Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Este método es significativo porque se puede utilizar en diversas especies bacterianas para identificar genes esenciales, genes de resistencia a antibióticos y genes importantes para la aptitud in vivo durante la infección. La principal ventaja de esta técnica es el intercambio mecánico de ADN genómico y edición Poly-CTL, que eliminan la necesidad de costosas enzimas de restricción, radiación de adaptador y purificación de gel. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de infecciones bacterianas problemáticas, ya que los genes identificados como importantes para la infección o la resistencia a los antibióticos, podrían servir como dianas para nuevas terapias antimicrobianas.

Este método puede proporcionar información sobre el genotipo complejo, las relaciones de fenotipo en especies bacterianas gramnegativas y grampositivas, y mejorar nuestra comprensión actual de la genética bacteriana. Para comenzar, transfiera cultivos nocturnos a tubos cónicos de 50 mililitros, y pelete los cultivos tanto de receptores como de donantes utilizando centrifugación a 5.000 veces G durante 7 minutos. Deseche el sobrenadante.

Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para volver a suspender el pellet de cepa del donante en 4,5 mililitros de LB suplementados con ácido diaminopimelico. Transfiera la cepa del donante re-suspendido al tubo de tensión receptor. Y distribuir inmediatamente la suspensión de acoplamiento como gotas individuales de 100 microlitro en placas de agar LB, complementadas con ácido diaminopimelico Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Luego, transfiera cuidadosamente las placas a 37 grados Celsius incubadora y permita que los cultivos se apareecen durante una hora. Después de la incubación añadir 1,5 mililitros de LB en cada plato y cosechar las bacterias en un tubo cónico de 50 mililitros. Pele el pelado de las células acopladas usando centrifugación a 5.000 veces G durante siete minutos.

Luego, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de LB, para eliminar el ácido diaminopimelico residual Pellet las células de nuevo, y repetir el lavado con LB. Cuando termine, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para volver a suspender el pellet en 10 mililitros de LB, complementado con 25% de glicerol. Extienda las celdas en las planchas, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, incuba las placas a 37 grados centígrados, durante la noche.

Cree alícuotas de un mililitro de las bacterias restantes y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Vierta una alícuota del apareamiento congelado sobre hielo. A continuación, utilice perlas de vidrio estériles para esparcir 150 microlitros de la dilución, en cada placa de agar Luria-Bertani de 30 por 150 milímetros, complementada con Kanamicina.

Deseche el tubo usado que contenga el exceso de apareamiento e incubar las placas a 37 grados centígrados durante 14 horas. Después del recuento de incubación, la colonia forma unidades en cada placa para estimar el total de mutantes en la biblioteca transposon. Cuente el 20% de al menos tres placas para determinar la estimación del recuento de colonias para todo el grupo de placas.

Después de calcular el rendimiento estimado de la colonia, agregue de tres a cinco mililitros de LB a cada plato, y raspe las bacterias usando una herramienta de raspado estéril. Tire de las suspensiones bacterianas de todas las placas en tubos cónicos de 50 mililitros, y pelete las suspensiones centrifugando a 5.000 veces G, durante siete minutos. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en cinco mililitros de LB, complementado con 30%glicerol.

Luego, haz un mililitro alícuotas de la biblioteca transposon en criooviales y guárdalas a menos 80 grados centígrados. Diluir el gDNA con tampón TE a una concentración de 250 nanogramos por microlitro, en un volumen total de 200 microlitros, y colocarlo en el sonicador de baño de agua. Sonicar el ADN para producir fragmentos de aproximadamente 300 nucleótidos.

Confirme que el ADN está cizallado ejecutando 10 microlitros de ADN sin esarear y 10 microlitros de ADN cizallado, en un gel de asado de 1%cerdo. Repita la sonicación, si es necesario. Para añadir la cola de semilla Polly al extremo final principal del ADN, configure la reacción de política como se describe en el manuscrito de texto e incubar los tubos de reacción durante una hora a 37 grados centígrados.

Para purificar la reacción de la política, agregue 40 microlitros de perlas paramagnéticas de selección de tamaño a cada muestra y vórtice el tubo de reacción. Incubar muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, centrifuga brevemente para recoger el líquido en la parte inferior del tubo.

Transfiera los tubos a un bastidor magnético e incubarlos a temperatura ambiente durante dos minutos o hasta que la solución esté despejada. Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 200 microlitros de recién preparados, 80%etanol, sin alterar las perlas. Incubar las muestras hasta que la solución esté transparente.

A continuación, retire el sobrenadante y repita el lavado de etanol. Centrifugar brevemente los tubos y volver a colocarlos en el bastidor magnético, para eliminar cualquier líquido restante. Incubar las muestras a temperatura ambiente, durante dos a cinco minutos, para que se sequen.

Y añadir 25 microlitros de agua a cada tubo. Vórqueles durante aproximadamente cinco segundos o pipeta arriba y abajo. Luego, centrifugar los tubos para recoger líquido en la parte inferior.

Transfiera los tubos al bastidor magnético y déjelos reposar durante aproximadamente dos minutos hasta que la solución esté despejada. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo sin alterar las cuentas. Este protocolo se utilizó para generar una biblioteca transposon de alta densidad en la cepa A-baumannii ATCC 17978, a través de la conjugación bacteriana utilizando E-coli MFD DAP auxotroph, que replica el plásmido pJNW684.

La biblioteca mutante A-baumannii transposon tirada se utilizó para identificar factores de aptitud, importantes para la resistencia a la colistina bajo concentraciones subincons inhibidores del antimicrobiano. Después de agotar la biblioteca mutante de genes que contribuyen a la resistencia a la colistina, el gDNA total de la extracción de la biblioteca restante se aisló del control y de las culturas experimentales. El gDNA estaba fragmentado con cizallamiento mecánico y se añadió una cola de política a los fragmentos de ADN en preparación para la secuenciación.

Se calcularon las concentraciones de ADN y se analizaron las muestras utilizando electroforesis capilar basada en chip, para confirmar construcciones exitosas de la biblioteca. Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es ajustar el volumen de acoplamiento, basado en los recuentos de UFC para cepas específicas de destino para generar una biblioteca mutante de alta resolución. Además, la cepa receptora debe ser sensible al marcador de resistencia a los antibióticos, utilizando la transposon antes de la mutagénesis.

Después de este procedimiento, se puede realizar una deleción de genes o un método de dicho sonoro para noquear cabezas individuales obtenidas de los resultados de secuenciación y validar genes de interés en condiciones difíciles.