Name: Implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende a establecer un modelo farmacológico de distonía DYT/PARK-ATP1A3 en ratones mediante bombas osmóticas y cánulas cerebrales. Este método permite estudiar interacciones gen-ambiente en trastornos del movimiento.

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF DysTract to C.W.I.) y por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad de Wurzburgo (Z2-CSP3 a L.R.). Los autores agradecen a Louisa Frie, Keali Róhm, Veronika Senger y Heike Menzel y por su asistencia técnica, así como a Helga Brinner para el cuidado de los animales.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las directrices internacionales, nacionales y/o institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. Las autoridades locales del Regierung von Unterfranken, Wurzburgo, Alemania, aprobaron todos los experimentos con animales.
1. Priming de bombas osmóticas
NOTA: Este paso debe realizarse al menos 48 horas antes de la cirugía. Las bombas osmóticas ALZET deben rellenarse previamente para garantizar que la velocidad de bombeo alcance un estado estable antes de la implantación.
<ol><li>Prepare previamente la solución deseada para la perfusión crónica. Asegúrese de que el disolvente y el agente sean compatibles con las bombas osmóticas y los catéteres. Para el proyecto en el presente documento, descongele una solución de 10x en stock de ouabain (almacenada a -20 oC) a temperatura ambiente y vórtice durante 10 s. ADVERTENCIA: Ouabain es tóxico: debe manipularse únicamente con guantes y abrirse solo bajo una capucha estéril para evitar la inhalación.</li>
	<li>Encienda la capucha estéril; desinfectar la campana, así como todos los instrumentos y material necesarios antes de ponerlos bajo el capó.</li>
	<li>Póngase guantes quirúrgicos antes de manipular las bombas osmóticas. Preparar por separado la solución de ouabain designada para las bombas del estriado y el cerebelo. NOTA: Tenga en cuenta que la concentración de la solución en la bomba para el estriado debe duplicarse en comparación con la concentración de la solución en la bomba designada para el cerebelo. Esto se debe al hecho de que la bomba para el estriado está conectada a una cánula doble, el caudal, sin embargo, es el mismo que para la bomba del cerebelo, que está conectado a una sola cánula.</li>
	<li>Calcule la cantidad de solución necesaria utilizando la siguiente fórmula: Tipo de entrega en masa (ko) - tasa de entrega de volumen (Q) x concentración del agente en el vehículo (Cd) Para el presente proyecto, las bombas osmóticas se prepararon y llenaron con solución de ouabain a una concentración de 11,2 ng/h o 0,9% de solución salina para el grupo de control.</li>
	<li>Vortex ambas soluciones de ouabain para 10 s y filtro estéril (es decir, filtro de extremo de jeringa de 0,22 m) en tubos de microcentrífuga nuevos separados, utilizando un filtro diferente para cada solución.</li>
	<li>Pesar las bombas osmóticas vacías junto con el moderador de flujo (aproximadamente 0,4 g).</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 ml con una cánula de llenado de 27 G (preferiblemente con una punta contundente) con solución estéril de ouabain filtrada o solución para vehículos.</li>
	<li>Saque todas las burbujas de aire de la jeringa, sostenga la bomba osmótica en posición vertical, inserte la cánula hasta el final en la bomba y llene lentamente el depósito hasta que aparezca un exceso de solución en la parte superior (evitar el llenado rápido, ya que esto puede provocar burbujas de aire en la bomba). A continuación, inserte el moderador de flujo en la bomba (el exceso de solución debe aparecer en la parte superior).</li>
	<li>Tire del moderador de flujo (alrededor de 5 mm), quite cuidadosamente la brida blanca con tijeras y conecte un trozo de tubo de vinilo al moderador de flujo. Asegúrese de que el catéter tenga una longitud de aproximadamente 2 cm para permitir la movilidad adecuada del animal.</li>
	<li>Pesar la bomba osmótica llena una vez más para asegurarse de que la diferencia de peso entre la bomba llena y vacía es concordante con el peso esperado de la solución cargada. NOTA: Para la mayoría de las soluciones acuosas, este peso es igual al volumen de las microlitros. Si el peso no se corresponde con el volumen esperado, el aire podría quedar atrapado dentro de la bomba, que necesita ser vaciado y rellenado.</li>
	<li>Para el cebado de las bombas, prepare dos tubos de microcentrífuga de 2 ml, un tubo para el estriado y otro para el cerebelo.</li>
	<li>Sumerja las bombas en los tubos de microcentrífugas llenos a mitad de camino con una solución salina del 0,9%. No sumerja el extremo abierto del catéter. Coloque los tubos de microcentrífuga en un termociclador durante 48 h a 37 oC para garantizar que la bomba haya alcanzado una velocidad de bombeo constante antes de la implantación y que los catéteres estén precargados.</li>
</ol>2. Implantación de cánulas y bombas osmóticas
<ol><li>Colocar el ratón (masculino, C57Bl/6N, 11-12 semanas de edad) en una cámara diseñada para la anestesia por inhalación; establecer el caudal de isoflurano en 2-3% y el caudal de oxígeno a 2 L/min.</li>
	<li>Después de que el ratón está profundamente anestesiado de acuerdo con los protocolos aprobados, afeitar la parte superior de la cabeza del animal, cuello dorsal y tercio proximal de la espalda.</li>
	<li>Colocar el animal en un marco estereotáctico y continuar la anestesia con isoflurano a través de una máscara de anestesia de ratón diseñada para el instrumento estereotáctico (tasa de flujo de isoflurano 1.5-2%, 2 L/min de oxígeno).</li>
	<li>Usando puntas de goma o barras de orejas no de ruptura, fija la cabeza del animal en el marco estereotáctico, teniendo cuidado de que la cabeza esté nivelada.</li>
	<li>Para evitar la hipotermia, coloque una almohadilla de calentamiento debajo del animal, inserte una sonda de temperatura rectal y ajuste la temperatura a 37 oC. Proteja los ojos del animal de secarse usando una gota de pomada oftálmica en cada ojo.</li>
	<li>Aplicar un analgésico, como carprofeno (5 mg/kg de peso corporal), por vía subcutánea antes de comenzar la cirugía.</li>
	<li>Con una jeringa inyectar por vía subcutánea hasta 0,2 ml de bupivacaína 0,25% y esperar 30 s para que la anestesia local surta efecto.</li>
	<li>Desinfectar bien las áreas afeitadas con un antiséptico, como dihidrocloruro de octenidina.</li>
	<li>Después de una desinfección exhaustiva del área quirúrgica, utilice un bisturí para colocar una incisión en la parte superior de la cabeza y use tijeras para continuar la incisión hasta las extremidades delanteras. Exponga el cráneo con la ayuda de abrazaderas de bulldog y limpie el periosteum con un aplicador estéril con punta de algodón.</li>
	<li>Alinee un bolígrafo o la punta de una cánula teñida de tinta negra con bregma y utilice las coordenadas adecuadas para marcar los tres puntos de entrada de las cánulas cerebrales en el cráneo (coordenadas para los orificios bilaterales necesarios para la perfusión de los ganglios basales: anterior/posterior: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1.50 mm (+ indicando el lado derecho, - el lado izquierdo en relación con bregma); coordenadas para el agujero en la línea media del cerebelo: anterior/posterior: - 6.90 mm). A continuación, taladre cuidadosamente los orificios para la doble cánula designada para los ganglios basales y la cánula única designada para el cerebelo (Figura 1A).</li>
	<li>Taladre un cuarto agujero para un pequeño tornillo entre el estriado y el cerebelo. Este tornillo eventualmente se incrustará en el cemento dental y proporcionará sujeción adicional para las cánulas. Usando fórceps finos y un destornillador, introduzca cuidadosamente el tornillo en el agujero pequeño hasta que esté firmemente fijado en el cráneo. No implante el tornillo demasiado profundamente, ya que esto daña el tejido cerebral. NOTA: Se recomienda continuar con la implantación de la bomba osmótica antes de insertar las cánulas osmóticas. Esto evita causar daños accidentales a las cánulas al implantar las bombas.</li>
	<li>Con el fin de crear un pequeño bolsillo para la bomba osmótica en cada lado de los animales de la espalda, utilice fórceps de tejido para separar las capas de tejido subcutáneo. Avance los fórceps hacia una pata trasera y abra ligeramente los fórceps para ensanchar el bolsillo subcutáneo. Repita el mismo procedimiento para el otro lado, primero retirando los fórceps de la incisión y luego empujándolos suavemente hacia la segunda pata trasera. NOTA: El bolsillo debe permitir que la bomba se deslice fácilmente, sin embargo, no debe tener demasiado espacio para moverse debajo de la piel.</li>
	<li>Con la ayuda de fórceps de tejido tomar la primera bomba junto con la pieza conectada de tubo y deslizarlo en un bolsillo subcutáneo. Repita el mismo procedimiento con la segunda bomba.</li>
	<li>Usando un soporte de minibomp, introduzca una sola cánula osmótica con una longitud personalizada de 3,0 mm en el orificio perforado en la línea media del cerebelo. Separe el cabezal de la cánula con cuidado y fije la cánula, así como el pequeño tornillo con cemento dental, teniendo cuidado de no cubrir la pieza de conexión para el tubo de la bomba osmótica. Asegúrese de que el cemento dental que rodea la cánula se ha secado completamente antes de continuar con la cirugía.</li>
	<li>Antes de insertar una cánula doble con una distancia centro-centro de 3,0 mm y una longitud a medida de 4,0 mm en los orificios perforados bilateralmente por encima de los ganglios basales, adjunte dos trozos cortos de tubo de vinilo (0,5 cm) a las dos piezas de conexión de la cánula doble. Conecte los tubos de vinilo con un adaptador de bifurcación y rellene cuidadosamente todo el sistema de tubos, incluido el adaptador y la cánula con solución de ouabain o vehículo (temperatura ambiente, estéril filtrada previamente). Esto se puede hacer mejor con una jeringa de 1 ml y una cánula de llenado de 27 G introducida en el extremo trasero único del adaptador de bifurcación(Figura 1B).</li>
	<li>Con un soporte de minibomp, inserte cuidadosamente la cánula doble en los orificios bilaterales. Utilice una abrazadera para separar la cabeza de la cánula y fijar la cánula doble con cemento dental.</li>
	<li>Conecte los catéteres de las bombas osmóticas al adaptador de bifurcación, así como a la cánula única, respectivamente. Asegúrese de que los catéteres tengan una fuerte sujeción en los trozos de conexión de las cánulas. NOTA: Ambas bombas tienen un caudal igual, así que tenga cuidado de conectar la bomba osmótica con la solución doble concentrada al adaptador de bifurcación para asegurarse de que la misma concentración alcance tanto el ganglio basal como el cerebelo.</li>
	<li>Cerrar la incisión en la parte posterior de los animales con puntos de sutura en la medida de lo posible en la dirección del cráneo, teniendo cuidado de no estirar demasiado la piel(Figura 1C).</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea 0,5 ml de 0,9% de solución salina, que debe tener temperatura corporal, en un pliegue de la piel a cada lado de la parte posterior de los animales con el fin de evitar la deshidratación de los ratones, evitando cuidadosamente las bombas.</li>
</ol>3. Desafío del motor
<ol><li>Los ratones sujetos con problemas de ouabain o vehículos a tareas motoras desafiantes como una forma de exposición leve al estrés 4 h después de la cirugía y repetitivamente cada 24 h después con el fin de inducir movimientos similares a la distonía. Esto no incluye una caracterización del comportamiento; su propósito es inducir un mayor nivel de estrés en comparación con el mantenimiento normal de la jaula.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre un poste de madera de superficie rugosa de 50 cm con un diámetro de 1 cm, mirando hacia abajo. Asegúrese de que el poste se coloca en una jaula grande con suficiente ropa de cama en caso de caídas. No es necesario medir el tiempo de descenso, pero mirar hacia fuera para las hiperextensiones involuntarias de las extremidades delanteras y las extremidades posteriores presentadas por los animales perfundidos con ouabain mientras desciende el polo. Deje que los ratones desciendan el polo tres veces y permitan 2 minutos de recuperación entre los descensos. NOTA: Los ratones con perfusión de Ouabain deben presentar los primeros síntomas como bradiquinesia 4 h después de la cirugía. Sin embargo, 24 h después de la cirugía los ratones deben comenzar a presentar hiperextensiones involuntarias de las extremidades delanteras y las extremidades posteriores como un signo de movimientos similares a la distonía durante la descender.</li>
	<li>Para la segunda tarea motora, coloque los ratones en la varilla giratoria como se hace para la prueba de rendimiento de Rotarod. El aparato Rotarod no se utiliza como medida de la latencia a caer, el objetivo es someter a los ratones a la actividad forzada. Coloque los ratones en la varilla giratoria tres veces y permita 2 minutos de recuperación entre las pruebas. NOTA: Para aumentar la exposición al estrés, utilice un aparato Rotarod acelerado. Para el proyecto descrito en el presente documento, la varilla acelera de 5 a 50 rpm durante un período de tiempo establecido de 300 seg.</li>
	<li>Deje que los animales se recuperen durante 30 minutos entre la prueba de polo y la prueba de rendimiento de Rotarod y de nuevo otros 30 minutos antes de anotar para movimientos similares a la distonía como se describe en el paso de protocolo 4. Entre las exposiciones de tensión repetitivas, permita que los ratones se recuperen durante intervalos de 24 h.</li>
</ol>4. Sistemas de puntuación para la evaluación de movimientos similares a la distonía
NOTA: El experimentador debe estar cegado a la asignación de grupo analizada para evitar sesgos. Las pruebas conductuales utilizadas para caracterizar el fenotipo de los ratones son dos sistemas de puntuación: una escala de clasificación de distonía que califica movimientos anormales, movimientos similares a la distonía y una puntuación de comportamiento mediante la prueba de suspensión de la cola. Evaluar los movimientos similares a la distonía después de un tiempo de recuperación de 30 minutos después de la exposición al estrés leve.
<ol><li>Escala de clasificación de distonía NOTA: Debido a la falta de tareas de comportamiento predefinidas, la escala de clasificación de distonía se estableció como un sistema de puntuación basado en observadores similar a las escalas de calificación clínica de la distonía humana. Es una versión modificada de la escala de clasificación de distonía utilizada por Calderón et al.13.<ol>
<li>Registre la postura y la marcha de los animales durante un período de 4 minutos después de que los animales hayan sido colocados en una caja de plástico o madera.</li>
		<li>Puntuación para la frecuencia y distribución de movimientos similares a la distonía de 0 a 4 puntos: (0) comportamiento motor normal; (1) comportamiento motor anormal, sin movimientos similares a la distonía; (2) deterioro motor leve con movimientos focales leves similares a la distonía; (3) deterioro motor moderado con movimientos focales graves similares a la distonía; (4) deterioro grave, con movimientos sostenidos y generalizados similares a la distonía (Figura 2). Considera los siguientes movimientos o posturas como distonía: hiperextensión de las extremidades frontales, postura ancha o hiperextensión de las extremidades traseras, así como cifosis. Considere la distonía como focal en caso de que una sola parte del cuerpo se vea afectada y como generalizada en caso de que el tronco y al menos otras dos partes del cuerpo se vean afectados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de suspensión de cola NOTA: La prueba de suspensión de la cola se utiliza a menudo para observar y puntuar para el cierre de la extremidad posterior. Sin embargo, se trata de un fenotipo altamente inespecífico que indica una deficiencia motora. El siguiente protocolo propone un sistema de puntuación específico para movimientos similares a la distonía. Debido a la generalización de la distonía en pacientes con DYT/PARK-ATP1A3, los movimientos similares a la distonía deben evaluarse en las extremidades delanteras, tronco y extremidades posteriores. Se desarrolló un sistema de puntuación recién desarrollado de 0-8 puntos, una puntuación total < 2 indicó que no había movimientos similares a la distonía (Figura 3).<ol>
<li>Levante el ratón por la cola cerca de su base y levante al animal. Grabe un vídeo de 2 minutos de la prueba de suspensión de cola y asigne una puntuación en un análisis posterior y exhaustivo de la grabación.</li>
		<li>Puntuar las extremidades delanteras de 0 a 4 puntos, donde las retracciones tónicas repetidas o sostenidas de una o ambas extremidades delanteras, así como una hiperextensión combinada con el cruce de las extremidades delanteras, se clasificaron como distonía: (0) no hay movimientos anormales; (1) reducción del movimiento de las extremidades delanteras con hiperextensión de las patas observadas al 50% del tiempo registrado; (2) movimientos leves similares a la distonía de las extremidades delanteras < 50% del tiempo registrado; (3) movimientos leves similares a la distonía de las extremidades delanteras a 50% del tiempo registrado o graves < 50% del tiempo registrado; (4) movimientos graves similares a la distonía de las extremidades delanteras a 50% del tiempo registrado. NOTA: El cierre de hindlimb es un movimiento anormal que no debe ser puntuado como distonía.</li>
		<li>Puntuar las extremidades posteriores de 0 a 3 puntos, donde la retracción y el apretamiento de las extremidades traseras, así como la hiperextensión sostenida, se evaluaron como distonía: (0) no hay movimientos anormales; (1) reducción del movimiento de las extremidades posteriores con hiperextensión de las patas observadas al 50% del tiempo registrado; (2) movimientos similares a la distonía de una extremidad posterior; (3) movimientos similares a la distonía de ambas extremidades posteriores.</li>
		<li>En caso de distorsión truncal > 80% del tiempo registrado, se añade un punto adicional a la puntuación.</li>
		<li>Coloque al animal de nuevo en su jaula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Atp1a3+mutant+mice+as+a+model+of+rapid-onset+dystonia+with+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism.</a> Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).</li>
<li>Dang, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+Dyt1+DeltaGAG+knock-in+mouse+as+a+model+for+early-onset+dystonia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia.</a> Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).</li>
<li>Kreiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+in+genetic+models+of+neurodegeneration%3A+are+the+mice+better+than+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56(2015).</li>
<li>Albanese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenology+and+classification+of+dystonia%3A+a+consensus+update%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update.</a> Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).</li>
<li>Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomical+basis+of+symptomatic+hemidystonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The anatomical basis of symptomatic hemidystonia.</a> Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).</li>
<li>Carbon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensorimotor+network+activity+in+DYT1+dystonia%3A+a+functional+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study.</a> Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).</li>
<li>Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+metabolism+in+primary+torsion+dystonia%3A+effects+of+penetrance+and+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype.</a> Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).</li>
<li>de Carvalho Aguiar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B+-ATPase+alpha3+gene+ATP1A3+are+associated+with+rapid-onset+dystonia+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism.</a> Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).</li>
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<li>Barbano, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+triggers+and+non-motor+findings+in+a+family+with+rapid-onset+dystonia-parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).</li>
<li>Isaksen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia-induced+dystonia+and+abnormal+cerebellar+activity+in+a+mouse+model+with+a+single+disease-mutation+in+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump.</a> PLOS Genetics. 13 (5), 1006763(2017).</li>
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<li>Jinnah, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+agonists+and+dystonia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Calcium channel agonists and dystonia in the mouse.</a> Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).</li>
<li>Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+dopaminergic+dysregulation+and+dystonia-like+movements+induced+by+sensorimotor+stress+in+a+pharmacological+mouse+model+of+rapid-onset+dystonia-parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Experimental Neurology. 323, 113109(2020).</li>
<li>Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP+potentiates+3-nitropropionic+acid-induced+striatal+damage+in+mice%3A+reference+to+striatonigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).</li>
<li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+composite+phenotype+scoring+system+for+evaluating+mouse+models+of+cerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia.</a> Journal of Visualized Experiments. 39, 1787(2010).</li>
<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1a%2B%2F-+mice+develop+dystonia-like+movements+via+a+striatal+dopaminergic+dysregulation+triggered+by+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 108(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este modelo farmacológico farmacológico DYT/PARK-ATP1A3 permite el análisis detallado de los cambios estructurales y neuroquímicos intracerebrales inducidos únicamente por la inhibición de la bomba de iones de sodio-potasio en los ganglios basales y el cerebelo, así como alteraciones relacionadas con la exposición al estrés. En el caso de ratones, se puede implantar por vía subcutánea un máximo de dos bombas osmóticas. Aquí presentamos un método que detalla la administración crónica de fármacos a múltiples estructuras cerebrales mediante la implementación de una doble cánula conectada a un adaptador de bifurcación además de una sola cánula. Esta metodología se puede utilizar para cualquier aplicación que requiera múltiples estructuras cerebrales para ser perfundido simultáneamente y crónicamente.
Presentamos un modelo de ratón de un trastorno de movimiento raro, donde los pacientes desarrollan síntomas permanentes después de la exposición al estrés. Esta presunta interacción genético-ambiental todavía no se entiende bien, pero podría representar uno de los pathomecanismos clave en el desarrollo de DYT/PARK-ATP1A3. En el pasado se han publicado diferentes métodos de exposición de ratones al estrés que incluyen descargas eléctricas de pies, retención, ambiente frío o cálido y exposición a diversos olores11,,12,,13. En un esfuerzo por exponer a los ratones a un factor de estrés leve con valor traslacional, aquí describimos la sujeción repetitiva de ratones a tareas motoras desafiantes. Para la prueba de polos, los animales perfundidos con ouabain revelaron hiperextensión involuntaria de extremidades delanteras y extremidades traseras. Estos movimientos fueron muy similares a los movimientos similares a la distonía observados durante la grabación de vídeo de 4 minutos de los animales, así como la prueba de suspensión de la cola. La aplicación de estrés leve en forma de tareas motoras desafiantes podría resultar útil en otros modelos de ratón que muestran síntomas motores o neurodegeneración, donde las interacciones genoambien influyen masivamente en el grado de progresión de la enfermedad.
Hay una falta general de tareas de comportamiento predefinidas, así como escalas de clasificación para clasificar movimientos y posturas anormales en ratones. La mayoría de las tareas motoras disponibles revelan anomalías inespecíficas, como el cierre de la extremidad posterior, que es un fenómeno bien conocido en muchos modelos de ratón de trastornos del movimiento con neurodegeneración18,19. Sin embargo, para la caracterización adecuada de un fenotipo, es necesario analizar si el modelo de ratón recapitula las características más destacadas de la enfermedad. Aquí, presentamos la versión modificada de una escala de clasificación de distonía utilizada anteriormente para la evaluación de la discapacidad motora en los modelos de ratón de distonía15,,16. Además, desarrollamos un sistema de puntuación basado en observadores para la prueba de suspensión de cola, que se estableció de forma similar a las escalas de clasificación clínica de la distonía humana. Ambas escalas de clasificación muestran una puntuación significativamente más alta en ratones con infusifundidos con ouabain, estresados en comparación con los animales perfusores de ouabain, así como los animales con perfumo de vehículo. Los inconvenientes de cualquier sistema de puntuación basado en observadores son la formación necesaria de los calificadores para garantizar una puntuación coherente y reducir la variabilidad de los observadores, así como el peligro de un posible sesgo del calificador si no está completamente cegado al grupo analizado. Sin embargo, los sistemas de puntuación basados en observadores todavía presentan un método de fácil acceso para caracterizar un fenotipo y se pueden adaptar al modelo de ratón analizado, como se hace en el presente proyecto para la evaluación de movimientos similares a la distonía. Para garantizar una puntuación coherente entre los diferentes calificadores, los videos de capacitación deben estar disponibles. Para reducir cualquier sesgo potencial, se recomienda que los diferentes calificadores puntúan los mismos clips de vídeo y que se promedian las puntuaciones individuales. Ambos sistemas de puntuación mencionados en este trabajo registran la presencia de movimientos similares a la distonía en animales. Las escalas de clasificación se pueden adaptar de acuerdo con los requisitos específicos dentro de un proyecto, como se hizo anteriormente por Ip et al., donde únicamente las extremidades posteriores se puntuaron para movimientos similares a la distonía en un modelo de ratón para distonía 1 (DYT-TOR1A)20. Las escalas de clasificación pueden complementarse con otros sistemas de puntuación publicados anteriormente, evaluando, por ejemplo, el grado de bradiquinesia en roedores como se hace con la puntuación de discapacidad de la locomoción por Calderón et al.13.

Las ventajas de una entrega continua de medicamentos directamente en el cerebro son numerosas. Inyecciones repetitivas y frecuentes, que representan un factor de estrés innecesario para los animales, se puede evitar y se puede lograr una concentración intracerebral más constante de la droga. Esto es especialmente válido cuando los medicamentos administrados sistémicamente no logran penetrar fácilmente la barrera hematoencefálica. Por otra parte, la administración de fármacos crónicos a través de bombas osmóticas permite la entrega localizada de sustratos que de otro modo tendrían efectos secundarios en todo el sistema. Los fármacos pueden ser entregados de una manera dirigida a las estructuras cerebrales deseadas, el efecto resultante puede ser rastreado directamente. Esto se puede utilizar para una serie de aplicaciones, tales como el estudio de efectos terapéuticos, así como el estudio de los pathomecanismos. Esta última aplicación se utilizó en el proyecto aquí presente con el fin de crear un modelo de ratón farmacológico para la distonía.
El análisis y la comprensión de los síndromes distónicos, que representan el tercer trastorno de movimiento más común, se han visto muy limitados por el hecho de que los modelos genéticos animales en gran medida no reproducen el fenotipo de la enfermedad que se encuentra en el ser humano enfermo, así como la fisiopatología. Este problema no se limita a los síndromes distónicos, pero de hecho se refiere a muchos modelos de roedores transgénicos en el campo de los trastornos del movimiento1,2. La razón de la falta de un fenotipo en los modelos de roedores transgénicos podría basarse en mecanismos compensatorios altamente eficaces3. En el caso de la distonía, la enfermedad se caracteriza por contracciones musculares involuntarias que causan movimientos de torsión y posturas anormales4. El estudio de las causas secundarias (es decir, lesiones cerebrales) de los síntomas distónicos, ha ayudado a identificar las estructuras implicadas en la manifestación de estas anomalías motoras, como los ganglios basales5. Los estudios de imágenes cerebrales de formas hereditarias de distonía han mostrado anomalías funcionales en casi todas las regiones cerebrales responsables del control motor y la integración sensorial6,,7. Sin embargo, todavía se necesitan modelos de roedores para profundizar la comprensión de las disfunciones neuronales a nivel de red molecular y a gran escala, así como para el desarrollo de opciones terapéuticas. Aquí es donde los modelos farmacológicos de ratón ofrecen la posibilidad de replicar las características clínicas y patológicas de una enfermedad de una manera más precisa.
Distonismo de inicio rápido (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) es una de las formas hereditarias de distonía. Es causada por mutaciones de pérdida de función en el gen ATP1-3, que codifica para la subunidad de 3 de la Na+/K+-ATPase8. Además, se reconoce que los portadores de mutaciones genéticas pueden estar libres de síntomas durante años antes de desarrollar agudamente distonía generalizada persistente y Parkinson después de la exposición a un evento estresante. De hecho, la penetración de DYT/PARK-ATP1A3 es incompleta y eventos estresantes que actúan como un rango desencadenante desde el sobreesfuerto físico y las temperaturas extremas hasta el consumo excesivo de alcohol e infecciones9,,10. Con el fin de estudiar DYT/PARK-ATP1A3 y encontrar posibles intervenciones terapéuticas, se ha intentado numerosas veces imitar el desarrollo de la enfermedad dependiente del estrés en modelos de roedores. Sin embargo, aparte del modelo genético existente de ratón DYT/PARK-ATP1A3, donde los movimientos transitorios anormales y convulsionados fueron inducidos por hipotermia, todos los modelos de ratón genético publicados para DYT/PARK-ATP1A3 no han podido producir síntomas dónicos1,,11,,12. Antes, Calderón y otros demostraron que el bloqueo bilateral de la subunidad 3 en los ganglios basales y el cerebelo a través del glucósido cardíaco ouabain en ratones de tipo salvaje resulta en una alteración leve de la marcha13. La exposición adicional a las descargas eléctricas del pie en un ambiente cálido condujo a un fenotipo dismónico y bradicinético, lo que demuestra que la perfusión crónica y dirigida de ouabain seguida de estrés imita con éxito el fenotipo DYT/PARK-ATP1A3.
Sin embargo, exponer a los animales a descargas eléctricas en los pies en un ambiente cálido de 38-40 oC durante un período de dos horas induce dolor y ansiedad en los animales, que representan factores confusos, especialmente para la evaluación de los cambios en el sistema de catecolaminas relacionados con el desarrollo de la distonía. Por lo tanto, aquí describimos un tipo diferente de paradigma de estrés con alto valor traslacional, que se relaciona con el hecho de que el ejercicio leve a moderado se han descrito como desencadenantes en los pacientes DYT/PARK-ATP1A39. Además, el ejercicio repetitivo es un desencadenante bien conocido para la distonía focal14. Los ratones fueron sometidos repetidamente a desafiantes tareas motoras compuestas por tres descendientes de un poste de madera ("prueba de polo") y tres corridas en un aparato Rotarod ("prueba de rendimiento de Rotarod"). La colocación de animales en la parte superior de un poste de madera de 50 cm se utilizó para obligar a los animales a descender, el aparato Rotarod fue empleado para someter a los ratones a la actividad forzada colocándolos en una varilla giratoria.
La caracterización del fenotipo motor de un modelo de ratón para la distonía es particularmente difícil debido a la falta de pruebas y puntuaciones predefinidas. Sin embargo, una variación de una evaluación de la discapacidad motora se ha utilizado repetidamente en los últimos años con el fin de evaluar la gravedad y la distribución de los movimientos similares a la distonía en roedores13,,15,,16. Aquí presentamos una versión modificada de la escala de clasificación de distonía, que resultó ser eficaz en la evaluación del fenotipo similar a la distonía de los animales cuando se observa durante un período de tiempo de cuatro minutos. Como segundo método para evaluar los movimientos similares a la distonía, presentamos un sistema de puntuación recientemente desarrollado para la evaluación de movimientos anormales durante una prueba de suspensión de cola. Permite la evaluación de la frecuencia y duración de los movimientos y posturas similares a la distonía de las extremidades delanteras, las extremidades posteriores, así como el tronco.

<table><tbody><tr>Bombas osmóticas <td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>PZN06178437</td>Alzet <td>al 0,9%</td></tr><tr><td>salinas</td><td>Durect</td><td>4317</td><td>modelo 1002, caudal 0,25 &mu; </td></tr><tr><td>Tornillos de anclaje</td> L/h <td>MCS1x2</td><td>de AgnTho de</td><td>2 mm de largo con una rosca de 1mm de diámetro exterior.</td></tr><tr><td>Abrazaderas Bulldog</td><td>AgnTho's</td><td>13-320-035</td><td>recta, 3,5 cm</td></tr><tr><td>Bupivacain 0,25% Jenapharm</td><td>mibe GmbH Arzneimittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cánula y Minipump Holder</td><td>Stoelting Co.</td><td>51636</td><td>diseñado para sujetar cabezas de cánula de 3,4 mm</td></tr><tr><td>Bifurcación de cánulas</td><td>Plásticos One</td><td>21Y</td> Tubo de cánula <td>hecho a medida</td></tr><tr><td></td><td>Plásticos Un</td> vinilo <td>C312VT/PKG</td><td>, 0,69 mm x 1,14 mm</td></tr><tr><td>Pinzas de #5SF Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>pinza</td></tr><tr><td>fina crema para ojos Bepanthen</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara de anestesia gaseosa para Estereotaxica, Mouse</td><td>Stoelting Co.</td><td>56109M</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas endurecidas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Kit de micromotor rotativo de alta velocidad</td><td>Foredom</td><td>K.1070-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano CP 1 mL/mL, 250 mL</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>se necesita receta</td></tr><tr><td>médica Sistema de isoflurano Dr&auml; ger Vapor 19.3</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>cemento dental, líquido</td></tr><tr><td>Kallocryl CPGM rot</td><td>Speiko</td><td>1692</td><td>cemento dental, polvo rojo</td></tr><tr><td>Adaptador para ratones y neonatos</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td> adaptador <td>para ratones para un</td></tr><tr><td>portaagujas</td> tradicional con marco en U <td>KLS Martin Group</td><td>20-526-14</td><td></td></tr><tr><td>Barras de oreja antirrotura y puntas de goma para ratón Stereotaxic</td><td>Stoelting Co.</td><td>51649</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de Conector de Bomba Osmótica para ratones, doble</td><td>Plásticos Uno</td><td>3280PD-3.0/SPC</td><td>28 Calibre, longitud 4,0 mm, distancia c/c 3,0 mm</td></tr><tr><td>Cánula de conector de bomba osmótica para ratones, monoplástico</td><td>One</td><td>3280PM/SPC</td><td>28, calibre, longitud personalizada 3,0 mm</td></tr><tr><td>Ouabain octahidratado 250 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03125-250MG</td><td>ATENCIÓN: tóxico</td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Kern & Sohn</td><td>PFB 6000-1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda térmica rectal</td><td>Stoelting Co.</td><td>50304</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/mL, inyectable</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofeno, receta previa Calentador</td></tr><tr><td>de roedores X1 con almohadilla térmica para ratón</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800M</td><td></td></tr> RotaRod Juego <tr>de<td>destornilladores</td> Advanced TSE Systems <td></td><td></td> Fresas de acero inoxidable 30090-6 <td></td>de</tr><tr><td></td><td>AgnTho HM71009 de AgnTho</td><td></td><td>0,9 mm y fresas Oslash;</td></tr><tr><td>Fresas de acero inoxidable</td><td>HM71014 de AgnTho</td><td></td><td>de 1,4 mm y Oslash; rebabas</td></tr><tr><td></td><td></td> StereoDrive Neurostar <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td>hecho a medida por Neurostar</td></tr><tr><td>Robot estereotáxico</td><td>Neurostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sutura: vicryl recubierto, poliglatin 910</td><td>Ethicon</td><td>V797D</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf AG</td><td>5382000015</td><td></td></tr></tbody></table>

implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía dyt/park-atp1a3

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Los modelos de ratón modificados genéticamente se enfrentan a limitaciones, especialmente cuando se estudian trastornos del movimiento, donde la mayoría de los modelos de roedores transgénicos disponibles no presentan un fenotipo motor que se asemeje a los aspectos clínicos de la enfermedad humana. Los modelos farmacológicos de ratón permiten un estudio más directo de los pathomecanismos y su efecto en el fenotipo conductual. Las bombas osmóticas conectadas a las cánulas cerebrales abren la posibilidad de crear modelos farmacológicos de ratón a través de la administración de fármacos locales y crónicos. Para el trastorno del movimiento hereditario del disctonismo-parkinsonismo de inicio rápido, la mutación de pérdida de función en la subunidad de 3 de la Na+/K+-ATPase puede ser simulada por un bloqueo altamente específico a través de la ouabaína de glucósido. Con el fin de bloquear localmente la subunidad de 3o en los ganglios basales y el cerebelo, que son las dos estructuras cerebrales que se cree que están muy involucradas en la patogénesis del distonismo-parkinsonismo de inicio rápido, una cánula bilateral se implanta estereotizaxóxamente en el estriado y se introduce una canula única adicional en el cerebelo. Las cánulas están conectadas a través de tubos de vinilo a dos bombas osmóticas, que se implantan por vía subcutánea en la parte posterior de los animales y permiten la entrega crónica y precisa de ouabain. El modelo farmacológico del ratón para el distonismo-parkinsonismo de inicio rápido tiene la ventaja adicional de recapitular las características clínicas y patológicas de los portadores de mutaciones asintomáticas y sintomáticas. Al igual que los portadores de mutaciones del parkinsonismo de distonía de inicio rápido, los ratones perfundidos con ouabaína desarrollan movimientos similares a la distonía sólo después de una exposición adicional al estrés. Demostramos un paradigma de estrés suave e introducimos dos sistemas de puntuación modificados para la evaluación de un fenotipo motor.

La Figura 4 ha sido modificada de Rauschenberger et al.17. Para el análisis de datos tanto de la escala de clasificación de distonía (A) como de la prueba de suspensión de cola (B), calcule la puntuación total para cada punto de tiempo para cada animal. La media de cada punto de tiempo y cada grupo debe trazarse en un gráfico adecuado. Debe investigarse la distribución de los valores y debe aplicarse la prueba estadística adecuada para determinar la importancia. Con un número suficiente de animales, se puede detectar un fenotipo motor tanto con la escala de clasificación de distonía como con la evaluación de movimientos anormales en la prueba de suspensión de la cola. El fenotipo similar a la distonía se demuestra por la puntuación motora significativamente más alta en ambas evaluaciones en el grupo de ouabain-perfused, estresado en comparación con los ratones con oabain-perfused, no estresados, así como en los ratones de control.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Figura 1: Los principales pasos quirúrgicos para la implantación de cánulas y bombas osmóticas. (A) Para las coordenadas indicadas, los agujeros deben perforarse bilateralmente para la doble cánula designada para los ganglios basales y para la cánula única colocada en la línea media del cerebelo. Las dos bombas osmóticas completamente construidas se muestran a cada lado del animal. (B) La imagen muestra una cánula única implantada en el cerebelo, fijada con cemento dental. La cánula doble de los ganglios basales debe conectarse al adaptador de bifurcación y rellenarse previamente con ouabain antes de la implantación. (C) Imagen del procedimiento terminado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Figura 2: Evaluación de movimientos similares a la distonía con una escala de clasificación de distonía. Durante un video de 4 min, se puntuaron movimientos similares a la distonía basados en la distribución corporal y la duración. La hiperextensión involuntaria de las extremidades delanteras, una postura amplia o hiperextensión de las extremidades posteriores, así como la cifosis, fueron calificadas como similares a la distonía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Figura 3: Evaluación de movimientos similares a la distonía durante una prueba de suspensión de la cola. El sistema de puntuación recientemente desarrollado para movimientos anormales durante una prueba de suspensión de cola de 2 minutos evalúa movimientos similares a la distonía en las extremidades delanteras, las extremidades traseras y el tronco de 0 a 8 puntos en total. Para las extremidades delanteras, una hiperextensión y cruce de las extremidades delanteras, así como una flexión tónica hacia el tronco calificado como distonía. Para las extremidades posteriores la hiperextensión involuntaria, así como la retracción con extensión sobre la línea media se puntúan como distonía. Una distorsión truncal superior al 80% del tiempo registrado se anotó con un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Figura 4: Gráficos representativos de la escala de clasificación de distonía y la prueba de suspensión de cola. (A) El gráfico muestra la escala de clasificación de la distonía para ratones con perfumo NaCl (línea negra punteada), ratones con perfusias, no estresados (línea naranja punteada) y ratones con estresado yfuentes de ouabain (línea azul oscura). Para cada punto de tiempo, se muestran los valores medios - error estándar de la media (SEM). (B) El diagrama muestra la evaluación de los movimientos anormales durante una prueba de suspensión de cola de 2 minutos para ratones con forfuente NaCl, estresados (línea negra punteada), ratones sin estresados, sin estrés (línea naranja punteada) y ratones con estresado y estresados (línea azul oscuro). Se realizó un análisis estadístico para la escala de clasificación de distonía y la puntuación de la prueba de suspensión de cola utilizando la prueba Mann-Whitney de dos colas. La corrección de Bonferroni-Holm de los valores p mostró una diferencia significativa para el período observacional de 72 h. Azul oscuro * denotan diferencias significativas entre los ratones con oabaína, los ratones estresados y los ratones sin estresados, los ratones no estresados, el negro * denotan diferencias significativas entre ratones con forfuentes naCl, ratones estresados y ratones con estrés, así como entre ratones con forfusia naCl, estresados y sin estresados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Proporcionamos un protocolo para generar un modelo farmacológico de ratón de distonía DYT/PARK-ATP1A3 mediante la implantación de cánulas en ganglios basales y cerebelo conectados a bombas osmóticas. Describimos la inducción de movimientos similares a la distonía a través de la aplicación de un desafío motor y la caracterización del fenotipo a través de sistemas de puntuación conductual.

Implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos involucrados en el establecimiento de un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3 mediante el uso de cánulas cerebrales en bombas osmóticas e induciendo el estrés a través de tareas motoras desafiantes. Este método detalla cómo establecer un modelo farmacológico de ratón utilizando la administración crónica de fármacos a través de bombas osmóticas a múltiples cánulas cerebrales y cómo inducir el fenotipo a través de tareas motoras desafiantes. El paradigma del estrés motor leve también proporciona información sobre el papel de las interacciones gen-ambientales en los trastornos del movimiento, y se puede aplicar a otros modelos de roedores.Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. Comience preparando las bombas osmóticas en un ambiente estéril. En primer lugar, llene una jeringa de un mililitro con una cánula de llenado de calibre 27 con solución de ouabain filtrada estéril o solución para vehículos.Sujete la bomba osmótica en posición vertical, inserte la cánula hasta el final en la bomba y llene lentamente el depósito hasta que aparezca un exceso de solución en la parte superior. A continuación, inserte el moderador de flujo en la bomba. Retire cuidadosamente la brida blanca del moderador de flujo con tijeras y conecte una pieza de tubo de vinilo al moderador de flujo.Sumergir cada bomba en tubos Eppendorf llenos a mitad de camino con solución salina y ponerlos en un termociclador 37 grados con el fin de asegurarse de que la tasa de bombeo alcanza un estado estable antes de comenzar la cirugía. Después de que el animal es profundamente anestesiado de acuerdo con los protocolos aprobados, coloque el animal en un marco estereotáctico y fije la cabeza usando puntas de goma o barras de oído no rotas. Después de una desinfección exhaustiva del área quirúrgica, utilice un bisturí para colocar la incisión en la parte superior de la cabeza y use tijeras para continuar la incisión hasta las extremidades delanteras.Exponga el cráneo con la ayuda de abrazaderas de bulldog y limpie el periosteum con un aplicador estéril con punta de algodón. Alinee una pluma o la punta de un manchado cannular en tinta negra con bregma y utilice las coordenadas apropiadas para marcar los tres puntos de entrada para las cánulas cerebrales en el cráneo. A continuación, taladre cuidadosamente los orificios para el cannular doble designado para los ganglios basales y la cánula única designada para el cerebelo.Taladre un cuarto agujero para un pequeño tornillo entre el estriado y el cerebelo. Este tornillo eventualmente se incrustará en el cemento dental y proporcionará sujeción adicional para las cánulas. Con el fin de crear un pequeño bolsillo para la bomba osmótica en cada lado de los animales de la espalda, utilice fórceps de tejido para separar las capas de tejido subcutáneo.Avance los fórceps hacia una pata trasera y abra ligeramente los fórceps para ensanchar el bolsillo subcutáneo. Repita el mismo procedimiento para el otro lado, primero retirando los fórceps de la incisión y luego empujándolos suavemente hacia la segunda pata trasera. Con la ayuda de fórceps, inserte cuidadosamente las bombas y el catéter conectado en cada bolsillo subcutáneo.El bolsillo debe permitir que la bomba se deslice fácilmente. Usando un mini soporte de bomba, introduzca una sola cánula osmótica con una longitud personalizada de 3,0 milímetros en el agujero perforado en la línea media del cerebelo. Separe el cabezal de la cánula con cuidado y fije la cánula, así como el pequeño tornillo con cemento dental, teniendo cuidado de no cubrir la pieza de conexión para el tubo de la bomba osmótica.Asegúrese de que el cemento dentista que rodea la cánula se ha secado completamente antes de continuar con la cirugía. Antes de insertar la cánula doble en los agujeros perforados bilateralmente por encima de los ganglios basales, adjunte dos trozos de 0,5 centímetros de largo de tubo de vinilo a las dos piezas de conexión de la cánula doble. Conecte los tubos de vinilo con un adaptador de bifurcación y rellene cuidadosamente todo el sistema de tubos con solución de ouabain estéril o vehículo.A continuación, repita los mismos pasos que se mostraron anteriormente para la cánula única y termine fijando la doble cánula con cemento dental. Conecte los catéteres de las bombas osmóticas al adaptador de bifurcación, así como a una sola cánula respectivamente. Ambas bombas tienen un caudal igual, así que tenga cuidado de conectar la bomba osmótica con una solución doble concentrada al adaptador de bifurcación para asegurarse de que la misma concentración alcance tanto los ganglios basales como el cerebelo.Cierre la incisión en la parte posterior de los animales con puntos de sutura en la medida de lo posible sin estirar demasiado la piel. Inyecte por vía subcutánea solución salina estéril, que debe tener temperatura corporal para evitar la deshidratación. Retire el animal del marco estereotáctico y colóquelo en la jaula de recuperación.Con el fin de inducir movimientos similares a la distonía, los ratones perfundidos con ouabain deben estar expuestos a tareas motoras desafiantes como paradigma de estrés leve cuatro horas después de la cirugía y repetitivamente cada 24 horas después. Esto no incluye una caracterización conductual de los animales. Aquí mostramos el ejemplo de un animal perfundido por vehículos, que se coloca sobre un poste de madera de superficie rugosa de 50 centímetros, nariz orientada hacia abajo.Proporcione suficiente ropa de cama en la base del poste en caso de caídas. En el caso de los ratones con piel de ouabain, los animales deben comenzar a presentar los primeros síntomas como bradiquinesia cuatro horas después de la cirugía. Sin embargo, 24 horas después de la cirugía, usted debe ver la hiperextensión involuntaria de las extremidades delanteras o posteriores como un signo de movimientos similares a la distonía durante el descenso.Los ratones deben descender el polo tres veces, permitir al menos dos minutos de recuperación entre cada descenso. No es necesario medir el tiempo de descenso. La prueba del poste debe ir seguida de una segunda tarea motora, utilizando una varilla giratoria.Como se hace para la prueba de rendimiento de Rotarod, los ratones perfundidos de ouabain y vehículo de los grupos de estrés se colocan en la varilla giratoria. No es necesario medir la latencia a caída. Como se hace para la prueba anterior, los ratones deben colocarse en la varilla giratoria tres veces, permitiendo dos minutos de recuperación entre carreras.La escala de clasificación de distonía modificada se puede utilizar para evaluar la frecuencia, gravedad y distribución corporal de los movimientos similares a la distonía de los ratones. Los animales deben colocarse en una caja de plástico o madera y los movimientos deben registrarse durante un período de tiempo de cuatro minutos. Los calificadores deben cegarse a la asignación de grupo.Los movimientos o posturas que se consideran similares a la distonía son la hiperextensión involuntaria de las extremidades frontales, una postura amplia o hiperextensión de las extremidades posteriores, así como la cifosis. Si solo se ve afectada una parte del cuerpo, la distonía debe considerarse como focal. Si el tronco y al menos otras dos partes del cuerpo se ven afectados, la distonía debe considerarse generalizada.Un segundo sistema de puntuación recientemente desarrollado de cero a ocho puntos, evalúa la presencia y gravedad de los movimientos similares a la distonía durante una prueba de suspensión de cola. Para la prueba, sostenga el ratón por la cola cerca de su base durante dos minutos. Se recomienda grabar la prueba de suspensión de cola y asignar una puntuación al análisis posterior del material de archivo.Las extremidades delanteras se anotan de cero a cuatro puntos. Las retracciones tónicas repetidas o sostenidas de una de las dos extremidades frontales, así como la hiperextensión combinada con el cruce de las extremidades delanteras se puntúen como distonía. Los movimientos similares a la distonía de las extremidades posteriores, lo que significa retracción y apretamiento, así como la hiperextensión sostenida, se anotan de cero a tres puntos.Una distorsión truncal presente sobre el 80% del tiempo registrado se anota con un punto adicional. El cierre de las extremidades traseras es un signo inespecífico para el deterioro del motor y no debe puntuarse. Este gráfico muestra los resultados de la escala de clasificación de distonía.Los ratones estresados con oabaína presentan movimientos significativamente más similares a la distonía durante un período observacional de 72 horas que el grupo no estresado de ouabain-pered, así como los animales del vehículo. Esta imagen representa los resultados de la prueba de suspensión de la cola y muestra un resultado similar a la escala de clasificación de distonía. Tenga en cuenta que los resultados de la media de la puntuación total de cada animal para cada punto de tiempo.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo implantar estereotácticamente múltiples cánulas cerebrales y cómo implantar por vía subcutánea bombas osmóticas. La principal ventaja de este método es que se pueden evitar inyecciones repetitivas y estresantes y que un sustrato como la ouabain, que de lo contrario tendría efectos secundarios en todo el sistema se puede entregar directamente a una estructura cerebral específica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Wang, X. et. al., Administración de fármacos basada en bombas osmóticas para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el método para administrar medicamentos neuroterapéuticos utilizando una bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado. La liberación controlada del fármaco promueve la remielinización mediante la activación de las células productoras de mielina en el cuerpo calloso.

 Administración de fármacos neuroterapéuticos basados en bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Con el fin de estudiar la reorganización del cerebro en condiciones patológicas, utilizamos bombas miniosmóticas para la entrega directa de proteínas al cerebro, eludiendo la barrera hematoencefálica. A continuación, se inyectan trazadores del tracto para estudiar las alteraciones en la conectividad cerebral bajo la influencia de la proteína.

Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

El protocolo de bajo costo que consiste en análisis de la huella y colgante caja de prueba después de sistema de seguridad para el estrés es útil para evaluar los trastornos de movimiento del modelo del ratón.

Protocolo de bajo costo de análisis de la huella y colgante caja de prueba para los ratones aplicada la tensión de retención crónica

La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica implantada se ha utilizado ampliamente para imitar la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Aquí, describimos métodos detallados en la implantación quirúrgica de minibombas para la administración continua de isoproterenol durante 3 semanas, así como, evaluación ecocardiográfica para la creación exitosa del modelo.

Implantación de una minibomba de isoproterenol para inducir insuficiencia cardíaca en ratones

La desmielinización tiene lugar en múltiples enfermedades del sistema nervioso central. Es necesaria una técnica confiable de administración de medicamentos in vivo para remielinizar las pruebas de drogas. Este protocolo describe un método basado en bomba osmótica que permite la administración de fármacos a largo plazo directamente en el parénquima cerebral y mejora la biodisponibilidad del fármaco, con una amplia aplicación en la investigación de la remielinización.

Administración de fármacos basada en bomba osmótica para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central

Este protocolo introduce una técnica para inducir modelos de síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratones mediante la liberación controlada de letrozol utilizando minibombas. Bajo la anestesia adecuada, la minibomba se implantó por vía subcutánea y se indujo con éxito el SOP en los ratones después de un cierto período de liberación de la minibomba.

Una técnica modificada para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Aquí describimos un protocolo para grabaciones ex vivo de matrices de microelectrodos de alta densidad de cortes cerebrales cerebelosos agudos de un modelo de hámster distónico que recibieron in vivo. estimulación continua pálida profunda del cerebro durante 11 días.

Investigación de los mecanismos a nivel de red de la estimulación palidal profunda del cerebro utilizando matrices de microelectrodos de alta densidad

La resonancia magnética (MRI) se ha convertido en una herramienta cada vez más popular para examinar el fenotipo de los ratones alterados genéticamente. Este artículo ilustra los métodos necesarios para alcanzar un alto rendimiento fenotipo de los ratones alterados genéticamente con múltiples ratón MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

Aprende a establecer un modelo farmacológico de distonía DYT/PARK-ATP1A3 en ratones mediante bombas osmóticas y cánulas cerebrales. Este método permite estudiar interacciones gen-ambiente en trastornos del movimiento.

Implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3 (Video) | JoVE Journal

Implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3

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