Name: Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a realizar un cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos que afectan la persistencia bacteriana en E. coli. Este protocolo adaptable facilita la evaluación de paneles de fármacos y bibliotecas genéticas.

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Nos gustaría agradecer a los miembros de Orman Lab por sus valiosos aportes durante este estudio. Este estudio fue financiado por el premio de transición profesional K22AI125468 de los NIH/NIAID y una beca de inicio de la Universidad de Houston.

1. Preparación de medio de crecimiento, solución de ofloxacina y acciones de células de E. coli
<ol><li>Medio regular Luria-Bertani (LB): Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada (DI). Esterilizar el medio por autoclave.</li>
	<li>Placas de agar LB: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar en agua DI y esterilizar el medio por autoclave. A la temperatura deseada (~55 °C), verter ~30 mL de agar medio en placas cuadradas (10 x 10 cm). Secar las placas y conservar a 4 °C.</li>
	<li>Medio LB modificado: Añadir 10 g/L de triptona y 5 g/L de extracto de levadura en agua DI. Esterilizar el medio por autoclave.</li>
	<li>Medio LB modificado incluyendo un osmolito: Mezcle 2x medio LB modificado con una solución de osmolito 2x en volúmenes iguales. Para preparar 2x medio LB modificado, añadir 20 g/L de triptona y 10 g/L de extracto de levadura en agua DI y esterilizar por autoclave. Para preparar la solución de osmillo 2x, disuelva el osmolito de interés (cantidad 2x) en agua DI y luego filtre la solución. NOTA: El osmolito de interés y sus concentraciones pueden determinarse a partir de los ensayos de cribado de microarrays de fenotipo (véase el Protocolo 4). Sin embargo, el osmolito probado y la concentración 2x asociada se pueden ajustar dependiendo de la naturaleza de la investigación. Por ejemplo, para estudiar el impacto del cloruro de sodio de 1 mM, una solución de osmolito 2x sería una solución de cloruro de sodio de 2 mM.</li>
	<li>Solución común de ofloxacina (5 mg/mL): Añadir 5 mg de sal de ofloxacina (OFX) en 1 mL de agua di. Añadir 10 μL de hidróxido de sodio 10 M para aumentar la solubilidad de OFX en agua, y luego filtrar esterilizar la solución. Preparar las alícuotas y conservar a -20 °C. NOTA: La ofloxacina es un antibiótico quinolona que ha sido ampliamente utilizado tanto para células bacterianas en crecimiento como para células bacterianas en crecimiento14,21. La concentración inhibitoria mínima (MIC) de OFX para las células mg1655 de E. coli está dentro del rango de 0,039–0,078 μg/mL19,20. También tenga en cuenta que otros antibióticos como la ampicilina y la kanamicina se utilizan comúnmente en la investigación persistente. La elección de los antibióticos depende de la naturaleza del estudio.</li>
	<li>
E. coli Poblaciones celulares MG1655: Inocular 2 mL de medio LB regular con una sola colonia en un tubo de ensayo de 14 mL (a presión) y cultivar las células en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C. Cuando las células alcancen la fase estacionaria, mezcle 500 μL del cultivo celular con 500 μL de glicerol al 50% (estéril) en un vial criogénico y guárdelo a -80 °C.</li>
</ol>2. Propagación de células para eliminar persistidores preexistentes
<ol><li>Para preparar un cultivo nocturno, raspe una pequeña cantidad de células de una culata de células congeladas con una punta de pipeta estéril (no descongele la culata de células de glicerol) e inoculte las células en 2 mL de medio LB modificado en un tubo de ensayo de 14 mL con tapa a presión. Cultite las células en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C durante 12 h.</li>
	<li>Primera propagación<ol>
<li>Después de 12 h, transferir 250 μL de cultivo nocturno a 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml cubierto con un papel de aluminio estéril.</li>
		<li>Crezca el cultivo celular en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C hasta que las células alcancen la fase exponencial media (OD600 = 0,5).</li>
		<li>Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600)utilizando un lector de microplacas cada 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segunda propagación<ol>
<li>A600 OD = 0,5, diluir 250 μL de cultivo celular del primer matraz en 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml.</li>
		<li>Cultivar el segundo cultivo celular en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C hasta OD600=0,5.</li>
		<li>Mida la densidad óptica cada 30 min. NOTA: Un cultivo nocturno puede tener una cantidad significativa de células persistentes4,5,22. El método de ciclo de dilución/crecimiento5 descrito anteriormente se puede utilizar para eliminar estos persistentes preexistentes antes de transferir las células a microarrays. Su eliminación puede validarse cuantificando los niveles persistentes de cultivos nocturnos con el ensayo descrito en el Protocolo 3. Este método ya ha sido validado en un estudio anterior19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Validación de la eliminación de celdas persistentes preexistentes
<ol><li>Después de la segunda propagación (véase el paso 2.3), diluir 250 μL del cultivo celular (OD600 = 0,5) en 25 ml de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml. NOTA: Para los controles, diluya 250 μL de cultivo nocturno (véase el paso 2.1) en 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml. Antes de transferir las células al matraz, la densidad celular del cultivo nocturno debe ajustarse en medio LB fresco modificado para obtener OD600 = 0,5.</li>
	<li>Añadir 25 μL de solución madre de OFX (5 mg/mL) en la suspensión celular y agitar suavemente el matraz para que el cultivo ensay sea homogéneo. La concentración final de OFX es de 5 μg/mL en el cultivo de ensayo.</li>
	<li>Incubar el cultivo de ensayo en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C.</li>
	<li>En cada hora durante el tratamiento (incluyendo 0 h, el punto de tiempo antes de agregar OFX en el cultivo de ensayo), transfiera 1 mL del cultivo de ensayo desde el matraz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrífuga el cultivo de ensayo en el tubo de microcentrífuga a 17.000 x g durante 3 min.</li>
	<li>Retire cuidadosamente 950 μL del sobrenadante sin alterar el pellet celular.</li>
	<li>Añadir 950 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado 3.5-3.7 por 3x en total hasta que la concentración de antibióticos esté por debajo de la concentración inhibitoria mínima (MIC).</li>
	<li>Después del lavado final, resuspend el pellet celular en 100 μL de solución de PBS, resultando en una muestra concentrada 10x.</li>
	<li>Tomar 10 μL de la suspensión celular y diluir en serie seis veces en 90 μL de solución de PBS usando una placa inferior redonda de 96 pozos.</li>
	<li>Detecte 10 μL de suspensiones de células diluidas en placas de agar fresco sin antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 μL restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco.</li>
	<li>Incubar las placas de agar a 37 °C durante 16 h, y luego contar las unidades formadoras de colonias (UFC). Tenga en cuenta las tasas de dilución mientras calcula el número total de UFC en 1 mL de cultivo de ensayo. Las curvas de muerte se generan trazando los valores logarítmicos de UFC con respecto a la duración del tratamiento con antibióticos. NOTA: Un tratamiento ofx de 6 h es suficiente para obtener una curva de muerte bifásica para las células de E. coli 19,20. El nivel persistente de células propagadas (según lo medido por las cuentas de CFU en 6 h) debe ser perceptiblemente menos que el de la cultura de noche. Los procedimientos descritos en los Protocolos 2 y 3 se pueden realizar con LB regular dependiendo del diseño de la investigación.</li>
</ol>4. Cribados de placas de microarrays 
<ol><li>Preparación de cultivos celulares de microarrays<ol>
<li>Transferir 250 μL de células en fase exponencial a 25 mL de medio LB fresco modificado en un tubo centrífugo de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea. NOTA: Las celdas de fase exponencial (OD600 = 0.5) se obtienen a partir del segundo paso de propagación (ver paso 2.3).</li>
		<li>Transfiera la suspensión de la célula diluida a un depósito estéril de 50 mL.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, transfiera 150 μL de la suspensión celular a cada pozo de un microarray, es decir, una placa de 96 pozos que contiene varios osmolitos. NOTA: Los pozos que no tienen osmolitos sirven como controles.</li>
		<li>Cubra el microarray con una membrana de sellado permeable al gas.</li>
		<li>Incubar la placa en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h. NOTA: En estos experimentos, se utilizaron placas disponibles en el mercado, como los microarrays de fenotipo (PM-9 y PM-10) que incluyen una amplia gama de osmolitos, tampones de pH y otros productos químicos en un estado seco a diversas concentraciones. Estos microarrays están en formatos de placa de medio área 96 pozos. Los volúmenes de cultivo deben ajustarse en función del tipo de placas que se utilicen. Los microarrays también se pueden generar manualmente (ver más abajo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación manual de placas de microarrays<ol>
<li>Transfiera 75 μL de 2x soluciones de osmolito a los pozos de una placa de medio área de 96 pozos.</li>
		<li>Transferir 500 μL de células en fase exponencial a 25 mL de medio LB modificado 2x en un tubo centrífugo de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea. NOTA: La tasa de inoculación se ajustó para ser consistente con el protocolo de cribado de microarrays descrito en 4.1.</li>
		<li>Añadir 75 μL de la suspensión celular en cada pozo de la placa de medio área 96 pozos que contiene 2x soluciones de osmolito.</li>
		<li>Incubar la placa en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de placas de ensayo persistentes<ol>
<li>Preparar 25 mL de medio LB modificado que contenga 5 μg/mL de OFX en un tubo centrífugo de 50 mL y transferir este medio a un depósito estéril.</li>
		<li>Transferir 190 μL de medio LB modificado con OFX desde el depósito a cada pozo de una placa genérica de fondo plano de 96 pozos (placa de ensayo persistente) utilizando una pipeta multicanal.</li>
		<li>Retire el microarray de la coctelera (después de cultivar durante 24 h) y transfiera 10 μL de cultivos celulares del microarray a los pozos de la placa de ensayo persistente, que contiene el medio LB modificado con OFX.</li>
		<li>Tome 10 μL de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 μL de solución de PBS utilizando una placa de 96 pozos de fondo redondo y una pipeta multicanal.</li>
		<li>Después de la dilución en serie, detecte 10 μL de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco sin antibióticos utilizando una pipeta multicanal.</li>
		<li>Incubar la placa de ensayo persistente (preparada en el paso 4.3.3) en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 6 h después de cubrir la placa con una membrana de sellado permeable al gas.</li>
		<li>Después de la incubación de 6 h en una coctelera, saque la placa de ensayo persistente y repita los pasos 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Incubar las placas de agar durante 16 h a 37 °C, y luego contar las UFC. Los niveles de UFC antes y 6 h después del tratamiento antibiótico permiten calcular la fracción persistente en cada pozo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos y sobre la viabilidad de E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validación de las condiciones identificadas
<ol><li>Transferir 250 μL de las células de fase exponencial del paso 2,3 a 25 mL de medio LB fresco modificado que contiene el osmlito identificado a partir del cribado de microarrays (ver Protocolo 4).</li>
	<li>Incubar el matraz en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C durante 24 h.</li>
	<li>Después de 24 h, retire el matraz de la coctelera y transfiera 250 μL del cultivo celular a 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml.</li>
	<li>Añadir 25 μL de solución madre de OFX (5 mg/mL) en la suspensión celular y agitar suavemente el matraz para que el cultivo ensay sea homogéneo. Incubar el matraz en una coctelera a 37 °C y 250 rpm.</li>
	<li>En cada hora durante el tratamiento, transfiera 1 mL del cultivo de ensayo desde el matraz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrífuga el cultivo de ensayo en el tubo de microcentrífuga a 17.000 x g durante 3 min.</li>
	<li>Retire 950 μL de sobrenadante y agregue 950 μL de PBS.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado 5.6 y 5.7 para 3x.</li>
	<li>Después del lavado final, resuspend el pellet celular en 100 μL de solución de PBS.</li>
	<li>Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya en serie 6x en 90 μL de solución de PBS usando una placa inferior redonda de 96 pozos.</li>
	<li>Detecte 10 μL de las suspensiones de células diluidas en una placa de agar fresco libre de antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 μL restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco.</li>
	<li>Incubar la placa de agar a 37 °C durante 16 h, y luego contar las UFC.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo persistente de alto rendimiento descrito aquí se desarrolló para dilucidar los efectos de varios productos químicos sobre la persistencia de E. coli. Además de las placas PM comerciales, los microarrays se pueden construir manualmente como se describe en el paso 4.2. Además, el protocolo presentado aquí es flexible y se puede utilizar para examinar otros microarrays, como paneles de medicamentos y bibliotecas celulares, que están en formatos de placa de 96 pozos. Las condiciones experimentales, incluid...

Los cultivos bacterianos contienen una pequeña subpoblación de células persistentes que son temporalmente tolerantes a niveles inusualmente altos de antibióticos. Las células persistentes son genéticamente idénticas a sus parientes sensibles a los antibióticos, y su supervivencia se ha atribuido a la inhibición transitoria del crecimiento1. Las células persistentes fueron descubiertas por primera vez por Gladys Hobby2, pero el término fue utilizado por primera vez por Joseph Bigger cuando las identificó en cultivos de Staphylococcus pyogenes tratados con penicilina3. Un estudio seminal publicado por Balaban et al.4 descubrió dos tipos persistentes: variantes de tipo I que se forman principalmente por paso a través de la fase estacionaria, y variantes de tipo II que se generan continuamente durante el crecimiento exponencial. Los persistentes son detectados por ensayos clonogénicos de supervivencia, en los que se toman muestras de cultivo a varios intervalos durante los tratamientos con antibióticos, se lavan y se platean en un medio de crecimiento típico para contar las células sobrevivientes que pueden colonizarse en ausencia de antibióticos. La existencia de persistientes en un cultivo celular se evalúa mediante una curva de muerte bifásica4,5 donde la desintegración exponencial inicial indica la muerte de células sensibles a los antibióticos. Sin embargo, la tendencia a matar disminuye con el tiempo, lo que eventualmente conduce a una región de meseta que representa las células persistentes sobrevivientes.
Las células persistentes se han asociado con diversas enfermedades como la tuberculosis6,la fibrosis quística7,la candidiasis8 y las infecciones del tracto urinario9. Se encontró que casi todos los microorganismos analizados hasta el momento generan fenotipos persistentes, incluyendo Mycobacterium tuberculosis6altamente patógena, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 y Candida albicans8. Estudios recientes también proporcionan evidencia del aumento de mutantes multirresistentes de subpoblaciones persistentes11,12. Los esfuerzos sustanciales en esta esfera han revelado que los mecanismos de persistencia son muy complejos y diversos; Se sabe que tanto los factores estocásticos como los deterministas asociados con la respuesta SOS13,14,las especies reactivas de oxígeno (ROS)15,los sistemas toxina/antitoxina (TA)16,la autofagia o autogestión17 y la respuesta rigurosa relacionada con ppGpp18 son conocidos por facilitar la formación de persistidores.
A pesar del progreso significativo en la comprensión del fenotipo de persistencia, los efectos de los osmolitos sobre la persistencia bacteriana no se han entendido completamente. Dado que el mantenimiento de la presión osmótica óptima es una necesidad para el crecimiento, el funcionamiento adecuado y la supervivencia de las células, un estudio en profundidad de los osmolitos podría conducir a posibles objetivos para las estrategias anti-persistentes. Aunque laborioso, la detección de alto rendimiento es un enfoque muy eficaz para identificar metabolitos y otras sustancias químicas que desempeñan un papel crucial en el fenotipo de persistencia19,20. En este trabajo, discutiremos nuestro método publicado19,donde hemos utilizado microarrays, es decir, 96 placas de pozo que contienen varios osmolitos (por ejemplo, cloruro de sodio, urea, nitrito de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio), para identificar osmolitos que influyen significativamente en la persistencia de E. coli.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ensayo de 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de E. coli MG1655</td><td>Universidad</td><td></td><td>de Princeton Obtenido del laboratorio Brynildsen</td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de sellado permeable al gas</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Esterilizada por irradiación gamma y libre de citotoxinas</td></tr><tr><td>Media área placa de 96 pocillos de fondo plano</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Grado de genética molecular</td></tr><tr><td>Sal de ofloxacino</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge; 97.5</td></tr><tr><td>Microarray fenotipo (PM-9 y PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td> Las <td>placas PM-9 y PM-10 contenían varios osmolitos y tampones respectivamente</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de fondo redondo</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Grado ACS Certificado ACS</td></tr><tr><td>Nitrato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>ACS grado reactivo</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>98% de pureza</td></tr><tr><td>Placa de Petri cuadrada</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Grado de genética molecular</td></tr><tr><td>Lector de microplacas multimodo Varioskan lux</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Se utiliza para la medición de la densidad óptica a 600 nm</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Grado de genética molecular</td></tr></tbody></table>

detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Los persistentes bacterianos se definen como una pequeña subpoblación de variantes fenotípicas con la capacidad de tolerar altas concentraciones de antibióticos. Son un problema de salud importante, ya que se han asociado con infecciones crónicas recurrentes. Aunque se sabe que la dinámica estocástica y determinista de los mecanismos relacionados con el estrés juega un papel significativo en la persistencia, los mecanismos subyacentes al cambio fenotípico hacia / desde el estado de persistencia no se entienden completamente. Si bien los factores de persistencia desencadenados por las señales ambientales (por ejemplo, el agotamiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno) han sido ampliamente estudiados, los impactos de los osmolitos en la persistencia aún no se han determinado. Utilizando microarrays (es decir, 96 placas de pozo que contienen diversos productos químicos), hemos diseñado un enfoque para dilucidar los efectos de varios osmolitos en la persistencia de Escherichia coli de una manera de alto rendimiento. Este enfoque es transformador, ya que se puede adaptar fácilmente para otras matrices de cribado, como paneles de medicamentos y bibliotecas de eliminación de genes.

La Figura 1 describe nuestro protocolo experimental. Los experimentos del ciclo de dilución/crecimiento (ver Protocolo 2) fueron adaptados de un estudio realizado por Keren et al.5 para eliminar los persistidores originarios de los cultivos nocturnos. La Figura 2A es una imagen representativa de las placas de agar utilizadas para determinar los niveles de UFC de los cultivos celulares antes y después del tratamiento con OFX. En estos expe...

En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

El protocolo descrito aquí permite identificar las condiciones que pueden afectar significativamente la persistencia bacteriana de una manera de alto rendimiento. Este método es fácilmente adaptable a la detección de varias áreas, tales como paneles de medicamentos, bibliotecas de genes y más. Como el método incluye varios pasos secundarios, que deben llevarse a cabo simultáneamente, la demostración visual puede ayudar a los investigadores a administrar su tiempo para obtener resultados precisos.Comience por preparar cultivos celulares de microarrays. Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un tubo centrífuga de 50 mililitros. Luego mezcle suavemente la suspensión celular para que sea homogénea.Transfiera la suspensión de celda diluida a un depósito estéril de 50 mililitros. Usando una pipeta multicanal, transfiera 150 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de microarray que contenga varios productos químicos. Los microarrays también se pueden generar manualmente siguiendo el método descrito en el manuscrito del texto.Cubra la placa de microarrays con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante 24 horas. Para hacer placas de ensayo persistentes, prepare 25 mililitros de medio LB modificado que contenga cinco microgramos por mililitro de Ofloxacina en un tubo centrífugo de 50 mililitros y transfiera este medio a un depósito estéril. Transfiera 190 microlitros del medio LB modificado a cada pozo de una placa genérica de fondo plano de 96 pozos.Después de la incubación de 24 horas, retire el microarray de la coctelera y transfiera 10 microlitros de cultivos celulares del microarray a los pozos de la placa de ensayo persistente que contiene el medio LB modificado con Ofloxacina. Tome 10 microlitros de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 microlitros de solución PBS usando una placa redonda inferior de 96 pozos y una pipeta multicanal. A continuación, detecte 10 microlitros de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco libres de antibióticos.Cubra la placa de ensayo persistente con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante seis horas. Después de la incubación de seis horas, repita la dilución en serie y la manchado en placas de agar. Incubar las placas de agar durante 16 horas a 37 grados centígrados.A continuación, cuente las unidades formantes de colonias o UFC. Utilice los niveles de UFC antes y seis horas después del tratamiento antibiótico para calcular la fracción persistente en cada pozo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos sobre la viabilidad de e coli.Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado que contiene la osmolita identificada a partir del cribado de microarrays. Incubar el matraz en una coctelera orbital a 250 RPM y 37 grados Centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el matraz de la coctelera y transfiera 250 microlitros del cultivo celular a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 mililitros.Añadir 25 microlitros de solución madre de Ofloxacina a la suspensión celular y agitar el matraz suavemente para que el cultivo ensayado sea homogéneo. Incubar el matraz en una coctelera a 37 grados centígrados y 250 RPM. A cada hora durante el tratamiento, incluido un punto de tiempo antes de la adición de Ofloxacina, transfiera un mililitro del cultivo de ensayo del matraz a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y centrífugalo a 17,000 veces G durante tres minutos.Retire 950 microlitros de sobrenadante y lave las células tres veces con 950 microlitros de PBS. Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet celular en 100 microlitros de solución de PBS. Tome 10 microlitros de la suspensión celular y diluya en serie seis veces con 90 microlitros de PBS dentro de una placa inferior redonda de 96 pozos.Detecte 10 microlitros de las suspensiones de células diluidas en una placa de agar libre de antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 microlitros restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco. Incubar las placas a 37 grados Centígrados durante 16 horas, luego contar las UFC.Una imagen representativa de las placas de agar usadas para determinar niveles de CFU de cultivos celulares antes y después del tratamiento de OFX se muestra aquí. La primera columna es el grupo de control. La segunda columna tiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 100 milimolares y la tercera columna contiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 60 milimolares.Para simplificar, sólo dos osmolitos se centran en aquí. Aquí se muestra una representación gráfica de los datos de la UFC de las placas y fracciones persistentes de los cultivos celulares probados en 96 placas de pozos. Para calcular las fracciones, las cuentas persistentes fueron normalizadas a las cuentas de célula obtenidas antes del tratamiento antibiótico.Para generar curvas de muerte porfásicas, las células se cultivaron en 25 mililitros de medio LB modificado con los osmolitos indicados y frascos desconcertados durante 24 horas, luego se transfirieron a frascos de ensayo persistentes para la enumeración persistente. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la detección de las células en la placa de agar es intensiva en mano de obra y requiere enfoque. Un error durante el paso puede conducir a la contaminación cruzada entre las condiciones que se están probando.Por lo tanto, es importante practicar la detección de múltiples muestras simultáneamente antes del experimento. Siguiendo este protocolo, los paneles de fármacos y las bibliotecas de células mutantes pueden ser examinados para estudiar los impactos en la persistencia. Con esta investigación, hemos identificado un número de osmolitos y de condiciones del PS que tengan un impacto significativo en persistencia bacteriana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Venkateswaran, S., et al. Identificación de alto rendimiento de polímeros repelentes de bacterias para dispositivos médicos. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra un método de alto rendimiento para identificar polímeros repelentes de bacterias utilizando un portaobjetos de microarrays expuesto a cultivos bacterianos mixtos. La unión bacteriana se evalúa mediante fluorescencia DAPI, donde la señal reducida indica polímeros con una unión superficial mínima.

Identificación de alto rendimiento de polímeros repelentes de bacterias mediante cribado de microarrays

En este video, demostramos un método para evaluar el efecto de los osmolitos en la formación de persistentes bacterianos. Las células bacterianas se exponen primero a los osmolitos para inducir estrés osmótico, lo que desencadena la formación de persistentes, y luego se tratan con antibióticos para enumerar los persistentes.

Ensayo de persistencia in vitro: un método para evaluar el efecto de los osmolitos sobre la persistencia bacteriana

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

En este artículo se describe el ensayo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para examinar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas por su potencial capacidad para manipular los niveles celulares de cíclico di-GMP en Pseudomonas aeruginosa, que proporciona una nueva y poderosa herramienta para el descubrimiento de fármacos antibacterianos y ensayar los compuestos.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.

Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas

La persistencia de antibióticos describe la capacidad de pequeñas subpoblaciones dentro de una población isogénica sensible para tolerar transitoriamente altas dosis de antibióticos bactericidas. El presente protocolo combina enfoques para caracterizar el fenotipo de persistencia antibiótica a nivel molecular y celular después de exponer a Escherichia coli a dosis letales de ofloxacino.

Análisis poblacional y unicelular de la persistencia antibiótica en Escherichia coli

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aprenda a realizar un cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos que afectan la persistencia bacteriana en E. coli. Este protocolo adaptable facilita la evaluación de paneles de fármacos y bibliotecas genéticas.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

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