Imágenes ópticas basadas en fotodiodos para registrar dinámicas de red con resolución de una sola neurona en invertebrados no transgénicos

Este artículo representa una descripción detallada de cómo utilizar una matriz de fotodiodos y tintes sensibles al voltaje para registrar potenciales de acción de un gran número de neuronas simultáneamente. En comparación con las imágenes de calcio de la actividad neuronal, que son indirectas, los tintes sensibles al voltaje que utilizamos registran potenciales de acción directamente similares a las grabaciones de electrodos afilados, pero a través de muchas neuronas simultáneamente. Nuestro flujo de trabajo de imágenes ópticas se puede adaptar para visualizar rápidamente la actividad de la red con una sola neurona y una resolución de potencial de acción única en una variedad de sistemas de invertebrados no transgénicos e incluso vertebrados.

Además, Evan Hill de mi laboratorio demostrará los procedimientos de nuestro protocolo. Comience anestesiando un animal Aplysia californica de 40 gramos y sujetándolo con el lado ventral hacia arriba en un plato de disección forrado con cera. Con unas tijeras de disección, haga una incisión de dos a tres centímetros en la línea media a lo largo de la extensión más anterior del pie y sujete con alfileres las solapas del pie a cada lado de la incisión para revelar parte del sistema nervioso central y la masa bucal.

Use fórceps y tijeras de disección para diseccionar cuidadosamente la masa bucal, revelando los ganglios cerebrales, y cortar los nervios que inervan el cuerpo del animal para extirpar el sistema nervioso central, dejando una gran longitud del nervio para estimular. Use alfileres minuciosos para colocar el sistema nervioso central en un plato revestido de elastómero lleno de solución salina y perfunda el plato con solución salina pasada a través de un dispositivo de enfriamiento Peltier para mantener la temperatura de preparación de 15 a 16 grados centígrados. Utilice las pinzas y las tijeras de microdisección para eliminar el exceso de tejido conectivo de los nervios y diseccionar una parte superficial de la vaina del ganglio o los ganglios que se van a obtener imágenes.

A continuación, sumerja el sistema nervioso central limpio en una solución salina al 0,5% de glutaraldehído durante 20 segundos antes de devolver el sistema nervioso central a la placa revestida de elastómero con solución salina para enjuagar el exceso de glutaraldehído. Para preparar una solución de trabajo de colorante sensible al voltaje, agregue 500 microlitros de solución salina a una alícuota sólida previamente preparada de RH 155 para lograr una concentración final de colorante de 0,3 miligramos por mililitro. Y use un microdispensador de mano para cargar 200 microlitros de solución en un trozo de tubo de polietileno con un diámetro similar al del ganglio que se va a teñir.

Con un micromanipulador, coloque con cuidado el extremo del tubo sobre el ganglio objetivo, bajando el tubo hasta que forme un sello ajustado sobre el ganglio. Gire la perilla aplicadora del microdispensador cada cinco minutos durante una hora para forzar más tinte en el ganglio, revisando la muestra a los 30 minutos para confirmar que se está produciendo una tinción adecuada. Después de la tinción, manteniendo las luces atenuadas, coloque un material tampón adecuado a la izquierda y a la derecha de donde se colocará la preparación en la cámara de imágenes que contiene solución salina y, a continuación, sumerja el sistema nervioso central en la cámara.

Presione un trozo de cubreobjetos del tamaño adecuado sobre el tejido y presione firmemente el cubreobjetos para aplanar el tejido sin dañar las neuronas. A continuación, coloque la cámara de imágenes bajo un microscopio de disección. Si estimula un nervio para provocar un programa motor ficticio, derrita con cuidado un segmento de tubo de polietileno PE100 sobre una llama mientras tira suavemente de ambos extremos del segmento del tubo y corte el cono resultante en el punto deseado.

A continuación, conecte un trozo de tubo de polímero flexible de paredes gruesas al extremo posterior de un electrodo de succión de polietileno. A continuación, utilice una sección de boca para crear presión negativa y extraer un pequeño volumen de solución salina a través del extremo cónico del electrodo de succión. Introduzca el extremo del nervio a estimular en el electrodo bajo el microscopio y confirme que la solución salina del electrodo carece de burbujas que puedan interrumpir la conducción eléctrica.

Para obtener imágenes del ganglio, mueva la cámara al equipo de imágenes e inicie la perfusión salina a través de la cámara de registro. Coloque una sonda de temperatura cerca de la preparación y ajuste la temperatura según corresponda para la especie que se está fotografiando. Coloque un alambre de plata clorada en el electrodo de succión, asegurándose de que entre en contacto con la solución salina en el electrodo y coloque un alambre de cloruro de plata en la solución salina del baño cerca del electrodo de succión.

Baje la lente de inmersión en agua en la solución salina y cierre el diafragma de la base. Suba o baje el condensador de la subetapa y ajuste el enfoque hasta que los bordes del diafragma estén enfocados con nitidez, creando una iluminación Kohler. Concéntrese en la región de la preparación que se va a visualizar y adquiera una imagen del ganglio de interés con la cámara digital parafocal.

Coloque el interruptor de ganancia del panel de control en 1X y haga clic en el botón de intensidad de luz en reposo para verificar la intensidad de luz en reposo promedio de los diodos. Ajuste el nivel de voltaje enviado desde un estimulador a la fuente de alimentación de la lámpara LED y continúe verificando el nivel promedio de intensidad de luz en reposo hasta que esté en el rango deseado. A continuación, ajuste el interruptor de ganancia del panel de control a 100X para la grabación y compruebe que el muelle o la mesa de aire estén flotando.

Con las luces aún atenuadas, establezca la duración, la ruta y el nombre del archivo en el software de imágenes y haga clic en tomar datos para adquirir archivos hasta la capacidad de la RAM disponible de la computadora. Tenga cuidado de permanecer quieto durante la grabación, ya que pequeñas vibraciones pueden introducir grandes artefactos en los datos de grabación óptica. Para ver los datos inmediatamente después de la adquisición, utilice la función superpuesta para superponer los datos recopilados por los 464 diodos sobre la imagen ganglionar y haga clic en cualquiera de los diodos representados en el software para expandir los datos registrados en una pantalla de rastreo separada.

Para lograr una alineación exacta de los diodos con respecto a la preparación, ingrese los factores X, Y y de aumento según lo determinado por una prueba estenopeica. Para maximizar la visibilidad del potencial de acción y mejorar el rendimiento de las neuronas para la posterior clasificación de picos, imponga un filtro Butterworth de paso de banda con cortes de cinco y 100 hercios para eliminar el ruido de baja y alta frecuencia. Para guardar los datos ópticos filtrados como un archivo de texto para su posterior análisis, en la pantalla de la página, seleccione la casilla de filtro TP.

Y en la pestaña de salida, seleccione guardar página como ASCII. A continuación, introduzca un nombre de archivo adecuado en el cuadro de diálogo que aparece. El contacto de la piel con su depredador estrella de mar desencadena el nado de escape de Tritonia diomedia, que consiste en una serie rítmica de flexiones de todo el cuerpo que la impulsan a un lugar seguro.

En esta figura, se muestran los datos brutos y filtrados de 20 diodos que registran la actividad antes, durante y después de la estimulación del nervio pedal tres. Inmediatamente después de la adquisición, las señales medidas por los 464 diodos de la matriz de registro se pueden mostrar topográficamente sobre una imagen de la preparación en el software de imágenes. En este análisis, la clasificación de picos de los rastros de diodos filtrados con análisis de componentes independientes, o ICA, produjo 53 trazas neuronales únicas, 30 de las cuales se muestran aquí.

Un estímulo de cola fuertemente aversivo para Aplysia californica provoca ondas repetidas de una respuesta de escape rítmica de dos partes que consiste en un período de galope de varios ciclos de embestidas y tirones de la cola que mueven al animal rápidamente hacia adelante y un período de gateo posterior. En este análisis representativo, un minuto después de una grabación óptica continua de 20 minutos, se estimuló el nervio pedal nueve para provocar la secuencia del programa motor de galope y gateo. Las distribuciones espaciales gaussianas probabilísticas de las señales de las 81 neuronas registradas se mapearon en el ganglio.

La reducción de dimensionalidad aplicada a la grabación completa reveló que las fases de galope y arrastre del programa de escape ocupaban áreas distintas y formaban diferentes trayectorias en el espacio de componentes principales. Al intentar este protocolo, las consideraciones importantes incluyen: optimizar la tinción, minimizar la vibración y dirigir suficiente luz a través de la preparación al PDA mientras se minimiza el fotoblanqueo del tinte. Entre los ejemplos de análisis posteriores a la adquisición que revelaron información sobre la red a nivel de población se incluyen la detección de conjuntos funcionales mediante la agrupación por consenso en un algoritmo de aprendizaje no supervisado y la reducción de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales.

La combinación de nuestro sistema de imágenes basado en matrices de fotodiodos y nuestro uso de tintes absorbentes sensibles al voltaje permite el monitoreo de la evolución dinámica de la red durante períodos prolongados de tiempo.