Name: Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende a generar células neuronales sin modificación genética a partir de sangre periférica mediante señalización membrana-núcleo. Este método seguro permite obtener células pluripotentes no teratogénicas para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Dedicado a la memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Los autores están especialmente agradecidos a José Manuel García-Verdugo y Vicente Herranz-Pérez por realizar experimentos y análisis em en el Laboratorio de Neurobiología Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, CIBERNED, Valencia, España, que fue apoyado por la financiación de la investigación de la Beca Prometeo para grupos de investigación de excelencia PROMETEO/2019/075. El resto de este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.

Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMNCs)
<ol><li>Asegúrese de que todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de conformidad con las directrices institucionales.</li>
	<li>Tome 30 mL de sangre de donantes sanos por personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.</li>
	<li>Aísle los PBMNCs por medios de gradiente de densidad. Utilizar 10 mL de medio con 25 mL de sangre 1:1 diluida con solución salina tampón de fosfato (PBS), y centrífuga a 300 x g durante 30 min.</li>
	<li>Aísle la capa de interfase entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lavar las células aisladas con 5 mL de PBS estéril y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Repetir dos veces.</li>
	<li>Cuente el número de celdas por métodos estándar utilizando una cámara de conteo.</li>
</ol>2. Activación de la glicoproteína GPI-anclada humana por el crosslinking del anticuerpo en la superficie de PBMNCs
<ol><li>Colocar las 6 x 106 células mononucleares (MNCs) en tubos de 15 mL y realizar la reticulación de anticuerpos incubando las células con anticuerpos específicos de proteínas de membrana ligadas a GPI humanos (30 μg/mL) durante 30 min en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a 37 °C.</li>
	<li>Reemplace el medio de incubación con el medio modificado de Dulbecco de Iscove complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS).</li>
	<li>Cultivar las células en tubos de poliestireno de 15 mL, poner los tubos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 8-10 días (sin agitar). En D5, agregue 1-2 mL adicionales del medio de Iscove complementado con FBS al 10% a cada tubo de 15 mL.</li>
</ol>3. Clasificación de celdas desdiferenciadas recién generadas
<ol><li>Cuente las células con un contador automatizado de la célula (suspensión de la célula de 18 μL + tinte de la fluorescencia del 2μL) o en un compartimiento de la cuenta.</li>
	<li>Centrífuga cultivada suspensión celular (5-7 x 106) a 300 x g durante 10 min y aspirar el sobrenadante resultante con una pipeta Pasteur estéril.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet celular en 90 μL de PBS preenfriado pH 7,2, BSA al 0,5% y EDTA de 2 mM.</li>
	<li>Añadir cd45 positivo nano-tamaño magnético perlas (80 μL) a la suspensión de la célula e incubar en el hielo durante 15 min.</li>
	<li>Lave las células agregando 2 mL de tampón de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PBS.</li>
	<li>Lave la columna con 500 μL de tampón PBS preenfriado y colócalo en el campo magnético.</li>
	<li>Coloque la suspensión celular en la columna y lávela con 500 μL de tampón PBS (dos veces) y el flujo de centrífuga que contiene células CD45 negativas. Recogerlos en el medio de Iscove complementado con 1% BSA.</li>
	<li>Cuente las celdas de la cámara de recuento.</li>
</ol>4. Preparación de platos de cultivo celular para la diferenciación neuronal de células madre recién generadas
<ol><li>Recubre los vasos de cultivo con poli-L-ornitina y laminina para el crecimiento de las células neuronales.</li>
	<li>Coloque las tapas de vidrio en placas de 4 pocillos y recuérdelo con 1:5 diluida poli-L-ornitina (0,1 mg/mL en ddH2O) en ddH2O. Coloque los cubrebocas en una incubadora de 37 °C durante 1 h. Luego lavar con ddH2O.</li>
	<li>Descongelar lentamente laminina (0.5-2.0 mg /mL) y añadir a la parte superior de las cubiertas. Incubarlo a 37 °C durante 2 h.</li>
	<li>Preparar el medio de inducción neuronal N2 consistente en 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento de N2, 400 μL de aminoácidos no esenciales (NEAA), solución básica de FGF a 20 ng/mL de concentración final (preparada a partir de 100 μg/mL de solución madre) y heparina a 2 ng/mL de concentración final.</li>
	<li>Eliminar el exceso de laminina por pipeteo y añadir el medio neuronal N2 a los platos de cultivo.</li>
</ol>5. Cultivo de células sanguíneas desdiferenciadas neuronales
<ol><li>Cultivo de células CD45 derivadas de BD en cubiertas de vidrio recubiertas de laminina /ornitina durante 2 días en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 en medio N2 para iniciar una diferenciación neuronal de las células recién generadas por BD.</li>
	<li>Cultivar células más a fondo en medio de diferenciación neuronal consistente en 48 mL de medio neurobasal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de ANEAA, 50 μL de factor neurotrófico derivado de glial humano recombinante (GDNF) a 5 μg/250 μL en PBS/0,1% BSA, y 50 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro humano recombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL en PBS/0,1% BSA y 50 μL de solución de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL en PBS. Colocar las placas en una incubadora a 37 °C y al 5% deCO2.</li>
</ol>6. Análisis de microscopía de inmunofluorescencia de células neurales derivadas de la sangre
<ol><li>Cultíe las células como se describió anteriormente durante 16 días y retire los medios.<ol>
<li>Incubar con fijador precalentado consistente en 75 mL de agua estéril, 4 g de paraformacionaldehído. Agregue 10 N NaOH según sea necesario y revuelva hasta que la solución se aclare. A continuación, añadir 10 mL de 10x PBS, 0,5 mL de MgCl2, 2 mL de 0,5 M EGTA, y 4 g de sacarosa. Valorar a pH 7,4 con 6 N HCl, y llevar a 100 mL de agua estéril durante 15 min, según Marchenko et al.7.</li>
		<li>Deseche el fijador y lave las células 3 veces durante 5 min cada vez. Inmediatamente añadir una solución X de Tritón recién hecha al 0,3% y permeabilizar las células durante 5 min. Lavar 3 veces con PBS y añadir una solución de bloqueo hecha por PBS y 5% BSA.</li>
		<li>Bloquee las celdas a temperatura ambiente en una placa basora durante 1 hora.</li>
		<li>Preparar la dilución adecuada de anticuerpos en BSA/PBS al 1% e incubar las células con diluciones de anticuerpos en placa basculante durante 1,5 h a temperatura ambiente. Lave las células 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, incube las células con DAPI y monte las cubiertas con medios de montaje para su visualización en un microscopio. NOTA: Los anticuerpos etiquetados directamente utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análisis de microscopía electrónica de transmisión de células recién generadas
<ol><li>Sembra las células para TEM en portaobjetos de cámara de 8 pozos.</li>
	<li>Fijar las células en glutaraldehído al 3,5% durante 1 h a 37 °C, post-fijar en 2% OsO4 durante una hora adicional a temperatura ambiente y manchar en acetato de uranilo al 2% en la oscuridad a 4 °C durante 2 h 30 min.</li>
	<li>Finalmente, enjuague las células en agua destilada, deshidrate en etanol e incruste en resina epoxi durante la noche. Al día siguiente transferir las muestras a un horno de 70 °C durante 72 h para el endurecimiento de la resina.</li>
	<li>Suelte los cultivos celulares incrustados de la diapositiva de la cámara y pegue a los bloques de aralditar.</li>
	<li>Corte las secciones semidelgadas en serie (1,5 μm) con una máquina, monte en portaobjetos de vidrio y filtre ligeramente con azul toluidina al 1%.</li>
	<li>Pegue las secciones semidelgadas seleccionadas a bloques de aralditar y desprenda del portaobjetos de vidrio mediante la congelación repetida (en nitrógeno líquido) y la descongelación.</li>
	<li>Preparar secciones ultratinas (0.06-0.08 μm) con una máquina y contrastar aún más con citrato de plomo.</li>
	<li>Obtenga micrografías utilizando microscopio de barrido electrónico con cámara digital.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

La autora correspondiente declara que es titular de una patente relacionada con Novel Human GPI-linked Protein, así como que cofundó y trabaja para ACA CELL Biotech. Los otros autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

El método no-GM de reprogramación de células humanas descritas en este trabajo se basa en la activación de membrana a núcleo de la maquinaria de señalización detrás de la glicoproteína de membrana humana ligada a GPI que inicia el proceso de desdiferenciación que conduce a la generación ex vivo y la expansión de pscs autorrenuevas obtenidos de sangre periférica humana no manipulada. Estas células cuando se cultivan en medios apropiados son capaces de re-diferenciación en células pertenecientes a diferentes capas...

El desarrollo de métodos básicos y preclínicos de investigación con células madre fomenta la aplicación clínica de terapias basadas en células madre para enfermedades neurológicas. Tal terapia potencial depende críticamente del método para la generación de células neuronales humanas que conducen a la recuperación funcional1.
Las células madre neurales (NSCs) se auto-renuevan y se diferencian en nuevas neuronas a lo largo de la vida en un proceso llamado neurogénesis adulta. Sólo las áreas cerebrales muy restringidas albergan NSCs competentes para generar neuronas recién nacidas en la edad adulta. Tales NSCs pueden dar lugar a las neuronas maduras, que están implicadas en el aprendizaje y la memoria, substituyendo así las neuronas perdidas o dañadas. Desafortunadamente, estos NSCs están presentes en cantidades restringidas y esta neurogénesis limitada disminuye rápidamente durante el desarrollo juvenil2. Por lo tanto, otras fuentes de células neurales deben considerarse en un objetivo de terapia celular.
Las enfermedades neurológicas degenerativas son difíciles de curar usando acercamientos farmacológicos estándar. Las nuevas estrategias terapéuticas para abrazar muchos desordenes neurológicos inmédicos se basan en terapias del reemplazo de la célula del tejido enfermo y dañado. El trasplante de NSC podría reemplazar las células dañadas y proporcionar efectos beneficiosos. Otras fuentes para el reemplazo de células neuronales incluyen las células madre embrionarias humanas (ESC), que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos de mamíferos3,así como los iPSCs4,que tienen una amplia capacidad de autorre renovación como los CES y son capaces de diferenciarse en varios linajes celulares. Los NSC también pueden generarse mediante reprogramación directa de fibroblastos humanos evitando el estado pluripotente5.
La terapia de reemplazo celular sigue siendo un problema desafiante. Aunque esc, fetal, o iPS puede ser una fuente para la generación de células neuronales para el tratamiento de muchas enfermedades neurológicas incurables, el reemplazo de células de SCs adultos autólogos de tejidos dañados es una mejor alternativa que elude las preocupaciones inmunológicas, éticas y de seguridad.
La activación de la proteína humana ligada al GPI mediante reticulación de anticuerpos a través de la fosforilación de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia una desdiferenciación de las células progenitoras sanguíneas y la generación de células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSCs)6. Estas células se diferencian in vitro hacia las células neuronales según lo confirmado por medio de brightfield, inmunofluorescencia y análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM).
En este trabajo se describe la generación libre de GM de BD-PSCs y su exitosa re-diferenciación en células con fenotipo neuronal.

<table><tbody><tr><td>Fracción de albúmina V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFAP Cy3 conjugado</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Kit de viabilidad celular</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym descatalogado. El producto fabricado por Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico 2-fosfato sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Sin suero 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Solución básica de FGF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC medios de</td><td>gradiente de densidad</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>perlas magnéticas de tamaño nanométrico</td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym descatalogado. El producto fabricado por Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>resina epoxi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Descatalogado. Disponible en: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF humano recombinante</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Grado de glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Célula de heparina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>BDNF humano</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Ratón de laminina</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Contador de células automatizado</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym descontinuado. El producto fabricado por Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada cámara digital Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generación libre de gm de células neuronales derivadas de la sangre

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Muchos trastornos neurológicos humanos son causados por la degeneración de las neuronas y las células gliales en el cerebro. Debido a las limitaciones en las estrategias farmacológicas y otras estrategias terapéuticas, actualmente no hay cura disponible para el cerebro lesionado o enfermo. El reemplazo celular aparece como una estrategia terapéutica prometedora para las condiciones neurodegenerativas. Hasta el día de hoy, las células madre neurales (NSC) se han generado con éxito a partir de tejidos fetales, células embrionarias humanas (CE) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Un proceso de desdiferenciación se inició por la activación de la nueva glicoproteína humana ligada a GPI, que conduce a la generación de células madre pluripotentes. Estas células madres pluripotentes sangre-derivadas (BD-PSCs) diferencian in vitro en las células con un fenotipo de los nervios según lo mostrado por microscopia del brightfield y de la inmunofluorescencia. El análisis ultraestructural de estas células por medio de microscopía electrónica confirma su estructura primitiva así como neuronal-como morfología y características subcelulares.

Los resultados proporcionan evidencia de que este nuevo método libre de GM es capaz de revertir las células progenitoras sanguíneas a su estado más primitivo sin actuar directamente sobre el genoma humano.
Hemos demostrado previamente que la reticulación de anticuerpos específicos de proteínas ligadas a GPI se inicia a través de PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN regulación al alza de genes altamente conservados y relevantes para el desarrollo como WNT, NOTCH y C-Kit, iniciando así un proceso de...

Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.

Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

La importancia del protocolo se basa en la señalización de membrana a núcleo y no afecta directamente al genoma, como es el caso de las células madre pluripotentes inducidas. La naturaleza no teratógena de las células madre pluripotentes derivadas de la sangre es la principal ventaja de la técnica, por lo que es adecuada para una aplicación clínica segura en diversos campos de la medicina regenerativa. Demostrando el procedimiento está la Dra. Anne-Kathrin Schott, líder del proyecto, y Oksana Greenacre, una asistente de laboratorio en mi laboratorio.Para aislar los PBMNCs, agregue 25 mililitros de sangre uno a uno diluida con PBS a 10 mililitros de medios de gradiente de densidad y centrifume la mezcla a 300 veces G durante 30 minutos. Aísle la capa de interfaz entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lave las células aisladas con cinco mililitros de PBS estéril y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos.Después de repetir el procedimiento dos veces, cuente el número de celdas usando una cámara de conteo. Agregue 6 por 10 a las 6tas células mononucleares a un tubo de 15 mililitros, luego realice la reticulación de anticuerpos agregando anticuerpos es

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Este video muestra una técnica para generar células neuronales a partir de células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSC). Las BD-PSCs se obtienen a través de la reprogramación de las células progenitoras de la sangre. Las BD-PSC indiferenciadas se cultivan en cubreobjetos recubiertos de sustrato de cultivo celular utilizando un medio de inducción neural y un medio de diferenciación neuronal, lo que desencadena la diferenciación en células con un fenotipo neuronal.

Generación de células neuronales a partir de células madre pluripotentes derivadas de la sangre

El video muestra la generación de neuronas a partir de fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDF). Los aHDFs se reprograman utilizando un vector lentiviral portador de genes para factores de transcripción neuronal y ARN de horquilla corta (shRNAs). Los shRNAs inhiben la expresión de un represor transcripcional neuronal, y los factores de transcripción neuronal activan genes para diferenciar las aHDFs en neuronas. Estas aHDFs reprogramadas se cultivan en un medio de conversión neuronal...

Generación de neuronas mediante la reprogramación de células de fibroblastos dérmicos humanos

Fuente: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Generación libre de transgénicos de células neuronales derivadas de la sangre. J. Vis. Exp. (2021)El video muestra un protocolo para preparar células neuronales derivadas de células de sangre periférica reprogramadas para microscopía de fluorescencia, mostrando distintos tipos de células y etapas de desarrollo a través de imágenes de inmunofluorescencia.

Microscopía de inmunofluorescencia de células neurales diferenciadas de células derivadas de sangre periférica 

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Este artículo describe un protocolo para la generación de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos en un biorreactor de suspensión 3D de sobremesa.

Producción de neuronas humanas inducibles por neurogenina 2 en un biorreactor de suspensión tridimensional

Este estudio delinea un enfoque novedoso para el establecimiento de células similares a la microglía (iMG) derivadas de monocitos humanos que permiten la evaluación indirecta de la inflamación cerebral. Esto presenta un modelo celular que puede ser beneficioso para la investigación centrada en la posible inflamación del cerebro y los trastornos neuropsiquiátricos asociados.

Ingeniería de células similares a la microglía inducidas por sangre humana para la investigación traslacional inversa del cerebro

Aprende a generar células neuronales sin modificación genética a partir de sangre periférica mediante señalización membrana-núcleo. Este método seguro permite obtener células pluripotentes no teratogénicas para aplicaciones en medicina regenerativa.

Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre

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