Name: Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a generar organoides epiteliales mucociliares a partir de células de ectodermo profundo de embriones de Xenopus laevis en 24 horas. Este protocolo permite el seguimiento en vivo de transiciones celulares mediante microscopía confocal.

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Agradecemos a los miembros de Kim Lab y Lance Davidson por sus comentarios y apoyo. Este trabajo fue apoyado por la Beca De Científicos Jóvenes a HYK del Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R0250Y1).

El uso animal y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) del Instituto de Ciencia Básica (IBS 18-01) y el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KA2017-22).
1. Embriones
<ol><li>Obtener X. laevis embriones mediante un procedimiento estándar: recoger manualmente los huevos de las ranas hembra estimuladas y realizar la fertilización in vitro18,19.</li>
	<li>De-jelly los embriones fertilizados con agitación suave durante aproximadamente 5 min en 2% de cisteína en 1/3x modificado solución salina de Barth (MBS; ver la receta para 1X MBS más abajo) a pH 819.</li>
	<li>Paso opcional para la imagen en vivo: para etiquetar fluorescentemente proteínas específicas y observar su dinámica en el organoide, proceda a la sección 5.</li>
	<li>(Opcional) Para controlar la contaminación de células superficiales de ectodermo dentro de organoides, etiquete la superficie apical de los embriones con NHS-rhodamine en la etapa 914. Incubar embriones en 1 mg/ml de NHS-Rhodamine en 1/3x MBS (pH 9.0) durante 30 min con una forma de nuez suave. Lave los embriones tres veces transfiriendo a un plato de Petri lleno de 1/3x MBS durante 15 min.</li>
	<li>Esca cultivo del embrión en 1/3x MBS a la temperatura preferida (14-26 oC) hasta que se detecten los primeros signos de la etapa 10 (es decir, la aparición de células pigmentadas oscuras alrededor del blastoore a la vista vegetal).</li>
</ol>2. Preparación de herramientas, soluciones y recipientes de cultivo microquirúrgicos
<ol><li>Preparar las herramientas necesarias incluyendo un par de fórceps de grado quirúrgico y herramientas para el cabello (lazo de pelo y cuchillo de pelo) para la microcirugía20.</li>
	<li>Preparar los siguientes medios de cultivo para embriones: 1/3X MBS, donde se realiza 1X MBS con NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), MgSO4 (0,82 mM), Ca(NO3)2 (0,33 mM), CaCl2 (0,41 mM) y HEPES (10 mM). Ajuste el pH a 7.4 con 10 M NaOH. NOTA: Opcional: añadir gotas de rojo fenol para indicar el pH.</li>
	<li>Preparar los siguientes medios de cultivo para los tejidos embrionarios y organoides: Danilchik's para Amy (DFA)21 complementado con 1% fresco de antibióticos y solución antimicótica. Preparar DFA con NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), gluconato de potasio (4,5 mM), gluconato de sodio (32 mM), CaCl2 (1 mM) y MgSO4 (1 mM). Ajuste el pH a 8.3 con Bicine granular. Filtrar DFA (filtro de botella de 0,2 m), alicuar y almacenarlo a -20 oC.</li>
	<li>Preparar DFA libre de calcio y magnesio para separar las células profundas del ectodermo utilizando la receta anterior y omitiendo CaCl2 y MgSO4. Aliquot y almacenar a-20oC.</li>
	<li>Preparar tubos PCR no adhesivos para la agregación celular embrionaria.<ol>
<li>Para inducir la agregación espontánea de las células embrionarias aisladas, prepare tubos de PCR no adhesivos recubriendo tubos de PCR de fondo redondo con 200 l de 1% de BSA (1 g de BSA en 100 ml de agua destilada) durante la noche a 4 oC o durante 2 h a temperatura ambiente. Cada tubo se utilizará para ensamblar un organoide.</li>
		<li>Enjuague los tubos de PCR recubiertos con BSA con DFA tres veces para eliminar cualquier BSA residual.</li>
		<li>Llene los tubos de PCR con 200 ml de DFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Aislamiento de células de ectodermo profundo
<ol><li>Seleccione y recoja embriones a medida que alcanzan la etapa temprana 10 utilizando herramientas para el cabello bajo un estereoscopio.</li>
	<li>Con una pipeta de transferencia desechable, transfiera los embriones seleccionados a un plato Petri lleno de DFA.</li>
	<li>Retire la membrana vitellina de los embriones utilizando fórceps afilados del lado vegetal sin interrumpir el lado animal del embrión. NOTA: Tenga cuidado de no exponer embriones al aire. Introducir burbujas de aire en la solución o llevar embriones a la superficie hará que el embrión estalle.</li>
	<li>Para aislar la tapa del animal, coloque el lado animal del embrión hacia arriba.</li>
	<li>Estimar visualmente la extensión de la tapa del animal que se extirpa y hacer la primera incisión a lo largo del borde de la tapa del animal con un cuchillo para el cabello. Tire del cuchillo de pelo hacia afuera para hacer un corte.</li>
	<li>Repita el paso 3.5 para crear una cadena de pequeños cortes para extirpar la tapa del animal.</li>
	<li>Recortar el borde de capa gruesa de la tapa del animal utilizando un cuchillo para el pelo para evitar la inclusión de precursores de mesodermo. NOTA: Para evitar la curación y agregación de tapas de animales aislados, proceda al siguiente paso dentro de 10 min. Típicamente, aislamos de 5 a 10 tapas de animales a la vez para ensamblar múltiples organoides.</li>
	<li>Para separar las células profundas del ectodermo de la tapa del animal, transfiera las tapas de los animales extirpadas a un plato de Petri lleno de DFA libre de calcio y magnesio con una pipeta de transferencia desechable. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante la transferencia.</li>
	<li>Para mantener suficiente espacio para los siguientes pasos, utilizando las herramientas para el cabello, coloque las tapas de los animales para mirar hacia arriba y mantener una distancia generosa de otros explantes.</li>
	<li>Espere de 5 a 10 minutos y luego monitoree los explantes debajo de un estereoscopio. Una vez que las células profundas aflojadas se han encontrado desde el borde de la capa superficial pigmentada oscura, comienza a levantar la capa superficial lejos de las células de ectodermo profundo de color claro usando un cuchillo para el cabello debajo del estetoscopio.</li>
	<li>Separe con cuidado (despegue) la capa superficial con un cuchillo para el cabello, comenzando en el borde.</li>
	<li>Recoger las células de ectodermo profundo con aspiración mínima (10-u201215-L) para limitar la cantidad de DFA libre de calcio y magnesio que se transfiere al medio de agregación en el siguiente paso. NOTA: Las células superficiales separadas se pueden eliminar del medio para evitar contaminar las células de ectodermo profundas restantes.</li>
</ol>4. Generación de organoides epiteliales mucociliarios
<ol><li>Transfiera las células de ectodermo profundo recogidas a un tubo de PCR no adhesivo que contenga 200 l de DFA. Pipetee suavemente el soporte (2-u20123 veces) para dispersar las células transferidas en el tubo PCR. NOTA: El tiempo designado como horas después de la agregación (hpa) comienza en este paso. El tamaño de los organoides resultantes se controla por el número de células de ectodermo profundo añadidas a un tubo pcR. Se pueden utilizar células de ectodermo profundo de una o más tapas de animales, dependiendo del tamaño deseado del organoide.</li>
	<li>Cierre el tubo PCR. Mantenga los tubos de PCR en posición vertical para inducir la agregación espontánea en la parte inferior.</li>
	<li>Supervise el proceso de agregación bajo un estereoscopio. Las células normalmente se reúnen en la parte inferior del tubo de PCR dentro de una hora y se ensamblan en agregados esféricos dentro de 2-3 h, dependiendo del tamaño.</li>
	<li>Para realizar imágenes en vivo o pruebas de drogas durante el desarrollo de los organoides epiteliales mucociliares, recoja los agregados a 2 hpa utilizando una pipeta de 200 l equipada con puntas agrandadas (cortada con tijera esterilizada) para evitar causar daños en los agregados durante la recolección.</li>
	<li>Para permitir que los agregados se conviertan en el organoide epitelial mucociliar en el cultivo, recoja agregados esféricos del tubo pcR a 5 hpa y transfieralos a un plato Petri lleno de DFA.</li>
	<li>Coloque los agregados lejos de otros para evitar que se fusione. Dentro de las 24 horas de cultivo a temperatura ambiente sin ningún factor añadido, se puede observar que los organoides epiteliales mucociliares maduros giran con la acción de batir cilios que cubren la superficie del epitelio diferenciado</li>
</ol>5. (Opcional) Imágenes en vivo de alta resolución de organoides en desarrollo
<ol><li>Preparar el ARNm para la microinyección.<ol>
<li>Para visualizar la epitelialización que se produce en la etapa inicial de la formación de organoides, prepare el ARNm para la proteína de zonula ocludens específica del epitelial-1 (ZO-1) y para esbozar las membranas celulares amplificando los plásmidos pCS2-ZO1-RFP y pCS2-mem-GFP (un regalo de Lance Davidson).</li>
		<li>Extraer y linealizar el ADN plásmido, y luego transcribir el ARNm tapado utilizando un kit de transcripción in vitro SP6/T7.</li>
		<li>Aliquot el ARNm transcrito y almacenarlo a -80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microinyectar el ARNm en un embrión fertilizado<ol>
<li>Coloque embriones fertilizados en 3% Ficoll en 1x MBS.</li>
		<li>Cargue de 3 a 4 ml de ARNm utilizando una punta de micro-cargador en una aguja de vidrio tirado (una punta de aguja cónica larga y fina con un diámetro interior de 10 u201230 m).</li>
		<li>Fije la aguja a un microinyector y ajuste el tiempo y la presión para entregar un volumen constante de ARNm para la microinyección.</li>
		<li>Inyectar el ARNm justo debajo de la superficie apical del polo animal. Un parche circular distintivo de color pálido que es causado por la expansión de la corteza es visible en el momento de la microinyección.</li>
		<li>Transfiera los embriones inyectados a 1/3X MBS y escúlelos a la etapa 9.5.</li>
		<li>Recoger los embriones con etiqueta fluorescente bajo un estereoscopio de fluorescencia (ajustes de excitación/emisión para GFP (488/510) y RFP (532/588)).</li>
		<li>Continúe con el paso 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensamblar y cultivar el organoide (secciones 3 y 4) hasta la etapa deseada de desarrollo.</li>
	<li>Realice imágenes en vivo.<ol>
<li>Prepare una cámara de imágenes con fondo de vidrio pegando un vidrio de cubierta a una cámara de acrílico fresada a medida con grasa de silicio. NOTA: Selle firmemente la cámara para evitar fugas de los medios de cultivo.</li>
		<li>Llene la cámara de imágenes con DFA.</li>
		<li>Escoja una rejilla de microscopía electrónica de transmisión hexagonal (TEM) (75 mallas) de un recipiente utilizando fórceps y aplique una pequeña cantidad de grasa al borde de la rejilla. NOTA: El tamaño de la malla debe ser menor que el diámetro del agregado para que el agregado se site en la cuadrícula.</li>
		<li>Presione ligeramente hacia abajo para fijar la rejilla TEM a la parte inferior de la cámara de imágenes.</li>
		<li>Transfiera los agregados a la cámara de imágenes y colóquelos dentro de la cuadrícula. NOTA: Evite colocar los agregados junto a la grasa. A lo largo del experimento, los agregados deben sentarse en la rejilla TEM sin tener en contacto con la parte inferior de la cámara para evitar la compresión física.</li>
		<li>Llene la cámara de imágenes con DFA y ciélela con un vaso de cubierta y grasa. NOTA: La cámara debe ser hermética sin burbujas de aire para evitar cualquier turbulencia o movimiento durante la toma de imágenes.</li>
		<li>Para seguir la progresión de la formación de organoides epiteliales mucociliares, recopile imágenes de lapso de tiempo z-stack de agregados (de 2 hpa) utilizando un microscopio confocal. NOTA: Normalmente recopilamos pilas z de 120 m de grosor cada 15 minutos usando un objetivo 20X para seguir los comportamientos dinámicos de las celdas, pero estas especificaciones deben optimizarse para el objetivo de los experimentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (Opcional) Creación de imágenes en el desarrollo de organoides por fijación e inmunosumanidad
<ol><li>Corrija los organoides en la etapa deseada de desarrollo transfiriéndolos a un vial de vidrio lleno de una solución fijativa. NOTA: Agregue un volumen de solución fijativa que sea >20 veces el de las muestras para garantizar una fijación completa. Realice los siguientes procesos en un nutator a menos que se indique lo contrario. En general, los organoides se fijan con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS. Sin embargo, pueden ser necesarios diferentes fijadores para detectar proteínas específicas. Por ejemplo, utilizamos 4% PFA con 0.25% de glutaraldehído en PBS para detectar F-actina y tubulina acetilada. Para detectar la intelectina (ITLN) y el ZO-1, los organoides se fijan con la solución de Dent helada (4:1 metanol:dimetil sulfóxido) durante la noche a -20 oC. Los organoides fijos de Dent deben deshidratarse en serie antes del lavado (paso 6.3). La duración de la incubación y el lavado de anticuerpos se puede optimizar para necesidades específicas.</li>
	<li>Fijar organoides durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4 oC.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBST (PBS con 0.1% Tritón X-100) durante 15 min en RT.</li>
	<li>Bloquear la unión inespecífica con 10% de suero de cabra en PBST (PBSGT) durante 1 h en RT.</li>
	<li>Incubar con anticuerpo primario (1:200) en PBSGT durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBST durante 15 minutos en RT.</li>
	<li>Incubar con anticuerpos secundarios (1:200) en PBSGT durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBST durante 15 minutos en RT.</li>
	<li>Transfiera los organoides fijos e inmunosutendos a una cámara de imágenes y proceda con imágenes confocales.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los organoides epiteliales mucociliares generados a partir de células de ectodermo profundos de X. laevis embryo son una poderosa herramienta para estudiar la epitelización y diferenciación de los progenitores multipotentes in vitro. En contraste con el ensayo de tapa animal ampliamente adoptado16 utilizado para la organogénesis in vitro13 y el desarrollo de la epitelia mucociliar15,17,22 que utilizan el ectodermo intacto, los organoides derivados del ectodermo profundo presentados en este protocolo ofrecen una oportunidad distinta para monitorear las fases impulsadas por la regeneración de la mecánica tisular de la superficie epitelio14. Con alrededor de 2 hpa, las células epiteliales positivas ZO-1 recién generadas (Figura 2) comienzan a aparecer en la superficie apical de organoides y aumentan su población para cubrir todo el organoide a medida que el tejido solidifica o reduce el cumplimiento14. La regeneración del epitelio y las especificaciones de linaje subsiguientes para las células de copa productoras de moco proceden espontáneamente en un medio de cultivo definido químicamente en un día. Estos organoides epiteliales mucociliares de rápido desarrollo proporcionan una plataforma para examinar los comportamientos celulares dinámicos en tiempo real, en alta resolución, durante los pasos progresivos de la regeneración epitelial. También permiten la investigación de las cuestiones fundamentales que surgen durante el desarrollo del epitelio mucociliario, la homeostasis y las enfermedades asociadas2,9,23. En particular, la sensibilidad mecánica de las células progenitoras profundas durante la transición a precursores de células de copa epiteliales identificados en los organoides14 puede servir para vincular enfermedades respiratorias asociadas con la diferenciación basal anormal cuando las células de la copa secretoras de moco son sobre o infraproducentes23.
Si bien este protocolo ofrece un enfoque simple para generar estos organoides, hay varios pasos críticos para el éxito en los experimentos. Para evitar la contaminación de las células epiteliales superficiales durante el aislamiento de células de ectodermo profundo de la tapa del animal, se debe controlar la tapa del animal colocada en DFA libre de calcio y magnesio bajo un estereoscopio y detectar el momento adecuado para iniciar la separación de la capa superficial pigmentada oscura de la tapa del animal. Si el tejido se mantiene en DFA libre de calcio y magnesio durante demasiado tiempo, todo el tejido se disociará y distinguirá entre células profundas y superficiales sería imposible para los agregados de ectodermo profundos. Para confirmar la ausencia de células superficiales en agregados de ectoderm profundos, se recomienda etiquetar fluorescentemente la superficie apical del embrión con NHS-rhodamine (paso1.4 14) antes de la microcirugía; esto permitiría una fácil identificación de las células superficiales si existen en los organoides resultantes. Dado que la regeneración epitelial está regulada por la mecánica de tejidos14,es esencial evitar la generación involuntaria de fuerzas para organoides autoorganizantes. En particular, sugerimos evitar el contacto con la parte inferior del vidrio de la cámara de imágenes durante la toma de imágenes en vivo mediante la colocación de agregados en los bordes de las rejillas TEM, ya que esto permite el contacto libre con la ventana de imágenes de agregados en vivo (paso 5.1.2.). Este modelo 3D in vitro-cultivado y autoorganizado para el epitelio mucociliar servirá como una herramienta manejable para responder a las preguntas fundamentales que surgen durante la regeneración del epitelio y la especificación de linaje de las células de la copa.

Las lesiones, infecciones y enfermedades del epitelio mucociliar se asocian con una producción y un aclaramiento deteriorados de moco que a menudo se encuentra en trastornos pulmonares como enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, fibrosis quística, bronquiectasia y discinesia ciliar primaria1,2,3,4. Un avance reciente en la tecnología organoides, por ejemplo, el organoide pulmonar derivado de células basales llamado traqueosfera que recapitula la regeneración del epitelio mucociliar surge como un modelo prometedor con potencial terapéutico1,5,6. Sin embargo, su uso es actualmente limitado, en parte debido a la falta de las condiciones de cultivo definidas y baja eficiencia en las producciones organoides. El epitelio mucociliar en las vías respiratorias humanas y la epidermis de rana son notablemente similares en morfología tisular, composición celular, y su función7,8,9,10,11,12. En ambos organismos, el epitelio mucociliar proporciona defensa de primera línea mediante el secretamiento de la mucosidad y sustancias antimicrobianas y elimina las partículas y patógenos nocivos a través de la acción sincronizada de los cilios.
Aquí, describimos un protocolo simple para generar organoides epiteliales mucociliares utilizando los progenitores multipotentes de los embriones Xenopus laevis 13,14. Anteriormente, informamos14 que en ausencia de factores de crecimiento exógenos y la matriz extracelular, las células profundas microquirúrgicamente aisladas de la etapa de gastrula temprana ectodermo se ensamblan espontáneamente en agregados, regeneran epitelio en su superficie y maduran en epitelio mucociliar mediante la intercalación de células multiciliadas y otras células accesorias dentro de 24 h. Además del rápido desarrollo, este protocolo ofrece una oportunidad distinta para acceder directamente a las transiciones de células de ectodermo profundo multipotentes en progenitores de células de copa epiteliales que recapitulan los pasos de regeneración de un epitelio alterado14 que no están disponibles a partir de embriones intactos y ectodermo (también conocido como la tapa del animal)15,16,17. El número y el tamaño de los organoides producidos son escalables con alta eficiencia mediante el control de los materiales de partida de los embriones Xenopus. Los organoides en el cultivo flotante se pueden clasificar y transferir fácilmente en la etapa deseada para análisis adicionales, incluyendo imágenes de alta resolución, pruebas mecánicas, tratamiento farmacológico y caracterización genética14. Esta regeneración espontánea impulsada por la mecánica tisular del epitelio en la superficie de los agregados de células embrionarias da como resultado organoides epiteliales mucociliares y proporciona un nuevo modelo tridimensional (3D) para estudiar la biología del epitelio mucociliar.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas de vidrio de doble etapa</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector de picolitro</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>láser confocal</tr><tr><td>Estereoscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Referencia de cuchillo</td><td></td> para el cabello <td>(Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td>Referencia de bucle</td><td></td> para el cabello <td>(Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><inyección >hCG fuerte</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina coriónica humana</td><td>fuerte Sigma</td><td>cg10-10vl</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><solución fuerte>MBS</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10M Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Rojo fenol</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Grado reactivo de hidróxido de sodio, 97%, polvo-25 g</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><solución > desactivación fuerte</clorhidrato ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>Sodio hidróxido 10M</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>solución Ficoll</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>solución DFA</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,22 mm</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Solución Antibiótica Antimicótica Sigma</td><td></td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma</td><td>B3876</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de potasio</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>222321</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de sodio</td><td>Sigma</td><td>G9005</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNA in vitro transcripción</td>SP6/T7 kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>transcripción in vitro</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNA microinyección</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio de borosilicato Harvard</td><td>Apparatus</td><td>GC100-10</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de microcargador Eppendorf</td><td>ThermoFisher</td><td>A25547</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>recubrimiento de tubo PCR</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermofisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>tubos de PCR</td><td>SSI SSI</td><td>SSI-3245-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td>Fresado <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>a medida</tr> Cámara de vidrio <tr><td>Coverglass 24mmX50mm</td><td>Duran</td><td>B01_001650</td><td></td></tr><tr><td>SPI Rejillas TEM hexagonales, Níquel dorado (50mesh)</td><td>SPI</td><td>275HGN-XA</td><td></td></tr><tr><td>SPI Rejillas TEM hexagonales, Níquel dorado (75mesh)</td><td>SPI</td><td>2775GN-XA Grasa de silicona</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shinetsu</td><td>HIVAC-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20ml frasco con tapón de rosca</td><td>Wheaton</td><td>WH.986580</td><td></td></tr><tr>Frasco <td></td><td></td><td></td><td>de 2 ml con tapón de rosca</td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Sigma</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de bencilo</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sgima</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 10% EM</td><td>GRADE Microscopía electrónica Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Paraforlamdehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>LPS CBP007B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpo primario (1:200)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubulina acetilada</td> clon <td>de Sigma</td><td>6-11B-1</td><td></td></tr><tr><td>ITLN1 Proteintech</td><td></td><td>11770-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Queratina</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>1h5</td><td></td></tr><tr><td>ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS2-mem-GFP</td><td></td><td>Regalo del Dr. Lance Davidson</td><td></td></tr><tr><td>pCS2-ZO1-RFP</td><td></td><td>Regalo del Dr. Lance Davidson</td><td></td></tr></tbody></table>

organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

El epitelio mucociliar proporciona la primera línea de defensa mediante la eliminación de partículas extrañas a través de la acción de la producción de moco y el aclaramiento mediado por cilios. Muchos defectos clínicamente relevantes en el epitelio mucociliar se infieren ya que ocurren en lo profundo del cuerpo. Aquí, presentamos un modelo 3D manejable para el epitelio mucociliar generado a partir de progenitores multipotentes que fueron microsurmente aislados de embriones Xenopus laevis. Los organoides epiteliales mucociliares están cubiertos con epitelio recién generado de células de ectodermo profundo y más tarde decorados con células multiciliadas con patrones distintos, células secretoras y células de copa que producen moco que son indistinguibles de la epidermis nativa dentro de las 24 h. Las secuencias completas de transiciones celulares dinámicas de mesenquimal a epitelial que emergen en la superficie apical de organoides pueden ser rastreadas por imágenes en vivo de alta resolución. Estos organoides epiteliales mucociliares y autoorganizantes in vitro ofrecen ventajas distintas en el estudio de la biología del epitelio mucociliar con alta eficiencia en la generación, condiciones de cultivo definidas, control sobre el número y tamaño, y acceso directo a imágenes en vivo durante la regeneración del epitelio diferenciado.

Este protocolo estandarizado genera un organoide epitelial mucociliar a partir de progenitores multipotentes aislados de la etapa temprana de gastrula X. laevis embriones dentro de 24 h de cultivo14. Recolectó células de ectodermo profundo autoensambladas para formar un agregado en un tubo de PCR no adhesivo y someterse a la epitelización de la superficie y diferenciación de células de copa. La superficie epitelializada recientemente de los agregados proporciona un sustrato similar al epitelio nativo que se encuentra in vivo para intercalar células internas (por ejemplo, células multiciliadas y otras células accesorias) y se desarrolla para formar organoides epiteliales mucociliares(Figura 1A,B). Dentro de las 24 horas después de la agregación, los organoides epiteliales mucociliar autoorganizados regeneran una epidermis madura que es indistinguible de la epidermis de un renacuajo. Los organoides comprenden epitelio totalmente diferenciado (queratina), células de copa secretor de moco (ITLN), células multiciliadas (tubulina acetilada) y pequeñas células secretoras (aglutinina de cacahuete, ANP) (Figura 1C).
Además de confirmar el desarrollo de diferentes tipos de células con inmunosuización, la dinámica del desarrollo organoides puede ser seguida por imágenes en vivo (Figura 2A). Para examinar la epitelización que surge en la etapa temprana de la formación de organoides(Figura 1B),etiquetamos embriones expresando proteínas de unión estrechas etiquetadas fluorescentemente (ZO-1-RFP) y proteínas localizadoras de membranas (mem-GFP). Con el doble etiquetado, los pasos secuenciales de la formación de unión estrecha ZO-1 positivo se pueden marcar y analizar cuantitativamente durante la epitelización (Figura 2). Por ejemplo, para las celdas(Figura 2B, de color verde) en diferentes etapas de la epitelización (a 0 min), algunas regiones de adhesión de celdas celulares tienen puncta dispersa de ZO-1(Figura 2B,flechas verdes). Por el contrario, otras áreas tienen una expresión ZO-1 contigua completamente ensamblada(Figura 2B,flechas amarillas). Con el tiempo, la puncta se une y se conecta para formar uniones estrechas contiguas(Figura 2B, flechas verdes) y uniones estrechas contiguas mantienen su morfología incluso durante la división celular(Figura 2B,flechas amarillas). A medida que las uniones estrechas maduran, las células se mueven dinámicamente dentro y fuera de la superficie a lo largo de los planos apicales de los organoides (Figura 2C,D). Además, al rastrear las células espaciotemplodetemente en la superficie de organoides diferenciadores(Figura 2B,células codificadas por colores), el análisis a escala múltiple es posible, que va desde puncta individual hasta uniones estrechas contiguas, límites de células celulares y subconjuntos de poblaciones celulares dentro de organoides.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> Figura 1: Generación de organoides epiteliales mucociliarios. (A) Un esquema que muestra el protocolo para ensamblar agregados de ectodermo profundos a partir de embriones X. laevis. (B) Un esquema para un modelo de formación de organoides epiteliales mucociliares que se origina a partir de células de ectodermo profundo multipotentes (vista transversal). Las células posicionadas en superficie pasan a las células epiteliales y se diferencian en células de copa. Las células ciliadas diferenciadoras, las células secretoras y los ionocitos se intercalan radialmente en la superficie y regeneran una epidermis madura. (C) Proyección z máxima del epitelio mucociliar inmunodeterrado para ITLN (células de la gosa productoras de moco), tubulina acetilada (células ciliadas), ANP (células secretoras pequeñas) y queratina (células epiteliales) en organoides a 24 hpa (panel superior) y epidermis de renacuajo (panel inferior). Barra de escala a 30 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes en vivo del desarrollo de organoides. (A) Un esquema de la cámara de imágenes para organoides vivos (no a escala). (B) Secuencias de lapso de tiempo de pilas confocales recogidas de agregados de células de ectoderm profundos que expresan ZO-1-RFP y mem-GFP de 2,5 hpa. Barra de escala a 20 m. Las células son pseudo-coloreadas para el seguimiento con el tiempo. Las células de color verde tienen diferentes estados de adhesión celular, incluyendo una adhesión positiva ZO-1 progresivamente en desarrollo (flechas verdes) y una que mantiene la adhesión positiva contigua ZO-1 (flechas amarillas) con el tiempo. (C, D) Las imágenes confocales de lapso de tiempo de los agregados de celda de ectodermo profundo que expresan ZO-1-RFP muestran las células intercalantes radialmente que se mueven a la superficie (C, estrella amarilla) y se mueven dentro de los agregados (D, estrella azul). Barras de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

El epitelio mucociliar recuica los órganos internos de nuestro cuerpo y proporciona la primera línea de defensa al eliminar partículas extrañas. Este protocolo permite generar organoide epitelial mucociliar derivado de células embrionarias en 24 horas. La ventaja clave de nuestro método es que podemos monitorear la progresión en vivo de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.Este protocolo reproducible, escalable y rápido para el organoide en desarrollo permitirá a los investigadores abordar cuestiones fundamentales para la biología del epitelio mucociliar. Para empezar, obtener embriones X.Laevis mediante la recolección manual de óvulos de ranas hembra estimuladas y la realización de fertilización in vitro. Des-jalea los embriones fertilizados con agitación suave en 2%cisteína, en un tercio X-modificado solución salina de Barth durante unos cinco minutos.Cultivo de los embriones en un tercio XMBS a la temperatura preferida hasta que se detecten los primeros signos de la etapa 10, como la aparición de células pigmentadas oscuras alrededor del blastoreo a la vista vegetal. Seleccione y recoja embriones a medida que alcanzan la etapa temprana 10 utilizando herramientas para el cabello bajo un estereoscopio. Transfiera los embriones seleccionados a un plato Petri lleno de DFA con una pipeta de transferencia desechable.A continuación, retire la membrana vitellina de los embriones utilizando fórceps afilados del lado vegetal, sin interrumpir el lado animal del embrión. Para aislar la tapa del animal, coloque el lado animal del embrión hacia arriba. Estimar visualmente la extensión de la tapa del animal que se va a extirpar y hacer la primera incisión a lo largo del borde con un cuchillo de pelo, tirando del cuchillo hacia afuera para hacer el corte.Repita este proceso para crear una cadena de pequeños cortes para extirpar la tapa del animal. Recortar el borde de capa gruesa de la tapa del animal utilizando un cuchillo para el pelo para evitar la inclusión de precursores de mesodermo. Para separar las células profundas del ectodermo de la tapa del animal, transfiera las tapas de animales extirpadas a un plato de Petri lleno de DFA sin calcio y magnesio con una pipeta de transferencia desechable.Coloque las tapas de los animales para mirar hacia arriba, manteniendo una distancia generosa de otros explantes. Espere de cinco a diez minutos y, a continuación, monitoree los explants debajo de un estereoscopio. Una vez que las células profundas aflojadas se han liberado del borde de la capa superficial pigmentada oscura, comienza a levantar la capa superficial lejos de las células de ectodermo profundo de color claro.Separe cuidadosamente la capa superficial con un cuchillo para el cabello, comenzando en el borde. A continuación, recoger las células de ectodermo profundo con el menor calcio y DFA libre de magnesio como sea posible. Transfiera las células de ectodermo profundo recogidas a tubos de PCR no adhesivos que contengan 200 microlitros de DFA y pipetee suavemente los medios dos o tres veces para dispersar las células transferidas.Cierre los tubos y manténgalos en posición vertical para inducir la agregación espontánea en la parte inferior. Supervise el proceso de agregación bajo un microscopio estéreo. Las células normalmente se reúnen en la parte inferior del tubo pcR dentro de una hora y se ensamblan en agregados esféricos dentro de dos a tres horas dependiendo del tamaño.Para realizar imágenes en vivo o pruebas de drogas durante el desarrollo de los organoides epiteliales mucociliares, recoja los agregados a las dos horas después de la agregación utilizando una pipeta de 200 microlitros equipada con puntas agrandadas. Para permitir que los agregados se conviertan en organoides epiteliales mucociliares en el cultivo, recóralos del tubo de PCR a las cinco horas después de la agregación y transfieralos a un plato Petri lleno de DFA. Coloque los agregados muy separados entre sí para evitar fusiones.Dentro de las 24 horas de cultivo a temperatura ambiente, sin ningún factor añadido, se pueden observar organoides epiteliales mucociliar maduros girando debido a la paliza de los cilios que cubre la superficie del epitelio diferenciado. Prepare una cámara de imágenes con fondo de vidrio pegando un vidrio de cubierta a una cámara de acrílico fresada a medida con grasa de silicio, sellando firmemente la cámara para evitar fugas de los medios de cultivo y, a continuación, llene la cámara de imágenes con DFA. Recoge una microscopía electrónica de transmisión hexagonal o una rejilla TEM usando fórceps y aplica una pequeña cantidad de grasa al borde de la red.Presione ligeramente hacia abajo para fijar la rejilla TEM a la parte inferior de la cámara de imágenes. Transfiera los agregados a la cámara de imágenes y colóquelos dentro de la cuadrícula. Llene la cámara con DFA y ciélela con un vaso de cubierta y grasa.Para seguir la progresión de la formación de organoides epiteliales mucociliares, recopile imágenes de agregados de agregados con lapsos de tiempo transcurridos por tiempo utilizando un microscopio confocal. Los organoides epiteliales mucociliares se generaron a partir de progenitores multipotentes de embriones X.Laevis en etapa de gastrula temprana. Los organoides tienen una epidermis madura que es indistinguible de la de un renacuajo incluyendo un epitelio totalmente diferenciado, células de la copa secretoras de moco, células multiciliadas y pequeñas células secretoras.La dinámica del desarrollo organoides fue seguida por imágenes en vivo. Para examinar la epitelización que surge en la etapa temprana de la formación de organoides, los embriones fueron etiquetados con proteínas de unión apretadas etiquetadas fluorescentemente y proteínas localizadoras de membrana. Con el etiquetado doble, los pasos secuenciales de la formación de unión estrecha positiva ZO-1 se pueden marcar y analizar cuantitativamente durante la epitelización.Algunas regiones de adhesión de células celulares han dispersado puncta de ZO-1 en diferentes etapas de la epitelización. Por el contrario, otras áreas han ensamblado completamente la expresión ZO-1 contigua. Con el tiempo, la puncta se une y se conecta para formar uniones estrechas contiguas, que mantienen su morfología incluso durante la división celular.A medida que las uniones estrechas maduran, las células se mueven dinámicamente dentro y fuera de la superficie a lo largo de los planos apicales de los organoides. El análisis a varias escalas es posible mediante el seguimiento de células espacio-temporalmente en la superficie de organoides diferenciadores. Al intentar este protocolo, recuerde colocar el lado pigmentado oscuro de la tapa del animal aislado mirando hacia arriba y monitorearlo debajo de un estereoscopio.Es fundamental separar la capa superficial de la tapa del animal en el momento adecuado en medios DFA libres de calcio/magnesio. Este sencillo protocolo ofrece formas prácticas de estudiar los comportamientos celulares dinámicos, así como los mecanismos moleculares y físicos que regulan el epitelio mucociliar.

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Investigación

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Biología

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Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

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