Name: Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a modelar sepsis neonatal en ratones usando E. coli bioluminiscente para el seguimiento en tiempo real de la diseminación bacteriana. Este protocolo permite analizar longitudinalmente la dinámica de infección y evaluar intervenciones terapéuticas preclínicas.

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Este trabajo fue apoyado por fondos institucionales a C.M.R.

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<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Nuestro modelo de infección subescapular para inducir sepsis bacteriana en ratones neonatales es un método novedoso para estudiar la propagación longitudinal de patógenos bacterianos en tiempo real. La imagen intravital ofrece la oportunidad de explorar la diseminación bacteriana en tiempo real en neonatos. Esto es fundamental para entender la cinética de la diseminación bacteriana y para seguir estudiando la respuesta del huésped y el daño en la fase apropiada de la enfermedad. A los cachorros de ratón se les administra...

La sepsis bacteriana es una preocupación significativa para los neonatos que presentan un perfil inmune único en los primeros días de vida que no proporciona una protección adecuada contra la infección1. La sepsis neonatal sigue siendo un problema de atención médica importante en los Estados Unidos que representa más de 75.000 casos anuales solo en los Estados Unidos2. Para estudiar estas infecciones en profundidad, se requieren nuevos modelos animales que recapitulan aspectos de la enfermedad humana. Hemos establecido un modelo de infección de ratón neonatal utilizando Escherichia coli,O1:K1:H73. E. coli es la segunda causa principal de sepsis neonatal en los Estados Unidos, pero responsable de la mayoría de la mortalidad asociada a la sepsis4,5. Sin embargo, es la causa principal cuando los bebés prematuros y con muy bajo peso al nacer (VLBW) se consideran independientemente5. El serotipo K1 se asocia con mayor frecuencia con infecciones invasivas del torrente sanguíneo y meningitis en neonatos6,7. Actualmente, no hay otras opciones de tratamiento más allá de los antibióticos y la atención de apoyo. Mientras tanto, las tasas de resistencia a los antibióticos siguen aumentando para muchas bacterias patógenas, con algunas cepas de E. coli resistentes a una multitud de antibióticos comúnmente utilizados en el tratamiento8. Por lo tanto, es imperativo que sigamos generando métodos para estudiar los mecanismos de la sepsis y la respuesta del huésped en los neonatos. Estos resultados pueden ayudar a mejorar los tratamientos actuales y los resultados de la infección.
El estado inmunológico de los neonatos se caracteriza por diferencias fenotípicas y funcionales en comparación con los adultos. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles elevados de citoquinas antiinflamatorias y reglamentarias, como la interleucina (IL)-10 y la IL-27, se producen por macrófagos derivados de la sangre del cordón umbilical y están presentes a niveles mayores en el suero de neonatos muriados9,10,11. Esto es consistente con los niveles más bajos de α IFN, IFN-ɣ, IL-12 y TNF-α que se notifican con frecuencia de células neonatales en comparación con las contrapartes adultas10. Además, el sistema inmunitario neonatal está sesgado hacia una respuesta de la célula T Th2 y reguladora en comparación con los adultos12. Un número elevado de neutrófilos, células T, células B, células NK y monocitos también están presentes en los neonatos, pero con deficiencias funcionales significativas. Esto incluye defectos en la expresión de marcadores de superficie celular y presentación de antígenos que sugieren inmadurez13,14,15. Además, los neutrófilos neonatales son significativamente deficientes en su capacidad de migrar a factores quimiotácticos16. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) también se encuentran en niveles elevados en neonatos y recientemente se ha demostrado que son una fuente de IL-2711. Los MDSC son altamente supresivos hacia las células T17. Colectivamente, estos datos demuestran limitaciones en la inmunidad neonatal que prestan a una mayor susceptibilidad a la infección.
Para estudiar la progresión de la carga bacteriana y diseccionar las respuestas inmunitarias del huésped protector durante la sepsis neonatal, hemos desarrollado un nuevo modelo de infección. Los ratones neonatales en los días 3-4 de vida son difíciles de inyectar en el espacio intraperitoneal o en la vena de la cola. En nuestro modelo, día 3 o 4 cachorros se administran el inóculo bacteriano o PBS por vía subcutánea en la región escapular. Una infección sistémica se desarrolla y utilizando E. coli luminiscente O1:K1:H7, podemos imaginar longitudinalmente ratones neonatales individuales para seguir la carga bacteriana diseminada en los tejidos periféricos. Este es el primer modelo reportado para utilizar imágenes intravitales para entender la cinética de la diseminación de bacterias durante la sepsis en neonatos muridos3.
Aquí, describimos un protocolo para inducir infecciones sépticas de E. coli en ratones neonatales3. Describimos cómo preparar el inóculo bacteriano para inyección, y cómo cosechar tejido para la evaluación de la patología, la medición de marcadores inflamatorios por análisis de expresión génica, y la enumeración de la carga bacteriana. Además, también se describe el uso de E. coli luminiscente para imágenes intravitales de neonatos infectados y la cuantificación de la matanza bacteriana por parte de células inmunitarias neonatales. Estos protocolos también pueden adaptarse para estudiar otras infecciones bacterianas importantes en neonatos. Los datos presentados aquí representan un enfoque novedoso general para entender la dinámica de la infección en un modelo de sepsis neonatal traducible.

<table><tbody><tr><td>1 ml de insulina Jeringa de</td><td>inóculo 1188128012 Coviden</td><td></td><td>o inyección de PBS</td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>Histopatología</td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>Ensayo de aclaramiento bacteriano</td></tr><tr><td>Pasta de tinta para tatuajes de animales</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>Identificación de animales</td></tr> Pasta verde de <tr><td>tinta para tatuajes de animales</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>Identificación animal</td></tr><tr><td>Microperlas Anti-Ly-6B.2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>Aislamiento</td></tr> <tr><td>celularEscherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresa luciferasa)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Construido internamente en WVU</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit de ARN de extracción total HP</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico Difco</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>IL-1 beta Imprimador/Sonda (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Expresión de citocinas qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Primer/Sonda (Mm00446190)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Expresión de citocinas qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>PCR cuantitativa en tiempo real</td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>Síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Tampón de aislamiento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Ensayo de depuración bacteriana</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT y Living Image 4.5 Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Imágenes intravitales</td></tr><tr><td>Caldo LB, Lennox</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP1427-500</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>EASYstrainer (Cesta de nylon)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>Colador de células</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Lector de placas</td></tr><tr><td>Pellet Mortle Motor</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>Homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Pellet de polipropileno Morteros</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>Síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>TNF-alfa Cebador/Sonda (Mm00443258)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>4331182 Expresión de citoquinas qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent (GTCP)</td><td>Centro de Investigación Molecular</td><td>TR 118</td><td>Extracción de ARN</td></tr></tbody></table>

un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Los neonatos tienen un mayor riesgo de sepsis bacteriana debido al perfil inmune único que muestran en los primeros meses de vida. Hemos establecido un protocolo para estudiar la patogénesis de E. coli O1:K1:H7, un serotipo responsable de altas tasas de mortalidad en neonatos. Nuestro método utiliza imágenes intravitales de cachorros neonatales en diferentes momentos durante la progresión de la infección. Esta imagen, paralela a la medición de bacterias en la sangre, el perfilo inflamatorio y la histopatología tisular, significa un enfoque riguroso para entender la dinámica de la infección durante la sepsis. En el informe actual, modelamos dos inóculos infecciosos para la comparación de las cargas bacterianas y la gravedad de la enfermedad. Encontramos que la infección subescapular conduce a la infección diseminada por 10 h después de la infección. A las 24 horas, la infección de E. coli luminiscente era abundante en la sangre, los pulmones y otros tejidos periféricos. La expresión de citoquinas inflamatorias en los pulmones es significativa a las 24 h, y esto es seguido por la infiltración celular y la evidencia de daño tisular que aumenta con la dosis infecciosa. Las imágenes intravitales tienen algunas limitaciones. Esto incluye un umbral de señal luminiscente y algunas complicaciones que pueden surgir con los neonatos durante la anestesia. A pesar de algunas limitaciones, encontramos que nuestro modelo de infección ofrece una visión para entender la dinámica longitudinal de la infección durante la sepsis murina neonatal, que no ha sido examinada a fondo hasta la fecha. Esperamos que este modelo también se pueda adaptar para estudiar otras infecciones bacterianas críticas durante la vida temprana.

Este protocolo indujo sepsis bacteriana en ratones neonatales, y utilizamos imágenes intravitales longitudinales, enumeración de bacterias en la sangre, evaluaciones histológicas de patología y perfiles inflamatorios de expresión de citoquinas para estudiar el curso de la enfermedad. Se observaron signos de morbilidad en cachorros neonatales infectados con inóculos bajos (2 x10 6 UFC) y altos (7 x 106 UFC) de E.coli a lo largo del tiempo. Los cachorros que recibieron el mayor inóculo mostra...

La infección de ratones neonatales con E. coli O1:K1:H7 bioluminiscente produce una infección séptica con inflamación pulmonar significativa y patología pulmonar. Aquí, describimos procedimientos para modelar y estudiar más a fondo la sepsis neonatal utilizando imágenes intravitales longitudinales en paralelo con la enumeración de cargas bacterianas sistémicas, perfiles inflamatorios e histopatología pulmonar.

Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Nuestro protocolo permite la diseminación bacteriana y el seguimiento de la carga en un modelo experimental de sepsis neonatal en tiempo real, y la capacidad de correlacionar otros marcadores de enfermedad con la carga de patógenos. Este protocolo nos permite analizar longitudinalmente la sepsis en ratones neonatales individuales, proporcionando la oportunidad de observar y comparar la dinámica de infecciones y la diseminación bacteriana en tiempo real. Las pruebas preclínicas de las intervenciones para la sepsis neonatal se pueden realizar con este método, permitiendo el seguimiento de los efectos del control del huésped de las bacterias.Comience colocando cachorros a medida en grupos de camada de dosis alta o baja dentro de un gabinete de nivel dos de bioseguridad. En el tercer o cuatro días posnatales, registre los pesos de todos los cachorros antes de la inoculación. Cargue jeringas de insulina con PBS o el inóculo E.coli lux de dosis alta o baja en el gabinete de bioseguridad y coloque las jeringas cargadas en hielo.Coloque el neonato que se va a inyectar sobre una superficie limpia dentro del gabinete de bioseguridad y levante la piel en la nuca como para escabar al cachorro. Inserte el bisel de la aguja justo debajo de la piel en el espacio creado entre la piel y el músculo. Cuando la aguja se pueda sentir debajo de la piel, inyecte 50 microlitros del inoculante mientras libera simultáneamente la parte pellizcada de la piel para evitar el flujo de espaldas, luego retire la aguja lentamente y con cuidado.Cuando todos los cachorros hayan sido inyectados de la misma manera, devuelva a los cachorros a sus presas. Inmediatamente después de la inyección y en los puntos de tiempo experimentales apropiados a partir de entonces, coloque la jaula con ratones neonatales infectados por E.coli lux y la presa en una campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad dos y abra el software en el ordenador micro CT. Después de inicializar el sistema y esperar a que la temperatura del escenario se bloquee a 37 grados centígrados y la temperatura del CCD para bloquear a 90 grados Celsius negativos, coloque hasta cuatro cachorros anestesiados en la caja de imágenes en la cámara de imágenes en la posición propensa.Cierre la puerta de la cámara de imágenes y seleccione la opción de imágenes de luminiscencia. Seleccione el filtro abierto y el siguiente y configure el filtro de excitación para bloquear y el filtro de emisión para que se abra. Seleccione 500, 520, 560, 580, 600 y 620 nanómetros.A continuación, imagine a los cachorros antes de devolverlos a la jaula con la presa con monitoreo hasta la recuperación de la anestesia. En el punto final experimental adecuado, en un gabinete de bioseguridad, douse el neonato eutanizado con 70% de etanol para evitar la contaminación y colocar al animal en su lado derecho. Usa fórceps para agarrar la piel entre el abdomen y la pierna izquierda trasera y usa tijeras quirúrgicas de punta fina para hacer una incisión cutánea.Luego continúe la incisión hacia la parte posterior del animal hasta que todo el bazo esté expuesto. Utilice los fórceps y tijeras para eliminar el bazo del abdomen y colocarlo en la solución adecuada para su aplicación aguas abajo. Para obtener los pulmones, pelar la piel del pecho por completo y entrar en la base del esternón con las tijeras sujetas verticalmente, cortar hacia arriba hasta que la caja torácica se divide.Usa fórceps para agarrar los pulmones derecho e izquierdo individualmente y eliminar los pulmones de la cavidad torácica. Retire el corazón del tejido pulmonar con tijeras. A continuación, coloque el pulmón en la solución adecuada para su aplicación posterior.Para realizar un ensayo de matanza bacteriana in vitro, coloque el bazo no infectado en un colador de nylon de 40 micrómetros dentro de un plato estéril de 60 milímetros de Petri que contenga cinco mililitros de PBS complementados con un suero bovino 10%fetal y utilice un émbolo estéril de tres mililitros para desagregar el tejido en una suspensión de una sola célula. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 mililitros y recógelas por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro de tampón de lysis de glóbulos rojos de tres a cuatro bazos.Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave el bazo en PBS y resuspendir el pellet en 250 microlitros de PBS complementados con albúmina sérica bovina y dos EDTA milimolares para el conteo. A continuación, aísle las células positivas Ly6 B2 con las cuentas inmunomagnéticas adecuadas de acuerdo con el protocolo del fabricante y sembrar las células positivas Ly6 B2 enriquecidas a una vez 10 a las cinco células por cada 100 microlitros de media completa por densidad de pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos. Preparar el inóculo bacteriano en la multiplicidad deseada de infección en un volumen final de 100 microlitros por pozo y añadir 100 microlitros de inóculo bacteriano o medio solo a cada pozo para una incubación de una hora en la incubadora de cultivo celular.Al final de la incubación, reemplace el medio por 200 microlitros de medio fresco completo complementados con 100 microgramos por mililitro de gentamicina para eliminar cualquier bacteria extracelular restante y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante dos horas adicionales. Al final de la incubación y en cada punto de tiempo experimental a partir de entonces, utilice un lector de placas para medir la luminiscencia en cada pocólite de la placa de cultivo tapada antes de devolver la placa a la incubadora de cultivo celular hasta la siguiente lectura. Mientras que la mayoría de los animales exhiben altos niveles de bacterias en la sangre a las 24 horas después de la infección, algunos cachorros tienen bacterias bajas o indetectables en la sangre, lo que sugiere el aclaramiento de la infección en este momento.Además, las células esplénicas positivas Ly6 B2 neonatales infectadas con E.coli bioluminiscente durante una hora antes de la eliminación de bacterias extracelulares y el posterior tratamiento con gentamicina expresaron un alto nivel de luminiscencia a las tres horas que disminuye con el tiempo indicativa del aclaramiento bacteriano. Las imágenes animales vivos de las bacterias luminiscentes confirman aún más el aumento de la diseminación y el crecimiento de bacterias en los cachorros neonatales a lo largo del tiempo a las 10 y 24 horas después de la infección. La toma de imágenes intravitales junto con la micro TC facilita la identificación de focos de infección en el cerebro, los pulmones y otros tejidos periféricos.Los pulmones de algunos ratones altamente infectados demuestran regiones opacas consistentes con la consolidación inflamatoria que co-localizado a señales bacterianas luminiscentes. Estas regiones de presunto exudado inflamatorio no se observan en los pulmones de control no infectados. También se observa un aumento significativo en la expresión inflamatoria de citoquinas en relación con los controles en grupos de inóculos bajos y altos, correlacionando con un notable engrosamiento de la pared alveolar, aumento de la hemorragia alveolar e infiltración inflamatoria en estos animales.Lo más importante a recordar es ejecutar la técnica adecuada al realizar las inyecciones y prestar estricta atención a los neonatos al administrar la anestesia. Usando esta técnica, podemos visualizar la sepsis neonatal en tiempo real para estudiar intervenciones y organizar terapias dirigidas a mejorar la respuesta inmune.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Evaluación in vitro de la muerte bacteriana por fagocitos esplénicos neonatales de ratón

Fuente: Seman, B. G., et al. Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gramnegativa. J. Vis. Exp. (2020)El vídeo muestra un modelo neonatal murino para estudiar la infección sistémica utilizando bacterias bioluminiscentes encapsuladas. A los cachorros neonatales se les inyectan suspensiones bacterianas de dosis altas o bajas y se les devuelven a su madre para cuidados postnatales. Las bacterias encapsuladas evaden la detección inmunitaria temprana, se propagan sistémicamente y se...

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Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

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La encefalopatía hipóxico-isquémica después de la asfixia perinatal se puede estudiar utilizando modelos animales. Demostramos los procedimientos necesarios para establecer un modelo de lechón de encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal.

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