Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre
25 de agosto de 2020
La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.
Esta técnica de flotación libre se puede utilizar para reducir la inmunohistoquímica en muestras de tejido cerebral de ratón. La técnica de flotación libre ofrece varias ventajas. La adquisición de secciones de tejido más gruesas, la realización de estudios a gran escala, utilizando de 30 a 40 cortes por alícuota y el almacenamiento a largo plazo de muestras.
Si es la primera vez que intentas esta técnica, te recomendamos que practiques el montaje de secciones que no sean críticas para tu experimento para obtener experiencia con el método. Al menos una o dos horas antes del corte, aclimate las muestras de interés en el criostato a la temperatura adecuada de corte del tejido. Cuando los pañuelos estén listos.
use el criostato para adquirir secciones de 20 a 50 micras de espesor y coloque las secciones en insertos individuales en pocillos llenos de PBS de una placa de seis o 12 pocillos. Cuando se hayan adquirido todas las secciones, cubra las muestras con aproximadamente seis mililitros por lavado durante tres lavados de cinco minutos antes de transferir cada pocillo de secciones a dos tubos de microcentrífuga de mililitros, que contienen de uno a 1,5 mililitros de solución de almacenamiento por tubo. A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que se tiñan.
Para la tinción de secciones de tejido, equilibre las muestras a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos antes de decantar las secciones en insertos en una nueva placa de seis pocillos. Cuando se haya drenado toda la solución de almacenamiento, mueva los insertos a nuevos pocillos, que contengan aproximadamente seis mililitros de TBS por pocillo durante tres lavados durante cinco minutos con TBS fresco por lavado en un agitador orbital a baja velocidad a temperatura ambiente. Después del último lavado, agregue siete mililitros de solución permeabilizante de bloqueo recién preparada a cada pocillo para una incubación de 30 minutos en el agitador a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, agregue un mililitro de la solución de anticuerpo primario de interés a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros por inserto y transfiera todas las secciones de cada inserto al tubo apropiado de dos mililitros. A continuación, coloque los tubos en una batidora giratoria. Agregue aproximadamente siete revoluciones por minuto para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados.
A la mañana siguiente, decantar las secciones de cada tubo en insertos de pocillos individuales en una nueva placa de seis pocillos y lavar las secciones dos veces durante 30 segundos por lavado y una vez durante 10 minutos en TBS fresco por lavado. Después del último lavado, transfiera los grupos de secciones a tubos individuales de microcentrífuga de dos mililitros, que contengan un mililitro de la solución de anticuerpos secundarios adecuada por tubo e incube las muestras durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad, protegido de la luz. Al final de la incubación, decantar las secciones en insertos en una nueva placa de seis pocillos y lavar las muestras dos veces durante 30 segundos y una vez durante 15 minutos en TBS fresco por lavado, protegidas de la luz.
Después del último lavado, decantar las secciones en una cámara histológica rectangular de vidrio, llena de tres cuartas partes con TBS y sumergir un portaobjetos de vidrio en el TBS. Con un pincel fino y una lámpara de aumento, si lo desea, persuada con cuidado las secciones hacia el portaobjetos y golpee suavemente una sección en el portaobjetos, asegurándose de que no haya arrugas ni pliegues. Cuando todas las secciones se hayan capturado en un portaobjetos, deje que los portaobjetos se sequen durante unos 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, hasta que las secciones estén opacas y aplique un medio de montaje acuoso adecuado a las secciones.
Use pinzas para colocar un cubreobjetos en el medio y use un pedazo de papel de filtro para presionar firmemente el cubreobjetos para eliminar el exceso de medio. A continuación, se pueden obtener imágenes de las secciones, utilizando un microscopio adecuado o almacenarlas en una caja de portaobjetos oscura de cuatro grados centígrados. Como se observa en estas imágenes representativas, el análisis inmunohistoquímico fluorescente, utilizando el método de flotación libre, se puede realizar en secciones de tejido cerebral de ratón para examinar la expresión de proteínas ácidas fibrilares gliales.
Este enfoque también es apropiado para revelar proteínas de baja expresión, como GFP, en una muestra de cerebro de ratón transgénico de baja expresión o en protocolos de tinción histoquímica no fluorescentes, como el violeta de cresil. Otros tejidos periféricos también son susceptibles al uso de esta técnica sin necesidad de modificaciones, como se ha observado para estas muestras de tejido hepático que expresan GFP de bajo nivel. Lo más importante que hay que recordar con la técnica de flotación libre es ser cuidadoso con las secciones, especialmente durante las transferencias y cuando las muestras están en los agitadores o rotadores.
Además de la tinción por inmunofluorescencia, este método puede modificarse fácilmente para otras tinciones histoquímicas como la hematoxilina, la eosina y el violeta de cresilo, o para la inmunohistoquímica de cromógenos.
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Resumen
La técnica de flotación libre se utiliza para realizar inmunohistoquímica en secciones de tejido fijado, lo que permite la visualización de estructuras biológicas, tipos celulares y la expresión proteica. Este método es particularmente eficaz para investigar diversos tejidos como el cerebro, el corazón y el hígado, y ofrece ventajas como secciones de tejido más gruesas y adecuación para estudios a gran escala.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Histología
- Inmunohistoquímica
- Análisis de tejidos
Antecedentes
- Las ventajas de la técnica de flotación libre incluyen un manejo más sencillo y la posibilidad de almacenamiento prolongado de las muestras.
- Este método es aplicable a múltiples tipos de tejidos biológicos sin necesidad de modificaciones.
- Mejora la detección de proteínas de baja expresión en diversos tipos de muestras.
Métodos Utilizados
- Tinción inmunohistoquímica
- Muestras de tejido cerebral de ratón
- Microscopía fluorescente
Resultados principales
- La técnica permite la identificación de la expresión de la proteína ácida fibrilar glial.
- Demuestra eficacia en contextos de baja expresión proteica, como en muestras de ratones transgénicos GFP.
- Otros métodos de tinción, como la hematoxilina y la eosina, también pueden aplicarse utilizando esta técnica.
Conclusiones
- El estudio subraya la versatilidad de la técnica de flotación libre para la tinción y el análisis de tejidos.
- Es fundamental que los investigadores manipulen las muestras con cuidado para mantener su integridad durante el experimento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La técnica de inmunohistoquímica en suspensión permite un procesamiento eficiente de secciones gruesas de tejido para estudios a gran escala, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación del sistema nervioso y de tejidos periféricos. Al mejorar la penetración de los anticuerpos y permitir el manejo por lotes de 30 a 40 secciones por alícuota, esta técnica mejora la reproducibilidad y el rendimiento en los flujos de trabajo de descubrimiento. Este enfoque es particularmente valioso para estudiar los patrones de expresión proteica en tejidos complejos como el cerebro, donde la reconstrucción tridimensional de las proyecciones neuronales aporta confianza en los objetivos y ayuda a la priorización de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la visualización de la expresión y localización de proteínas en secciones de tejido gruesas, apoyando la validación funcional de dianas y la aclaración de vías.
- Valor operativo: Facilita el manejo de un gran número de secciones por alícuota, reduciendo la labor requerida en campañas de cribado a gran escala de biomarcadores.
- Valor predictivo: Mejora la penetración de los anticuerpos en comparación con los métodos sobre portaobjetos, aumentando la confianza en la detección de dianas de baja abundancia, como GFP en modelos transgénicos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Compatible con múltiples tinciones histoquímicas, incluyendo hematoxilina y eosina, violeta de cresilo y inmunohistoquímica con cromógeno, lo que permite el desarrollo flexible de ensayos.
- Valor operativo: Las secciones permanecen suspendidas en solución durante la tinción, asegurando una exposición uniforme a los reactantes y minimizando la variabilidad entre réplicas.
- Escalabilidad: Permite almacenamiento a largo plazo a -80°C, facilitando el procesamiento por lotes y el análisis retrospectivo en líneas de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Aplicable tanto al sistema nervioso central como a tejidos periféricos (por ejemplo, hígado, corazón) sin modificaciones del protocolo, lo que favorece la validación cruzada de objetivos.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite la reconstrucción tridimensional de proyecciones axónicas y dendríticas, aportando contexto estructural para el análisis de la interacción con el objetivo y de las vías implicadas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Genera datos cuantitativos de expresión proteica con resolución espacial que orientan las decisiones de avance o interrupción en la selección preclínica de objetivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método de libre flotación se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica, particularmente en neurociencia y en la evaluación de toxicidad sistémica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la interrogación basada en hipótesis de los patrones de expresión proteica en tejidos fijados, permitiendo una comprensión mecanicista de la biología del blanco.
- Detección: Genera lecturas cuantitativas reproductibles, fluorescentes o cromogénicas, adecuadas para plataformas de imagen automatizadas y cribado basado en imágenes.
- Análisis: Produce datos de expresión con resolución espacial que pueden cuantificarse y compararse entre condiciones experimentales para evaluar la modulación del blanco.
- Investigación Traducional: Permite la consistencia entre modelos de descubrimiento y preclínicos mediante la aplicación de protocolos de tinción idénticos en diferentes especies y tipos de tejidos.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma estandarizada y adaptable para el análisis histológico que puede implementarse en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la sensibilidad y especificidad de la detección en inmunohistoquímica, reduciendo los falsos negativos en estudios de validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de manejo y tinción de tejidos, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios y reduciendo la variabilidad técnica.
- Valor estratégico: Aumenta el rendimiento en cribados basados en histología, disminuyendo el costo por muestra y acelerando los ciclos de desactivación de riesgos del objetivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de objetivos basada en datos al proporcionar lecturas tisulares fiables y multiparamétricas que informan sobre la plausibilidad biológica y los márgenes de seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, corte de tejidos y métodos de detección por inmunofluorescencia o cromogénicos.
- Depende del acceso a criostato, micrótomo, agitadores orbitales, mezcladores rotatorios y microscopios de fluorescencia o campo claro.
- Necesita tampones estandarizados de bloqueo, permeabilización y lavado para minimizar la unión no específica y garantizar la consistencia de la tinción.
- Requiere la optimización de las concentraciones de anticuerpos y los tiempos de incubación para cada blanco y tipo de tejido, especialmente para proteínas de baja abundancia.
- Exige un manejo cuidadoso y suave de secciones libres para evitar daños mecánicos durante las transferencias y los pasos de incubación.
