Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Los BMEC generados a partir de iPSC proporcionan nuevos modelos experimentales para estudiar la función y la disfunción de la barrera hematoencefálica. Hemos utilizado este protocolo para examinar si los BMEC conservan sus propiedades de barrera después de la expansión y la criopreservación. Esta técnica permite la generación de BMEC específicos de la enfermedad a partir de pacientes con trastornos en los que la alteración de la barrera hematoencefálica desempeña un papel en la fisiopatología de la enfermedad.

Para inducir la diferenciación de BMEC de las iPSC humanas, lavar el cultivo de iPSC confluente con DPBS una vez antes de incubar las células con el volumen adecuado de EDTA enzimático durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados Celsius. Cuando se haya obtenido una suspensión de una sola célula, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de medio de células madre suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares para el recuento. Diluya las células a 1,56 veces 10 por la cuarta célula por centímetro cúbico de concentración y siembre dos mililitros de células en pocillos individuales de un fondo plano de seis pocillos.

Después de 24 horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con medio E6 y devuelva la placa a la incubadora durante cuatro días más. Para purificar las BMEC derivadas de iPSC, cubra las placas de subcultivo con el volumen adecuado de una solución de colágeno IV y fibronectina recién preparada por pocillo e incube las placas durante un mínimo de dos horas a 37 grados centígrados. En el sexto día de diferenciación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en el volumen adecuado de medio fresco libre de suero endotelial humano suplementado con B27, fibroblastos básicos, factor de crecimiento y ácido retinoico.

Para el análisis de TEER, coloque las células diferenciadas en cada pocillo de una placa filtrada de 12 pocillos recubierta de colágeno y fibronectina. Para el análisis de la actividad del transportador de eflujo, coloque las células en cada pocillo de una placa de fondo plano de 24 pocillos recubierta de colágeno y fibronectina. Después de 24 horas de subcultivo, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con medio fresco libre de suero endotelial humano suplementado solo con suplemento de B27.

Para medir las propiedades de la barrera hematoencefálica de los BMEC mediante TEER, cargue el instrumento TEER durante la noche y limpie ligeramente el instrumento y los electrodos de los palillos con etanol al 70% antes de colocarlos en la capucha de seguridad. Encienda la alimentación y calibre el ohmiometro de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Conecte los electrodos y enjuáguelos una vez con etanol al 70% y una vez con DPBS.

Coloque el extremo más corto del electrodo en la cámara atípica del inserto y el extremo más largo en la cámara basolateral de un pocillo en blanco. Después de medir la respuesta de control negativo, enjuague rápidamente los electrodos como se ha demostrado y mida el primer pocillo experimental. Una vez que se hayan registrado todas las mediciones, enjuague los electrodos de los palillos nuevamente, limpie suavemente los electrodos y déjelos secar al aire en la campana de seguridad.

Para evaluar la actividad transportadora de eflujo de las células, en el octavo día de cultivo se trata el número adecuado de pocillos con una solución inhibidora del transportador de eflujo de 10 micromolares y se coloca en una incubadora durante una hora a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, trate las células con una solución de sustrato transportador de eflujo de 10 micromolares durante una hora en la incubadora. Al final de la incubación, lavar cada pocillo dos veces con 500 microlitros de DPBS por pocillo antes de lisar las células con 500 microlitros de DPBS suplementado con 5% de Triton-X por pocillo.

Después de cinco minutos, use un lector de microplacas para medir la fluorescencia de las células lisadas a una excitación de 485 nanómetros y una emisión de 530 nanómetros. En el caso de los pocillos no utilizados en el ensayo del transportador, lavar las células dos veces con DPBS antes de fijarlas con un 4% de paraformaldehído por cuantificación de núcleos celulares. Después de un día de cultivo en medio E6, la morfología celular es similar a la de las iPSCs.

Al cuarto día, las células son visiblemente distintas de las iPSC y cubren la mayor parte del pocillo. Dos días de cultivo en un medio libre de suero endotelial humano induce una apariencia alargada y empedrada en las células. Al octavo día, las células individuales forman un patrón de adoquines en su mayoría grande.

Se puede realizar un ensayo de germinación para demostrar el potencial angiogénico de las BMEC derivadas de iPSC. Esto conduce al desarrollo de estructuras en forma de tubo después de tres días de tratamiento con factor de crecimiento. Las BMEC derivadas de iPSC generadas utilizando este protocolo coexpresaron proteínas de unión estrecha expresadas en células endoteliales en el cerebro, pulmón, hígado y riñón, así como marcadores endoteliales vasculares expresados en la barrera hematoencefálica.

Como se observó, 48 horas después del cambio de subcultivo y medio, las BMEC derivadas de iPSC muestran valores de TEER dentro del rango descrito para las BMEC derivadas de iPSC que se cocultivaron con astrocitos primarios de rata. También se observó actividad transportadora de eflujo en esta etapa. Después de la criopreservación, las mediciones de TEER son más bajas en comparación con los BMEC recién derivados.

El análisis de Western blot revela niveles reducidos de marcadores de unión estrecha, como la ocludina, mientras que la inmunocitoquímica muestra patrones pecosos o deshilachados de las proteínas de unión estrecha. Una densidad de iPSC demasiado alta o demasiado baja afectará la eficiencia de la diferenciación e impactará en el desarrollo de las propiedades apropiadas de la barrera hematoencefálica. Este método permite la investigación de las propiedades de barrera, la señalización celular y la actividad del transportador utilizando BMECs individualizados para modelar la fisiología y la fisiopatología de la función de barrera hematoencefálica.