Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Esta técnica de flotación libre se puede utilizar para reducir la inmunohistoquímica en muestras de tejido cerebral de ratón. La técnica de flotación libre ofrece varias ventajas. La adquisición de secciones de tejido más gruesas, la realización de estudios a gran escala, utilizando de 30 a 40 cortes por alícuota y el almacenamiento a largo plazo de muestras.

Si es la primera vez que intentas esta técnica, te recomendamos que practiques el montaje de secciones que no sean críticas para tu experimento para obtener experiencia con el método. Al menos una o dos horas antes del corte, aclimate las muestras de interés en el criostato a la temperatura adecuada de corte del tejido. Cuando los pañuelos estén listos.

use el criostato para adquirir secciones de 20 a 50 micras de espesor y coloque las secciones en insertos individuales en pocillos llenos de PBS de una placa de seis o 12 pocillos. Cuando se hayan adquirido todas las secciones, cubra las muestras con aproximadamente seis mililitros por lavado durante tres lavados de cinco minutos antes de transferir cada pocillo de secciones a dos tubos de microcentrífuga de mililitros, que contienen de uno a 1,5 mililitros de solución de almacenamiento por tubo. A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que se tiñan.

Para la tinción de secciones de tejido, equilibre las muestras a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos antes de decantar las secciones en insertos en una nueva placa de seis pocillos. Cuando se haya drenado toda la solución de almacenamiento, mueva los insertos a nuevos pocillos, que contengan aproximadamente seis mililitros de TBS por pocillo durante tres lavados durante cinco minutos con TBS fresco por lavado en un agitador orbital a baja velocidad a temperatura ambiente. Después del último lavado, agregue siete mililitros de solución permeabilizante de bloqueo recién preparada a cada pocillo para una incubación de 30 minutos en el agitador a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, agregue un mililitro de la solución de anticuerpo primario de interés a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros por inserto y transfiera todas las secciones de cada inserto al tubo apropiado de dos mililitros. A continuación, coloque los tubos en una batidora giratoria. Agregue aproximadamente siete revoluciones por minuto para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados.

A la mañana siguiente, decantar las secciones de cada tubo en insertos de pocillos individuales en una nueva placa de seis pocillos y lavar las secciones dos veces durante 30 segundos por lavado y una vez durante 10 minutos en TBS fresco por lavado. Después del último lavado, transfiera los grupos de secciones a tubos individuales de microcentrífuga de dos mililitros, que contengan un mililitro de la solución de anticuerpos secundarios adecuada por tubo e incube las muestras durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad, protegido de la luz. Al final de la incubación, decantar las secciones en insertos en una nueva placa de seis pocillos y lavar las muestras dos veces durante 30 segundos y una vez durante 15 minutos en TBS fresco por lavado, protegidas de la luz.

Después del último lavado, decantar las secciones en una cámara histológica rectangular de vidrio, llena de tres cuartas partes con TBS y sumergir un portaobjetos de vidrio en el TBS. Con un pincel fino y una lámpara de aumento, si lo desea, persuada con cuidado las secciones hacia el portaobjetos y golpee suavemente una sección en el portaobjetos, asegurándose de que no haya arrugas ni pliegues. Cuando todas las secciones se hayan capturado en un portaobjetos, deje que los portaobjetos se sequen durante unos 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, hasta que las secciones estén opacas y aplique un medio de montaje acuoso adecuado a las secciones.

Use pinzas para colocar un cubreobjetos en el medio y use un pedazo de papel de filtro para presionar firmemente el cubreobjetos para eliminar el exceso de medio. A continuación, se pueden obtener imágenes de las secciones, utilizando un microscopio adecuado o almacenarlas en una caja de portaobjetos oscura de cuatro grados centígrados. Como se observa en estas imágenes representativas, el análisis inmunohistoquímico fluorescente, utilizando el método de flotación libre, se puede realizar en secciones de tejido cerebral de ratón para examinar la expresión de proteínas ácidas fibrilares gliales.

Este enfoque también es apropiado para revelar proteínas de baja expresión, como GFP, en una muestra de cerebro de ratón transgénico de baja expresión o en protocolos de tinción histoquímica no fluorescentes, como el violeta de cresil. Otros tejidos periféricos también son susceptibles al uso de esta técnica sin necesidad de modificaciones, como se ha observado para estas muestras de tejido hepático que expresan GFP de bajo nivel. Lo más importante que hay que recordar con la técnica de flotación libre es ser cuidadoso con las secciones, especialmente durante las transferencias y cuando las muestras están en los agitadores o rotadores.

Además de la tinción por inmunofluorescencia, este método puede modificarse fácilmente para otras tinciones histoquímicas como la hematoxilina, la eosina y el violeta de cresilo, o para la inmunohistoquímica de cromógenos.