Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido
19 de enero de 2021
Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.
Este protocolo permite la adquisición simultánea de varios embriones dentro de una sesión de imágenes. Mientras que la preparación de muestras está adaptada para la adquisición de múltiples puntos utilizando un analizador de alto contenido, las muestras preparadas con este protocolo se pueden tomar imágenes en cualquier microscopio invertido capaz de adquirir varios puntos. Para empezar, organice dos filas de 15 a 20 embriones en una sección limpia de gran plato utilizando una herramienta de recolector de óvulos.
Alinee los embriones en su lado ventral en la misma orientación con respecto a los extremos anterior y posterior. Adherir un espaciador en un cubreobjetos y rayar 10 microlitros de pegamento de heptano por el inserto de vidrio de cubrelip expuesto. Mientras el pegamento se seca, usa una cuchilla de afeitar para cortar un rectángulo alrededor de las dos filas de embriones.
Corte un segundo rectángulo junto al primero y retire el segundo rectángulo con un borde recto de una espátula de acero inoxidable. Deslice cuidadosamente el borde recto de la espátula debajo del primer rectángulo y retírelo. A continuación, coloque el recorte con embriones en el lado externo de una placa de 3,5 centímetros.
Bajo un microscopio estéreo, baje un cubreobjetos preparado sobre los embriones y presione suavemente las dos filas de embriones sobre el pegamento. Si no realiza la microinyección, llene el espaciador de silicona hasta la parte superior con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27. Forte los bordes inferiores de un adaptador de placa de cuatro diapositivas con cinta adhesiva de doble cara.
Esto evitará que la diapositiva se mueva durante la toma de imágenes. Asegúrese de no colocar la cinta en la ruta del objetivo. Monte el cubreobjetos en el adaptador de placa de cuatro deslizamientos.
Si microinyecía los embriones, coloque el cubreobjetos con embriones sobre una diapositiva para evitar que la parte inferior del cubreobjeto se ensucie durante la desicación y la microinyección. Deseque los embriones durante cinco a 10 minutos, luego cúbralos inmediatamente con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27, llenando el espaciador de silicona hasta la parte superior. Cargue dos o tres agujas de microinyección con aproximadamente dos microlitros de inyector utilizando una punta de carga extendida.
Monte una aguja en el microinyector y presione el émbolo hasta la punta, aumentando la presión de aire dentro del capilar de vidrio. Baje la aguja de vidrio en un portaobjetos de vidrio y corte la punta de la aguja con una nueva maquinilla de afeitar número nueve, cortando en un ángulo de 45 grados para producir una punta abierta afilada. El inyector debe fluir hasta la parte inferior de la punta sin salir de la aguja.
Agregue cuidadosamente 20 microlitros de aceite de halocarbono sobre la punta de la aguja y vuelva a cortarlo abierto en un ángulo de 45 grados. El inyector debe comenzar a fluir rápidamente, así que recuerde ajustar la presión retrayendo el émbolo. Utilice el micromaniprógrafo para colocar la aguja en el centro del campo de visión.
A continuación, levante la aguja y retire el portaobjetos de vidrio de debajo de ella. Coloque los embriones en la etapa del microscopio estéreo, debajo de la aguja de microinyección y concéntrese en ellos a 50 veces el aumento. Baje la aguja hasta que entre en el mismo plano de enfoque que los embriones.
Mover la diapositiva con una mano y operar el microinyector con la otra, inyectar una fila de embriones. Levante la aguja y gire el portaobjetos 180 grados para exponer la segunda fila de embriones a la aguja de microinyección. Baje la aguja e inyecte la segunda fila de embriones.
Este protocolo se utilizó para examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del retículo endoplasmático durante la mitosis en el embrión de Drosophila. Los efectos de varios tratamientos farmacológicos microinyecitos en la reorganización de urgencias se compararon cuantitativamente. Se encontró que la colchicina, que previene la polimerización de nuevos microtúbulos, reduce drásticamente la localización de la sala de emergencias a los polos de husillo durante la mitosis.
Se adquirieron datos de imágenes de lapso de tiempo para 32 embriones. Se analizaron mediciones de intensidad media y máxima a partir de 12.800 regiones de interés utilizando un script MATLAB personalizado. Al intentar este protocolo por primera vez, recuerde no tomar demasiado tiempo en un solo paso, de lo contrario corre el riesgo de perder su etapa de desarrollo que desea imaginar.
Practique este protocolo paso a paso antes de realizar cualquier experimento. Nuestro método de preparación de muestras facilita la adquisición simultánea de múltiples embriones durante un experimento, generando así suficientes réplicas experimentales para el análisis cuantitativo. Este protocolo puede ayudar a la transición de la embriología del desarrollo de experimentos de imagen cualitativos a cuantitativos.
La capacidad de imaginar varios embriones dentro de una sesión de imágenes también elimina el ruido experimental entre réplicas.
Descripción general
Este protocolo permite la microinyección y la visualización simultánea de múltiples embriones de Drosophila durante el desarrollo embrionario mediante un sistema de imagen de alto contenido. El método facilita el análisis cuantitativo al permitir la adquisición de múltiples embriones en una sola sesión de imagen.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del desarrollo
- Embriología
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La microinyección es una técnica fundamental para estudiar el desarrollo embrionario.
- La obtención simultánea de imágenes de múltiples embriones mejora los replicados experimentales.
- El análisis cuantitativo es esencial para comprender los procesos del desarrollo.
- La obtención de imágenes de alto contenido permite la observación detallada de la dinámica celular.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la microinyección e imagen eficiente de embriones de Drosophila.
- Facilitar el análisis cuantitativo del desarrollo embrionario.
- Examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del retículo endoplasmático durante la mitosis.
Métodos Utilizados
- Preparación de embriones sobre un cubreobjetos para la obtención de imágenes.
- Microinyección de embriones con agentes inyectables específicos.
- Adquisición de imágenes de lapso de tiempo para capturar los cambios del desarrollo.
- Análisis de mediciones de intensidad mediante scripts de MATLAB.
Resultados principales
- El tratamiento con colchicina redujo significativamente la localización del RE en los polos del huso.
- Se recopilaron datos de imágenes de lapso de tiempo para 32 embriones.
- Se realizaron comparaciones cuantitativas entre varios tratamientos farmacológicos.
- La metodología permite réplicas experimentales robustas.
Conclusiones
- Este protocolo mejora la capacidad de realizar experimentos de imágenes cuantitativas.
- Facilita la transición del análisis cualitativo al cuantitativo en biología del desarrollo.
- Reduce el ruido experimental mediante la obtención de imágenes de múltiples embriones simultáneamente.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen de alto contenido en tiempo real de embriones de Drosophila permite un análisis cuantitativo, respaldado estadísticamente, de procesos celulares en un organismo intacto, abordando las limitaciones de los flujos de trabajo ex vivo y de muestras individuales. Este protocolo facilita la adquisición escalable y reproducible de múltiples réplicas experimentales, reduciendo el ruido experimental y mejorando la confianza predictiva en estudios tempranos de descubrimiento y estudios mecanicistas. El enfoque es directamente relevante para equipos de biofármacos que buscan plataformas robustas de imagen in vivo de alto rendimiento para la validación de dianas y la exploración de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de mecanismos celulares en un sistema intacto y fisiológicamente relevante.
- Apoya la validación funcional de objetivos al permitir la manipulación y observación simultánea de múltiples embriones.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa de los efectos de perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Mejora la confianza predictiva al generar conjuntos de datos estadísticamente significativos a partir de réplicas paralelas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara muestras biológicas validadas y reproducibles para flujos de trabajo de imágenes de alto contenido.
- Normaliza la orientación y preparación de las muestras, favoreciendo la reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos.
- Permite lecturas cuantitativas y multiparamétricas adecuadas para cribados de compuestos o genéticos.
- Reduce la variabilidad entre réplicas mediante la obtención de imágenes de múltiples embriones en una sola sesión.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona un modelo in vivo relevante para la enfermedad, útil para evaluar las respuestas celulares frente a perturbaciones.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante imágenes cuantitativas a nivel de organismo.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos sólidos y reproducibles.
- Facilita la identificación de biomarcadores traslacionales mediante salidas de imágenes de alto contenido y lapse de tiempo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en el continuo de descubrimiento desde estudios mecanicistas iniciales hasta la validación en modelos preclínicos, cerrando la brecha entre el cultivo celular y el análisis de organismo completo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la observación directa de eventos celulares in vivo.
- Selección: Proporciona muestras listas para ensayos y reproducibles para imágenes de alto rendimiento y análisis cuantitativo.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de intensidad y datos de lapse de tiempo para comparaciones estadísticas rigurosas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se ajusta a los requisitos de modelos preclínicos al permitir imágenes y manipulaciones a nivel de organismo.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo escalable y adaptable para diversas aplicaciones mecanicistas y de selección en equipos de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza y escala la preparación de muestras y el análisis por imagen, mejorando la reproducibilidad y el rendimiento.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más sólidas de avance o interrupción y una mayor eficiencia del capital al generar conjuntos de datos cuantitativos y robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de los programas de descubrimiento basándose en datos de alto contenido y obtenidos in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones, microinyección e instrumentación de imágenes de alto contenido.
- Necesita acceso a microscopios invertidos con adquisición automatizada de múltiples puntos y software analítico compatible.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y de adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a otros sistemas modelo con etapas de desarrollo e requisitos de imagen similares.
- El momento y el manejo son críticos para mantener la fidelidad de la etapa de desarrollo y la calidad de los datos.
