Construcción de mutantes en el serotipo 1 Streptococcus pneumoniae cepa 519/43

Este protocolo es importante porque permite la modificación genética de un serotipo previamente intratable, lo que permite investigar y comprender el serotipo. Esto abre vías para el trabajo biológico, como el desarrollo de vacunas. Vanessa S. Terra, profesora asistente de la Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, demostrará el procedimiento.

Para comenzar, genere el plásmido pSD1 realizando una ligadura siguiendo las instrucciones del fabricante de pGEM-T Easy System I. Incubar la reacción durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transforme E. coli Dh5-alfa químicamente competente con pSD1, incubando 50 microlitros de las células con tres microlitros de reacción de ligadura de pSD1 durante 15 minutos en hielo, luego exponga las células a un choque térmico y coloque las células en hielo durante dos minutos.

Retire las células del hielo y agregue 350 microlitros de medio SOC, luego incube el cultivo durante dos horas a 37 grados Celsius y 120 RPM. Coloque la transformación en agar Luria-Bertani suplementado con 0,4 milimolar de IPTG, 0,24 miligramos por mililitro de X-Gal para la selección de azul-blanco y 100 microgramos por mililitro de ampicilina para garantizar que todas las colonias que crecen en la placa tengan la columna vertebral del plásmido. Elija tres colonias blancas que contengan pSD1 y establezca crecimientos durante la noche en 10 mililitros de L-B suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Incubar los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Al día siguiente, centrifugar los cultivos a 3.082 G y utilizar el pellet para la extracción de plásmidos. Después de extraer el ADN del plásmido, configure una digestión de restricción BamH1 tanto para el plásmido pSD1 como para el casete de espectinomicina.

Incubar las reacciones de digestión de restricción y controles a 37 grados centígrados durante tres horas. Una vez finalizada la restricción, analice los productos por electroforesis, luego extraiga la banda correcta y purifique con un kit comercial. A continuación, ejecute una reacción de ligadura utilizando la pSD1 digerida por BamH1 y la espectinomicina.

Esto generará el plásmido pSD2. Transformar pSD2 en E. coli DH5-alfa químicamente competente como se ha descrito anteriormente. A continuación, seleccione los transformantes portadores del plásmido pSD2 en función de su capacidad para crecer en LBA suplementado con 100 microgramos por mililitro de espectinomicina y ampicilina y extraiga el ADN del plásmido.

Prepare un cultivo nocturno de S. pneumoniae 519/43 en BHI y deje que crezca estáticamente a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, diluir los cultivos 1:50 y 1:100 en 10 mililitros de caldo BHI fresco. Incubar el cultivo estáticamente a 37 grados centígrados hasta que el diámetro exterior a 595 nanómetros esté entre 0,05 y 0,1.

Una vez que se alcance el diámetro exterior apropiado, tome 860 microlitros de cultivo y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Agregue 100 microlitros de hidróxido de sodio de 100 milimolares, 10 microlitros de 20% de BSA, 10 microlitros de cloruro de calcio de 100 milimolares, dos microlitros de 50 nanogramos por mililitro CSP1 y 500 nanogramos de pSD2. Incubar la reacción estáticamente a 37 grados centígrados durante tres horas.

A continuación, coloque 330 microlitros en placas de agar sangre al 5% suplementadas con 100 microgramos por mililitro de espectinomicina cada hora durante un período de incubación de tres horas. Luego, incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Parche las colonias resistentes a la espectinomicina en otra placa de agar sangre suplementada con 100 microgramos por mililitro de espectinomicina y en placas de agar sangre suplementadas con 100 microgramos por mililitro de ampicilina, que prueba la presencia de la columna vertebral del plásmido.

Incube ambos juegos de placas durante la noche. El correcto ensamblaje de pSD2 se confirmó mediante digestión de restricción. A continuación, se utilizó pSD2 para transformar 519,43 células de tipo salvaje.

Las colonias que crecieron con espectinomicina después de una incubación nocturna se consideraron transformadores positivos. La confirmación fenotípica de la mutación de neumolisina se realizó mediante la evaluación de la actividad hemolítica para la capa delta D39, 519/43 de tipo salvaje y 519/43 mutante. Esto se comparó con la hemólisis de los glóbulos rojos al 0,5%saponina, que se considera 100%El mutante perdió su capacidad de lisar los glóbulos rojos.

Todas las colonias positivas se confirmaron mediante secuenciación para evaluar la ubicación de la inserción. Se utilizaron cebadores con sitios de unión fuera de la región de homología. Al realizar la reacción de transformación, es importante agregar los reactivos en el orden correcto.