Name: Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a visualizar Pseudomonas aeruginosa y el polisacárido Psl en esputo de pacientes con fibrosis quística mediante tinción fluorescente e hibridación in situ. Este protocolo permite estudiar la organización espacial bacteriana y su impacto en la susceptibilidad antimicrobiana.

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Los autores desean agradecer a la Fundación de Fibrosis Quística que proporcionó fondos para esta investigación y a MedImmune por su generosa donación de anticuerpos anti-Psl0096. Para este estudio, las imágenes se realizaron en el centro de imágenes CAMiLoD de la Universidad de Toronto.

Se requiere la aprobación de la Junta de Ética en Investigación (REB, por sus siglas en inglés) para recolectar y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Los estudios presentados en este documento fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB#1000058579.
1. Recolección de esputo
<ol><li>Almacenar el esputo expectorado en un recipiente de recogida estéril y conservar inmediatamente a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de la fijación. NOTA: Dejar el esputo demasiado tiempo a 4 °C sin fijación puede provocar la degradación celular, en particular la degradación de los glóbulos blancos. Es preferible la fijación lo antes posible.</li>
	<li>Transfiera las muestras de esputo a un tubo estéril de 15 ml.</li>
	<li>Agregue un volumen igual de paraformaldehído (PFA) al 4% a las muestras de esputo. Por ejemplo, si la muestra de esputo es de 0,5 ml, agregue 0,5 ml de PFA al 4 %. Mezclar mediante una inversión suave.</li>
	<li>Incubar el esputo durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lave la muestra añadiendo 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada 2 ml de esputo fijo. NOTA: No se requiere centrifugación para este paso de lavado.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta. NOTA: Evite succionar el esputo con la pipeta apuntando la punta en dirección opuesta al esputo y aspire muy lentamente el líquido de la superficie. La etapa de lavado no implica centrifugación para no alterar la integridad estructural de los tapones de esputo.</li>
	<li>Repita los pasos 1.6 y 1.7 dos veces más.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en 2 veces el volumen de PBS con azida sódica al 0,01 % (p/v).</li>
	<li>Almacenar el esputo a 4 °C.</li>
</ol>2. Procesamiento de esputo MiPACT (técnica de limpieza de tejidos)
<ol><li>Desgasificar los componentes del hidrogel (30% acrilamida 29:1:bis-acrilamida, endurecedor y PBS) en un recipiente sellado que contenga un paquete anaeróbico previamente durante 72 h. NOTA: El paquete anaeróbico y el recipiente sellado son necesarios porque el oxígeno inhibe la polimerización de la acrilamida. Alternativamente, el oxígeno se puede eliminar realizando este paso en una campana anaeróbica, aplicando un vacío a un recipiente sellado o burbujeando gas N2 a través de la mezcla de acrilamida.<ol><li>Agregue 2 ml de una solución de acrilamida:bis-acrilamida al 30% 29:1 a un tubo de 15 ml sin la tapa dentro del recipiente anaeróbico sellado.</li>
		<li>Haga una caldo concentrado de endurecedor al 10% (p/v) añadiendo 0,5 g de endurecedor a 5 ml de PBS en un tubo de 15 ml. Deje la tapa fuera del tubo y guárdela en el recipiente anaeróbico sellado.</li>
		<li>Deje unos pocos ml de PBS estéril en un tubo, sin tapa, dentro del recipiente anaeróbico.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 5 ml de solución de hidrogel con una concentración final de endurecedor al 0,2 % y acrilamida 29:1 al 4 % en PBS en un tubo de 15 ml. Mezclar por inversión y esterilizar con filtro.</li>
	<li>Retire las muestras de esputo de la nevera y córtelas en pequeñas secciones (de aproximadamente 5 mm de diámetro) en condiciones estériles con un bisturí. NOTA: Si el esputo es bastante fluido, este paso aún se puede realizar, sin embargo, se necesita más paciencia y práctica para eliminar el esputo de la solución de almacenamiento con pinzas antes de usar el bisturí para separar las fracciones deseadas.</li>
	<li>Coloque las muestras de esputo cortadas dentro de un pocillo de un portaobjetos de cubreobjetos de 8 cámaras.</li>
	<li>Añadir 300 μL de solución de hidrogel esterilizada con filtro del paso 2.2 a cada uno de los pocillos que contengan esputo.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos de 8 cámaras dentro de un recipiente sellado que contenga un paquete anaeróbico durante 3 h a 37 °C. NOTA: Una vez polimerizado, el hidrogel con esputo incrustado debe tener la consistencia de un gel firme.</li>
	<li>Transfiera las muestras de esputo de hidrogel solidificado a un tubo de cultivo de 15 ml que contenga 5 ml de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 8 %, pH 8, y deje que las muestras se aclaren durante 3-14 días a 37 °C (con o sin agitación), hasta que el esputo se vuelva transparente. NOTA: Los tiempos de aclaramiento dependen de la composición del esputo y, por lo general, pueden disminuirse con agitación. Sin embargo, tenga cuidado de no aumentar la velocidad de agitación hasta el punto de interrumpir la integridad de la muestra. Las muestras más ricas en ADN tardan más en aclararse en comparación con las muestras ricas en moco.</li>
	<li>Decantar la solución SDS al 8% en un contenedor de recogida de residuos. Con pinzas estériles, transfiera cada muestra incluida en hidrogel a un tubo cónico estéril de 50 ml. Agregue 10 ml de PBS a cada uno de los tubos cónicos de 50 ml para lavar los hidrogeles y deje reposar la solución durante 30 minutos a 1 hora antes de decantar. Repita esto 2 veces más. NOTA: Este paso de lavado no implica centrifugación. El exceso de líquido y sobrenadante se elimina cuidadosamente con una pipeta.</li>
	<li>Almacenar las muestras lavadas en PBS con azida sódica al 0,01% (p/v) y 1x inhibidor de la RNasa a 4 °C.</li>
</ol>3. Protocolo de hibridación in situ fluorescente de hidrogel (FISH)
<ol><li>Retire las muestras de hidrogel de su solución de almacenamiento con pinzas estériles y coloque las muestras sobre una superficie estéril (como un portaobjetos de vidrio o una placa de Petri).</li>
	<li>Con un bisturí estéril, corte los hidrogeles en rodajas de ~ 1 mm de grosor.</li>
	<li>Coloque las secciones de hidrogel de 1 mm dentro de tubos estériles de 1,5 ml.</li>
	<li>Preparar 1 mL del tampón de hibridación (25% formamida, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, H2O purificado y desionizado) en un tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Agregue la sonda PseaerA marcada con fluorescencia (150.7 nM12) al tampón de hibridación y mezcle por inversión. NOTA: La solución de formalina debe mantenerse alejada de una llama abierta. El tampón de hibridación puede prepararse en avanzado y almacenarse en alícuotas a -20 °C13.</li>
	<li>Agregue 200-500 μL de tampón de hibridación a cada sección de ~ 1 mm de hidrogel y asegúrese de que la totalidad de la muestra de hidrogel esté sumergida.</li>
	<li>Deje que la sonda PseaerA se hibrida con las muestras de hidrogel colocándolas en la oscuridad durante ~ 18-24 h, a 46 °C, sin agitar.</li>
	<li>Decantar el tampón de hibridación en un contenedor de recogida de residuos.</li>
	<li>Enjuague las muestras una vez con tampón de lavado esterilizado por filtro (337,5 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) [pH 7,2], 0,01 % de SDS y H2O purificado y desionizado) añadiendo 1 ml de tampón de lavado a cada uno de los tubos de 1,5 ml y luego retírelo. NOTA: El tampón de lavado se puede hacer con anticipación y almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de lavado fresco a los tubos, luego incubar las muestras en la oscuridad durante 6 h a 48 °C, sin agitar.</li>
</ol>4. Unión de hidrogel y anticuerpos Psl0096
<ol><li>Retire estérilmente el tampón de lavado con una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Enjuague las muestras con un BSA al 2% (p/v) en una solución de PBS agregando y quitando 1 ml de la solución de BSA al 2%.</li>
	<li>Añadir 500 μL de la solución BSA/PBS al 2% a las muestras de hidrogel para bloquear la unión a proteínas no específicas. A continuación, incubar las muestras durante la noche, en la oscuridad, a RT, sin agitar.</li>
	<li>Retire estérilmente la solución de bloqueo con una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Prepare la solución de anticuerpos Psl0096-Texas Red diluyendo el anticuerpo hasta una concentración final de 0,112 μg/ml en 500 μl de BSA/PBS fresco al 2%.</li>
	<li>Añadir la solución de anticuerpos de 500 μL a las muestras de hidrogel e incubarlas a RT durante 6 h, protegidas de la luz, sin agitar.</li>
</ol>5. Tinción con DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol)
<ol><li>Prepare la solución de adaptación del índice de refracción (RIMS) añadiendo 40 g de medio de gradiente de densidad no iónico, 30 μl de Tween20, 3 μg de azida sódica y 30 ml de PBS a un matraz que contenga una barra de agitación magnética. Revuelva la solución durante 15 minutos en un agitador magnético o hasta que se disuelva por completo.</li>
	<li>Filtrar: esterilizar la solución en un tubo cónico de 50 ml con una jeringa de 10 ml y un filtro estéril de 0,2 μm. NOTA: La solución puede almacenarse a 4 °C durante varios meses.</li>
	<li>Retire la solución de anticuerpos Psl0096-Texas Red con una pipeta estéril de 1 ml.</li>
	<li>Enjuague las muestras de hidrogel agregando y luego retirando 1 ml de PBS.</li>
	<li>Incubar las muestras de hidrogel con 250 μL de solución RIMS y 10 μg/mL de DAPI a RT con agitación suave, en la oscuridad, durante la noche.</li>
	<li>Antes de la obtención de imágenes confocal, monte las muestras en cámaras de perfusión de 0,9 mm o 1,7 mm y séllelas con un cubreobjetos de vidrio. NOTA: Después de la FISH y/o inmunohistoquímica y antes de la inmersión en RIMS, se pueden aplicar tinciones de lectina fluorescente si se desea la visualización de la mucosa del esputo12.</li>
</ol>6. Imágenes
<ol><li>Realice imágenes de microscopía de escaneo láser confocal utilizando técnicas estándar con aumentos de 25x, 40x, 63x o 100x.</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
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</ol>

El propósito de este protocolo es permitir vislumbrar la organización in situ de las células de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Las muestras de esputo deben almacenarse a 4 °C hasta que se procesen si no pueden fijarse inmediatamente. Se ha demostrado que el número de células de P. aeruginosa en el esputo no cambia significativamente si se procesa a 1 h, 24 h o 48 h, cuando se almacena a 4 °C, aunque si se deja a 25 °C durante 24 o 48 h, los recuentos de células bacterianas aumentarán si...

En este estudio, se diseñaron experimentos para visualizar la estructura in vivo de Pseudomonas aeruginosa dentro del esputo de pacientes pediátricos con fibrosis quística (FQ). Las infecciones por P. aeruginosa se vuelven crónicas en el 30-40% de la población pediátrica con FQ; Una vez que las infecciones crónicas se establecen, son casi imposibles de eliminar1. Los aislados de P. aeruginosa de pacientes con infección temprana son generalmente más susceptibles a los antimicrobianos, por lo tanto, estos se tratan con antibióticos antipseudomonales para prevenir el establecimiento de infección crónica2. Desafortunadamente, no todos los aislados de P. aeruginosa se eliminan eficazmente del pulmón después de la terapia con antibióticos. Los mecanismos precisos asociados con el fracaso de los antibióticos no se han dilucidado por completo. Estudios previos han demostrado que las variaciones en la densidad celular de la biopelícula, la agregación y la producción de polisacáridos puedenafectar la eficacia de los antibióticos. P. aeruginosa produce tres polisacáridos extracelulares: Pel, Psl y alginato4. La mayoría de las cepas de P. aeruginosa tienen la capacidad genética de expresar cada uno de los exopolisacáridos, aunque a menudo un tipo de polisacárido se expresa predominantemente5. El alginato de exopolisacárido se asocia con infecciones crónicas en el pulmón de FQ, lo que resulta en un fenotipo mucoide 6,7. Los polisacáridos Pel y Psl tienen múltiples funciones, entre ellas ayudar a la unión inicial y al mantenimiento de la estructura de la biopelícula, y conferir resistencia a los antibióticos8.
Se han desarrollado métodos dirigidos a visualizar in vivo las estructuras de los tejidos para una variedad de tipos de muestras 9,10,11. Más recientemente, se han adaptado para visualizar las comunidades microbianas in vivo dentro del esputo de pacientes con FQ12. La optimización de un protocolo de limpieza de tejidos específicamente para la identificación de comunidades microbianas dentro del esputo fue desarrollada por DePas et al., 201612. El término MiPACT, que significa identificación microbial idespués de la tecnología de la LERA de Pa sive,se acuñó para la eliminación del esputo de FQ 11,12. En el caso de las técnicas de limpieza de tejidos, las muestras se fijan primero y luego se vuelven transparentes, dejando intacta su arquitectura inherente para la tinción y la visualización microscópica11. La fijación y eliminación de muestras de esputo de FQ permite a los investigadores responder preguntas relacionadas con la estructura de la biopelícula, la densidad celular bacteriana, las asociaciones polimicrobianas y las asociaciones entre patógenos y células huésped. La ventaja de examinar directamente las bacterias que se han conservado dentro del esputo es que pueden analizarse y visualizarse en un contexto específico del huésped. Aunque el crecimiento in vitro de aislados clínicos en el laboratorio para la experimentación puede ser muy informativo, estos métodos no pueden recrear completamente el entorno pulmonar de la FQ, lo que resulta en una desconexión entre los resultados de laboratorio y los resultados de los pacientes.
Los métodos presentados aquí se pueden utilizar para fijar y eliminar el esputo para visualizar las bacterias, ya sea de pacientes con FQ o pacientes con otras infecciones respiratorias. El tipo específico de tinción y análisis microscópico descrito en este documento es la hibridación fluorescente in situ (FISH), seguida de la unión anti-Psl-anticuerpo dentro del hidrogel y el análisis posterior mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Después de la limpieza de tejidos, también se pueden aplicar otros métodos de inmunohistoquímica y microscopía.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida 29:1 Bisacrilamida, solución al 30 %</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 8 cámaras Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de perfusión Coverwell</td><td>Electrónica Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnasa Inhibidor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Detalles del pedido: Producto: Oligo de ADN modificado; Nombre: PseaerA; Secuencia: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Síntesis: 50 nmol; Purificación: HPLC; Estado del barco: Producción completa (seco)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Los anticuerpos rojos Psl0096-Texas fueron un regalo amablemente proporcionado por Medimmune y se debe contactar a la empresa para consultas sobre pedidos.</td></tr><tr><td>VA-044 Endurecedor</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

La detección temprana y la erradicación de Pseudomonas aeruginosa en los pulmones de los pacientes con fibrosis quística pueden reducir la posibilidad de desarrollar una infección crónica. El desarrollo de infecciones crónicas por P. aeruginosa se asocia con una disminución de la función pulmonar y un aumento de la morbilidad. Por lo tanto, existe un gran interés en dilucidar las razones del fracaso en la erradicación de P. aeruginosa con terapia antibiótica que ocurre en aproximadamente el 10-40% de los pacientes pediátricos. Uno de los muchos factores que pueden afectar la eliminación del huésped de P. aeruginosa y la susceptibilidad a los antibióticos son las variaciones en la organización espacial (como la agregación o la formación de biopelículas) y la producción de polisacáridos. Por lo tanto, nos interesaba visualizar las características in situ de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Se aplicó una técnica de limpieza de tejidos a las muestras de esputo después de incrustar las muestras en una matriz de hidrogel para retener las estructuras 3D relativas a las células huésped. Después de la limpieza del tejido, se agregaron etiquetas fluorescentes y colorantes para permitir la visualización. Se realizó hibridación fluorescente in situ para la visualización de células bacterianas, unión de anticuerpos anti-Psl marcados con fluorescencia para la visualización del exopolisacárido y tinción de DAPI para teñir las células huésped para obtener información estructural. Estos métodos permitieron obtener imágenes de alta resolución de P. aeruginosa dentro del esputo de pacientes con FQ mediante microscopía de barrido láser confocal.

El diseño general del experimento se resume en la Figura 1 y la Figura 2. La Figura 1 proporciona un resumen de los protocolos de procesamiento y eliminación del esputo. El procesamiento y la eliminación del esputo pueden tardar hasta 17 días. Sin embargo, el protocolo puede detenerse y las muestras se pueden almacenar después de la fijación con PFA (día 2) o después de la limpieza del tejido (días 5-17 dependiendo del tiempo de lim...

Este protocolo proporciona métodos para la visualización de células bacterianas y polisacáridos del locus de síntesis de polisacáridos (Psl) dentro del esputo de pacientes con fibrosis quística.

Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Este protocolo es significativo porque permite la visualización directa de Pseudomonas aeruginosa y el exopolisacárido Psl dentro del esputo de fibrosis quística. Esta técnica ayuda a responder preguntas sobre cómo la organización espacial de P. aeruginosa, como la agregación o las biopelículas, afecta la eliminación del huésped y la susceptibilidad a los antimicrobianos. Almacene el esputo expectorado en un recipiente de recolección estéril a cuatro grados centígrados durante un máximo de 24 horas antes de la fijación.Cuando esté listo para fijar las muestras, transfiéralas a un tubo estéril de 15 mililitros y agregue un volumen igual de 4% de PFA, luego incube el esputo durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las muestras agregando cinco mililitros de PBS por cada dos mililitros de esputo fijo. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y repita el lavado dos veces más.Vuelva a suspender el pellet en el doble del volumen de PBS con azida de sodio al 0,01% y guárdelo a cuatro grados centígrados. Agregue dos mililitros de una solución de acrilamida/bisacrilamida al 30%29 en un tubo de tres mililitros con la tapa quitada dentro de un recipiente anaeróbico sellado, luego agregue 0.5 gramos de endurecedor a dos mililitros de PBS en un tubo de tres mililitros. Deje la tapa fuera del tubo y guárdela en el recipiente anaeróbico sellado.Deje unos mililitros de PBS estéril en el tubo sin la tapa dentro del recipiente anaeróbico. Desgasifique los componentes del hidrogel en el recipiente sellado con un paquete anaeróbico durante 72 horas. Hacer una solución de 2,5 mililitros de hidrogel con una concentración final de 0,2% de endurecedor y 4% de acrilamida/bisacrilamida en PBS en un tubo de 15 mililitros, y mezclar el hidrogel por inversión, luego filtrar y esterilizar la solución.Corte las muestras de esputo en dos secciones pequeñas con un bisturí, luego coloque cada muestra en un pocillo de un portaobjetos de vidrio cubierto de ocho cámaras. Agregue 300 microlitros de la solución de hidrogel esterilizada con filtro a cada pocillo que contenga esputo y colóquelo dentro de un recipiente sellado con un paquete anaeróbico durante tres horas a 37 grados centígrados. Transfiera las muestras de esputo de hidrogel solidificado a un tubo de cultivo de 15 mililitros con cinco mililitros de SDS al 8% a pH ocho, y deje que las muestras se aclaren durante tres a 14 días a 37 grados Celsius hasta que el esputo se vuelva transparente.Use pinzas estériles para transferir cada muestra incrustada en hidrogel a un tubo cónico de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de PBS para lavar el hidrogel. Deje reposar la solución durante 30 a 60 minutos antes de decantar, luego repita el lavado dos veces más. Almacene las muestras lavadas en PBS con azida de sodio al 0,01% e inhibidor de ARNasa a cuatro grados centígrados.Retire las muestras de hidrogel de su solución de almacenamiento y colóquelas sobre una superficie estéril. Use un bisturí estéril para cortar los hidrogeles en rodajas de aproximadamente un milímetro de grosor y coloque las secciones en tubos de 1,5 mililitros. Prepare un mililitro de tampón de hibridación en un tubo de 1,5 mililitros, luego agregue la sonda A Seer marcada con fluorescencia y mezcle por inversión.Agregue de 200 a 500 microlitros de tampón de hibridación a cada sección, asegurándose de que la totalidad de la muestra de hidrogel esté sumergida. Permita que la sonda A de Seer se hibrida con las muestras de hidrogel colocándolas en la oscuridad durante aproximadamente 18 a 24 horas a 46 grados Celsius sin agitar, luego agregue un mililitro de tampón de lavado fresco a los tubos e incubelos en la oscuridad durante seis horas a 48 grados Celsius. Agregue 500 microlitros de 2% de BSA y PBS a las muestras de hidrogel para bloquear la unión de proteínas no específicas, luego incube las muestras durante la noche en la oscuridad.Al día siguiente, prepare la solución de anticuerpos Psl0096-Texas Red diluyendo el anticuerpo hasta una concentración final de 0,112 microgramos por mililitro en 500 microlitros de BSA fresco al 2% en PBS. Agregue la solución de anticuerpos a las muestras de hidrogel e incube en la oscuridad durante seis horas. A continuación, tiñe las muestras de hidrogel con DAPI incubándolas con 250 microlitros de solución de RIM y 10 microgramos por mililitro de DAPI durante la noche en la oscuridad agitando suavemente.Después de la tinción, monte las muestras en cámaras de perfusión de 0,9 o 1,7 milímetros y séllelas con un cubreobjetos de vidrio. Realice microscopía de escaneo láser confocal con aumentos de 25, 40, 63 o 100 veces. Este protocolo se utilizó para obtener las imágenes 3D de alta resolución de las células de P. aeruginosa y su estructura NC2 dentro del esputo.Aquí se muestra un agregado de células dentro de una muestra de esputo. Las formas individuales de los bastones se observaron en verde a partir de la unión específica de la especie de la sonda Seer A-488 a las células de P. aeruginosa. El anticuerpo Psl0096-Texas Red muestra que el exopolisacárido pseudomonal dentro del esputo se superponía principalmente con las células de P. aeruginosa.Este método también se utilizó para la visualización de células pseudomonales dentro del esputo en relación con otras células bacterianas y estructuras del huésped. Se observó que un grupo de células de P. aeruginosa fagocitaba dentro de una célula eucariota, mientras que en las proximidades se observaron otros pequeños grupos de células cócdicas. También se demostró que el anticuerpo PSL 0096 podía unirse a la PSL producida a partir del planctónico P.Aeruginosa.La principal ventaja de esta técnica es que implementa un enfoque de limpieza de tejidos seguido de hibridación fluorescente in situ, tinción de anticuerpos y microscopía confocal. Esto permite a los investigadores visualizar y utilizar técnicas de procesamiento de imágenes para medir cuantitativamente las diferencias en las estructuras de colonización de P. aeruginosa dentro del esputo de FQ en relación con los resultados de salud de los pacientes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Fuente: Beaudoin, T., et al. Visualización de los efectos del esputo en el desarrollo de biofilm utilizando un modelo de coverglass con cámara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra un método in vitro para evaluar cómo la fibrosis quística derivada del paciente influye en la formación de biofilm bacteriano. Utilizando portaobjetos de cámara, tinción fluorescente y microscopía confocal, revela un mayor grosor, arquitectura alterada y una mayor biomasa viable en biofilms cultivados con esputo,...

Imagen confocal de biofilmes bacterianos inducidos por filtrados de esputo en pacientes con fibrosis quística

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

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Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

Este protocolo describe la visualización del desarrollo de biopelículas después de la exposición a factores del huésped utilizando un modelo de cámara de portaobjetos. Este modelo permite la visualización directa del desarrollo de la biopelícula, así como el análisis de los parámetros de la biopelícula mediante programas informáticos.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Este flujo de trabajo se puede utilizar para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizando un modelo ex vivo establecido de biopelícula bacteriana en los pulmones de individuos con fibrosis quística. El uso de este modelo podría mejorar la validez clínica de los ensayos de MBEC (concentración mínima de erradicación de biopelículas).

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El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

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El protocolo aquí demuestra un flujo de trabajo rápido y estandarizado de evaluación microbiológica rápida in situ (M-ROSE), que incluye tres pasos: fabricación de portaobjetos, tinción e interpretación. Este protocolo ayudará a los médicos a tomar decisiones clínicas rápidas.

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Aprende a visualizar Pseudomonas aeruginosa y el polisacárido Psl en esputo de pacientes con fibrosis quística mediante tinción fluorescente e hibridación in situ. Este protocolo permite estudiar la organización espacial bacteriana y su impacto en la susceptibilidad antimicrobiana.

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