Flotado</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-143-782</td><td>N/A</td>Material de</tr><tr><td>la lámina de silicona Culture Well: 1,6 mm de grosor</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 664273</td><td>n/a</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Scintillation Vials Fisher</td><td>Scientific</td><td>Cat #: 03-341-71A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Jaula de recolección de embriones-Mini</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-105</td><td>N/A Puntas</td>de</tr><tr><td>pipeta Eppendorf Microloader</td><td>Fisher Scientific</td><td>Código de producto: 10289651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrífuga cónica Falcon 15mL</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#: 05-527-90</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 14-432-22</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fleischmann's, Levadura seca activa</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Compra en el supermercado</td></tr><tr><td>Platos de</td><td>uva REFFER A LA PREPARACIÓN DE RECETAS</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Aceite Halocarbon 27 Genesee</td><td>Scientific</td><td>Cat #: 59-133</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Aceite Halocarbon 700</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-131</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pegamento de heptano</td><td>REFFER A LA PREPARACIÓN DE RECETAS</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar industriales (acero al carbono quirúrgico) de un solo filo n.º 9</td><td>VWR</td><td>Cat #: 55411-050</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Película de sellado de laboratorio Parafilm M, 4 pulgadas x 250 pies Roll</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-998-944</td><td>N/A</td></tr> Cinta adhesiva escocesa <tr><td>de doble cara con dispensador, ancho estrecho, diseñada para pegar, 1/2" x 7 yardas, paquete de 3 Caddy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: NC0879005</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Perlas de gel de sílice, desecante ~ 2 - 5 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU: 1077351000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cuchara/espátula de acero inoxidable</td><td>VWR</td><td>Cat #: 470149-044</td><td>N/A</td></tr><tr><td>W.A. Hammond Drierite Indicadora Absorbentes Fisher</td><td>Scientific</td><td>Cat #: 23-116582</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pasta de levadura</td><td>REFFER TO RECIPE PREP</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12 Sobremesa, Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Necesitará acceso a insertos de centrífuga cónicos de 15 ml.</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cualquier autoclave funcionará bien.</td></tr><tr><td>Microinyector Drummond Nanoject II.</td><td>Drummond Scientific</td><td>N/A</td><td>Este es un sistema de inyección a base de aceite mineral.</td></tr><tr><td>Analizador de células GE Healthcare IN 6000.</td><td>GE healthcare</td><td>N/A</td><td>Se puede sustituir por un microscopio confocal rápido capaz de adquisición multipunto.</td></tr><tr><td>Refrigerador (4C&deg;)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Los medios para moscas y la pasta de levadura deben almacenarse a (4C&deg;).</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Zies Stemi 508 con base de transiluminación 300 e iluminación cenital de cuello de cisne.</td><td>Microscopía Zeiss</td><td>N/A</td><td>La base de transiluminación y la iluminación de cuello de cisne son necesarias.</td></tr></tbody></table>

preparación y microinyección de embriones de drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Los enfoques modernos en la imagen cuantitativa de células vivas se han convertido en una herramienta esencial para explorar la biología celular, al permitir el uso de estadísticas y modelado computacional para clasificar y comparar procesos biológicos. Aunque los sistemas de modelos de cultivo celular son ideales para imágenes de alto contenido, estudios de alto rendimiento de morfología celular sugieren que los cultivos ex vivo son limitados en la recapitulación de la complejidad morfológica que se encuentra en las células dentro de los organismos vivos. Como tal, hay una necesidad de un sistema de modelo escalable de alto rendimiento para poner imágenes de células vivas dentro de un organismo intacto. Aquí se describe un protocolo para utilizar un analizador de imágenes de alto contenido para adquirir simultáneamente múltiples videos de lapso de tiempo del desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster durante la etapa de blastodermo sincitial. El blastodermo sincitial ha servido tradicionalmente como un gran modelo in vivo para la toma de imágenes de eventos biológicos; sin embargo, la obtención de un número significativo de réplicas experimentales para enfoques cuantitativos y de alto rendimiento ha sido intensiva en mano de obra y limitada por la obtención de imágenes de un solo embrión por repetición experimental. Aquí se presenta un método para adaptar los enfoques de imagen y microinyección para adaptarse a un sistema de imágenes de alto contenido, o cualquier microscopio invertido capaz de la adquisición automatizada de múltiples puntos. Este enfoque permite la adquisición simultánea de 6-12 embriones, dependiendo de los factores de adquisición deseados, dentro de una sola sesión de imagen.

El enfoque presentado en este protocolo se utilizó para examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del Retículo Endoplasmático (ER) durante la mitosis en el embrión Drosophila 15. Durante la mitosis, la estructura de la sala de emergencias muestra una reorganización dramática, sin embargo, las fuerzas que impulsan estos cambios se entienden mal. Recientemente, se demostró que una familia de proteínas de moldeo de Urgencias promueve la formación de tubos de ER25,26,27,28,que son conocidos por su proximidad con microtúbulos28. Para estudiar el rollo de microtúbulos sobre la morfología de urgencias, se utilizaron los métodos proporcionados en el protocolo para generar datos para comparar cuantitativamente los efectos de varios tratamientos farmacológicos microinyecidos en la reorganización de la ER durante la mitosis. Se encontró que la colchicina, que previene la polimerización de nuevos microtúbulos, reduce drásticamente la reorganización de la er durante la mitosis, como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6. Además, el enfoque descrito aquí permitió la producción de datos de imágenes de vueltas de tiempo para 32 embriones. Se realizaron mediciones de intensidad media y máxima a partir de 12.800 regiones de interés utilizando un script MATLAB personalizado, que también generó estadísticas descriptivas e inferenciales vitales para realizar comparaciones entre tratamientos farmacológicos. Debido a la disponibilidad de sondas moleculares y la facilidad de las microinyeccións, los métodos descritos aquí son fácilmente adaptables para estudiar una variedad de procesos biológicos a través de la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figura 5: Imágenes representativas del enriquecimiento Rtnl1-GFP y ReepB-GFP en los polos del husillo durante la mitosis. (A) Campo de visión 60x de ReepB-GFP durante la mitosis en el ciclo celular 10. El cuadrado azul representa el campo de visión utilizado para los paneles B-E. El panel A se procesa con un filtro binario de umbral. Este filtro no se aplicó a los paneles B-E, ya que excluye los datos de píxeles por debajo del umbral establecido. (B,D) ReepB-GFP en control, y en colchicina. (C,E) Rtnl1-GFP en control, y en colchicina. Esta cifra ha sido modificada de Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figura 6: Cantidad del enriquecimiento Rtnl1-GFP y ReepB-GFP en los polos del husillo durante la mitosis. Se analizaron 20 husillos y 20 ROI de citoplasma en 10 cuadros en busca de 32 embriones en las siguientes condiciones. (A) Inyecciones de control DMSO del 10% para los embriones Rtnl1-GFP. Los embriones de control mostraron un aumento de 0,1 veces en el enriquecimiento (p&lt;0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con las muestras no inyectadas (p &lt; 0.001 para todas las muestras en T210). (B) Embriones ReepB-GFP inyectados con 10% DMSO para servir como control. Los embriones de control mostraron un aumento de 0,1 veces en el enriquecimiento (p&lt;0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con las muestras no inyectadas(Figura 1E; p &lt; 0.001 para todas las muestras en T210). (C) Embriones Rtnl1-GFP inyectados con 5 M de Colchicina. Aquí medimos una reducción en el enriquecimiento Rtnl1-GFP a husillos (p &lt; 0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con los controles (A) (p &lt; 0.001 para todas las muestras en T210). (D) Embriones ReepB-GFP inyectados con 5 M de Colchicina. Medimos una reducción en el enriquecimiento ReepB-GFP a los husillos (p&lt;0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con los controles (B) (p&lt;0.001 para todas las muestras en T210). Esta cifra ha sido modificada de Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Pasta de levadura21</td>
			<td>2. Placas de uva21</td>
			<td>3. Pegamento de heptano24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Añadir 7 gramos de levadura seca activa a un cónico de 50 ml. Agregue 9 mililitros de agua DI y mezcle hasta la constancia con una espátula metálica.</td>
			<td>2.1 Hacer solución a: Añadir 6 gramos de agar a 140ml de agua DI en un matraz de 250 ml y autoclave.</td>
			<td>3.1 Llene un vial de centelleo de vidrio con 50 pulgadas de cinta adhesiva de doble cara.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Añadir 7 gramos de levadura seca activa a un cónico de 50 ml. Agregue 9 mililitros de agua DI y mezcle hasta la constancia con una espátula metálica.</td>
			<td>2.2 Hacer solución b: Mezclar 0,1 gramos de parabeno de metilo en 2 ml de etanol, luego añadir esta solución a 60 ml de concentrado de jugo de pomelo.</td>
			<td>3.2 Añadir 20 ml de heptano y sellar el vial de centelleo de vidrio con parafilm. Gire durante la noche a temperatura ambiente.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Inmediatamente después de la solución de autoclave a, mezclar en la solución b y verter la mezcla en 10 x 35 mm de platos perti. (hace 35 placas de uva)</td>
			<td>3.3 Retire los residuos de cinta de plástico transfiriendo pegamento a 2 tubos cónicos de 15 ml y centrifugando a 3000 RPM durante 15 minutos.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Deje que las placas de uva se ajusten a temperatura ambiente durante la noche sin tapa. Cubra las placas con tapas y guárdelas en 4C después de que se ajusten.</td>
			<td>3.4 Transfiera el sobrenadante de pegamento en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para su almacenamiento.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Recetas de medios y soluciones.

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Este protocolo permite la adquisición simultánea de varios embriones dentro de una sesión de imágenes. Mientras que la preparación de muestras está adaptada para la adquisición de múltiples puntos utilizando un analizador de alto contenido, las muestras preparadas con este protocolo se pueden tomar imágenes en cualquier microscopio invertido capaz de adquirir varios puntos. Para empezar, organice dos filas de 15 a 20 embriones en una sección limpia de gran plato utilizando una herramienta de recolector de óvulos.Alinee los embriones en su lado ventral en la misma orientación con respecto a los extremos anterior y posterior. Adherir un espaciador en un cubreobjetos y rayar 10 microlitros de pegamento de heptano por el inserto de vidrio de cubrelip expuesto. Mientras el pegamento se seca, usa una cuchilla de afeitar para cortar un rectángulo alrededor de las dos filas de embriones.Corte un segundo rectángulo junto al primero y retire el segundo rectángulo con un borde recto de una espátula de acero inoxidable. Deslice cuidadosamente el borde recto de la espátula debajo del primer rectángulo y retírelo. A continuación, coloque el recorte con embriones en el lado externo de una placa de 3,5 centímetros.Bajo un microscopio estéreo, baje un cubreobjetos preparado sobre los embriones y presione suavemente las dos filas de embriones sobre el pegamento. Si no realiza la microinyección, llene el espaciador de silicona hasta la parte superior con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27. Forte los bordes inferiores de un adaptador de placa de cuatro diapositivas con cinta adhesiva de doble cara.Esto evitará que la diapositiva se mueva durante la toma de imágenes. Asegúrese de no colocar la cinta en la ruta del objetivo. Monte el cubreobjetos en el adaptador de placa de cuatro deslizamientos.Si microinyecía los embriones, coloque el cubreobjetos con embriones sobre una diapositiva para evitar que la parte inferior del cubreobjeto se ensucie durante la desicación y la microinyección. Deseque los embriones durante cinco a 10 minutos, luego cúbralos inmediatamente con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27, llenando el espaciador de silicona hasta la parte superior. Cargue dos o tres agujas de microinyección con aproximadamente dos microlitros de inyector utilizando una punta de carga extendida.Monte una aguja en el microinyector y presione el émbolo hasta la punta, aumentando la presión de aire dentro del capilar de vidrio. Baje la aguja de vidrio en un portaobjetos de vidrio y corte la punta de la aguja con una nueva maquinilla de afeitar número nueve, cortando en un ángulo de 45 grados para producir una punta abierta afilada. El inyector debe fluir hasta la parte inferior de la punta sin salir de la aguja.Agregue cuidadosamente 20 microlitros de aceite de halocarbono sobre la punta de la aguja y vuelva a cortarlo abierto en un ángulo de 45 grados. El inyector debe comenzar a fluir rápidamente, así que recuerde ajustar la presión retrayendo el émbolo. Utilice el micromaniprógrafo para colocar la aguja en el centro del campo de visión.A continuación, levante la aguja y retire el portaobjetos de vidrio de debajo de ella. Coloque los embriones en la etapa del microscopio estéreo, debajo de la aguja de microinyección y concéntrese en ellos a 50 veces el aumento. Baje la aguja hasta que entre en el mismo plano de enfoque que los embriones.Mover la diapositiva con una mano y operar el microinyector con la otra, inyectar una fila de embriones. Levante la aguja y gire el portaobjetos 180 grados para exponer la segunda fila de embriones a la aguja de microinyección. Baje la aguja e inyecte la segunda fila de embriones.Este protocolo se utilizó para examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del retículo endoplasmático durante la mitosis en el embrión de Drosophila. Los efectos de varios tratamientos farmacológicos microinyecitos en la reorganización de urgencias se compararon cuantitativamente. Se encontró que la colchicina, que previene la polimerización de nuevos microtúbulos, reduce drásticamente la localización de la sala de emergencias a los polos de husillo durante la mitosis.Se adquirieron datos de imágenes de lapso de tiempo para 32 embriones. Se analizaron mediciones de intensidad media y máxima a partir de 12.800 regiones de interés utilizando un script MATLAB personalizado. Al intentar este protocolo por primera vez, recuerde no tomar demasiado tiempo en un solo paso, de lo contrario corre el riesgo de perder su etapa de desarrollo que desea imaginar.Practique este protocolo paso a paso antes de realizar cualquier experimento. Nuestro método de preparación de muestras facilita la adquisición simultánea de múltiples embriones durante un experimento, generando así suficientes réplicas experimentales para el análisis cuantitativo. Este protocolo puede ayudar a la transición de la embriología del desarrollo de experimentos de imagen cualitativos a cuantitativos.La capacidad de imaginar varios embriones dentro de una sesión de imágenes también elimina el ruido experimental entre réplicas.

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Investigación

JoVE Journal

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Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

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Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aprende a preparar y microinyectar embriones de Drosophila para microscopía de células vivas mediante un analizador automatizado de alto contenido. Este método permite la adquisición simultánea de múltiples embriones para análisis cuantitativo de la reorganización del retículo endoplásmico durante la mitosis.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido (Video) | JoVE Journal

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

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