Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Este protocolo es importante porque permite el análisis ChIP-Seq de alto rendimiento de muestras primarias para comprender mejor los mecanismos cis-reguladores y sus implicaciones en la enfermedad. Las principales ventajas de este método son la reproducibilidad de los datos y la reducción drástica del tiempo de trabajo en el laboratorio. Para el cizallamiento de la cromatina, agregue 70 microlitros de tampón de lisis completo fresco a temperatura ambiente a un pellet de celda fijado con glicina, congelado y descongelado de interés, para una incubación de un minuto a temperatura ambiente, seguida de un minuto de resuspensión sin burbujas.

Incube la muestra durante otro minuto a temperatura ambiente, antes de colocar las células en hielo. Transfiera el pellet resuspendido a un tubo de baja unión de 0,65 mililitros sobre hielo, antes de cargar el tubo en el soporte del tubo de un sonicador. Rellene los huecos con tubos de equilibrio que contengan 70 microlitros de agua y deje que las células se estabilicen en el baño de agua durante aproximadamente un minuto antes de iniciar la sonicación.

Después de tres ciclos, retire las muestras del sonicador para obtener un vórtice suave y haga girar los tubos antes de volver a colocarlos en el soporte. Para la modificación de histonas, agregue 100 microlitros de tampón tC1 completo a cada tubo de dos tiras de ocho tubos de chip y transfiera 20 microlitros de cada una de las 16 muestras compartidas con cromatina a tubos individuales de las tiras de ocho tubos de chip. Lave los tubos de cromatina con tampón tC1 completo de 80 microlitros y agrupe los lavados en los tubos apropiados de las tiras de ocho tubos del chip para obtener un volumen final de 200 microlitros de solución por tubo.

Agregue el volumen apropiado de anticuerpo a 500 microlitros de tampón TBW1 y rápidamente el vórtice y el espín de pulso. A continuación, añada 70 microlitros de tBW1 y 30 microlitros de solución de anticuerpos a cada tubo de una nueva tira de ocho tubos con chip. A continuación, haga un vórtice completo de un recipiente de solución de perlas de proteína A y agregue cinco microlitros de perlas por cada 0,5 microgramos de anticuerpo a una nueva tira de tubo.

Gire por pulsos la tira de cuentas y llene la última fila del manipulador de líquido de virutas con tiras de ocho tubos de virutas vacías y etiquetadas. A continuación, siga las especificaciones del programa chip 16-I pure 200 D para la colocación del resto de las tiras y cargue los tampones en las posiciones correctas. Después de la secuenciación, capture las cuentas en una tira magnética de ocho tubos y transfiera 25 microlitros de tampón de etiquetado a cada tubo.

Una vez retirados los tubos del imán, mezcle suavemente, hasta que las soluciones de perlas sean homogéneas, antes de colocar los tubos retapados en un ThermoMixer precalentado durante tres minutos. Al final de la incubación, retire las tiras de ocho tubos de virutas en la última fila del manipulador de líquido de virutas y agregue dos microlitros de Rnasa A a cada muestra. A continuación, gire por pulso los tubos retapados y mezcle suavemente, hasta que las soluciones de perlas sean homogéneas.

Para una purificación de los fragmentos de ADN marcados, transfiera 100 microlitros de las muestras de ADN reticulado D a tubos individuales de 1,5 mililitros y lave los tubos con 100 microlitros de tampón de unión al ADN por tubo. Pulse los lavados en los tubos apropiados y cargue las muestras en columnas. Coloque las columnas en nuevos tubos de recolección de 1,5 mililitros y agregue nueve microlitros de tampón Tris-EDTA de 55 grados Celsius directamente a las matrices de columnas.

Después de un minuto, centrifuga las columnas y transfiere los nueve microlitros de eluido de cada columna a una nueva tira de ocho tubos en hielo. Eluir los fragmentos de ADN de nuevo como se ha demostrado, pero con ocho microlitros de tampón Tris-EDTA, y agrupar el eluido con la solución de fragmentos de ADN recolectada previamente. Para amplificar las muestras de fragmentos de ADN purificados, mezcle las muestras con una pipeta multicanal y realice un programa de amplificación con el número adecuado de ciclos.

Después de la amplificación, use un imán de placa para capturar las perlas y deseche el sobrenadante. Lave las perlas tres veces con 200 microlitros de etanol fresco al 80% por lavado, sin alterar la pellets de perlas. Después del último lavado, utilice una punta de pipeta de 20 microlitros para eliminar el exceso de etanol y deje que las perlas se sequen durante 10 minutos o hasta que aparezcan grietas en los gránulos de perlas.

Agregue 40 microlitros de agua precalentada a cada muestra seca y selle la placa antes de vórtice completamente y gire brevemente por pulsos. A continuación, cuantifique el ADN, utilizando un ensayo de cuantificación de fluorescencia, de acuerdo con los protocolos estándar. Las mediciones del tamaño de los fragmentos de cromatina cortada demuestran una gran reproducibilidad, observándose más del 70% de las muestras entre 100 y 500 pares de bases durante 14 ciclos.

Como se ilustra, el ciclo en el que la intensidad de la muestra marcada es la mitad del máximo promedio es óptimo para la determinación del ciclo. Los mejores datos de secuenciación se obtienen cuando más del 85% de los fragmentos de ADN oscilan entre 200 y 1000 pares de bases. En estas pistas de enriquecimiento representativas para cuatro loci de genes, las pistas individuales para cada muestra muestran una alta calidad de mapeo y una relación señal-ruido.

Los dos primeros loci albergan genes bien expresados en estos tipos de células, mientras que los genes de los dos últimos loci no se expresan y sirven como controles de fondo. Para la mayoría de las comparaciones por pares, los índices de correlación de Pearson muestran más del 90% de correlación, lo que sugiere un alto nivel de consistencia entre las réplicas biológicas. Mientras que los loci específicos del tipo de célula exhiben un alto enriquecimiento en las células apropiadas, un gen de mantenimiento muestra una modificación de histonas muy consistente.

El análisis de correlación entre el conjunto de datos ChIP-Seq realizado a partir de muestras con menos de 100.000 células sigue demostrando una alta reproducibilidad y correlación de hasta 10.000 células. Sin embargo, hay un mayor fondo a medida que se reduce el número de celdas, así como una disminución en sus coeficientes de correlación. El lisado adecuado de las células es esencial para generar datos de alta calidad, ya que hemos comprobado que la lisis celular incompleta afecta al resto del protocolo.

Con este método, se pueden probar muchas modificaciones de histonas y factores de transcripción diferentes en varios tipos de células de interés para mejorar nuestra comprensión de los elementos cis-reguladores.