Name: Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Explore la estructura tridimensional del tejido adiposo blanco de ratón y humano mediante un protocolo de aclarado con metilsalicilato. Este método simplificado utiliza solventes menos tóxicos y permite visualizar vasculatura, células inmunes y gotas lipídicas con imágenes 3D de alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad De Costa Azul, y con subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) a través de Academy 2 "Syst-mes Complexes" y Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", La Fundación para la Recherche Médical (quipe FRM DEQ20180839587), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos también el Fondo Básico de Imagen del C3M financiado por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, y que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imagen de IBISA (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por la ayuda técnica en la preparación de tejidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, por la lectura comprobante del manuscrito.

Este protocolo fue probado y validado para todos los depósitos de ratón y tejido adiposo blanco humano. Los tejidos adiposos humanos y de ratón fueron recogidos en consecuencia a las leyes europeas y aprobados por los comités éticos franceses y suecos.
1. Fijación del ratón y el tejido adiposo blanco humano
<ol><li>Sumerja el ratón cosechado o los tejidos adiposos blancos humanos en al menos 10 ml de PBS que contengan un 4% de paraformaldehído (PFA) en un tubo de plástico de 15 ml.</li>
	<li>Agitar el tubo de plástico a temperatura ambiente en una placa de rodadura durante 1 h.</li>
	<li>Deje el tubo de plástico a 4 oC en una placa enrollable durante la noche, para completar la fijación. NOTA: Este protocolo está adaptado para muestras de tejido adiposo grandes, como las almohadillas de grasa epidídmica enteras obtenidas de ratones alimentados con una dieta normal (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Para muestras más grandes como almohadillas epidídmicas de grasa obtenidas de ratones alimentados con una dieta alta en grasas (≈1,5 g - ≈4 cm3) o muestras de tejido adiposo humano, aunque el protocolo de compensación debería funcionar perfectamente para toda la muestra (ampliando la PFA y las mezclas de anticuerpos), en general, cortamos piezas de tejido alrededor de 1 g (≈2,5 cm3)para reservar las muestras restantes ya sea para tinciones adicionales o aplicaciones. Para el PFA (paso 1.1.) recomendamos usar aproximadamente 10 veces el volumen del tejido. Para las mezclas de anticuerpos (pasos 3.1. y 3.4.), aumente el volumen para sumergir completamente el tejido y utilice un tubo de plástico de 15 ml (ver Tabla de Materiales)si el tejido es demasiado grande para un microtubo de plástico de 1,5 ml (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>2. Permeabilización y saturación del ratón y el tejido adiposo blanco humano
<ol><li>Enjuague el tejido adiposo blanco fijo en 10 ml de PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los restos de PFA.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,3% de glicina (ver Tabla de materiales)y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital durante 1 h a 100 revoluciones por minuto (rpm) para apagar los grupos de aldehídos libres restantes.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100 (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada durante 2 h a 100 rpm.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100 y un 20% de DMSO (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante la noche.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,1% de interpolación-20 (ver Tabla de Materiales),0,1% Tritón X-100, 0,1% desoxicolato (ver Tabla de Materiales)y 20% DMSO y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos 24 h.</li>
	<li>Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Triton X-100 y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 1 h.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 12 h, para saturar cualquier sitio que no pueda enlazar específicamente anticuerpos. NOTA: En el paso 2.7, la BSA puede sustituirse por el suero sanguíneo de las especies del anticuerpo secundario utilizado.</li>
</ol>3. Procedimiento de tinción para ratón y tejido adiposo blanco humano
<ol><li>Transfiera el tejido en un microtubo plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos primarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirios, pero se debe evaluar la concentración óptima de anticuerpos para cada anticuerpo). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).</li>
	<li>Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo protegido de la luz a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.</li>
	<li>Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.</li>
	<li>Transfiera el tejido a un microtubo de plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos secundarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirión). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).</li>
	<li>Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.</li>
	<li>Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.</li>
	<li>Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 2 h. NOTA: Para el etiquetado de estructuras específicas como núcleos o actina, añadir 4o,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI o equivalente) y/o el fluorescente etiquetado-phalloidin deben añadirse en el paso 3.1. cuando sólo se utilizan anticuerpos primarios con etiqueta fluorescente, o en el paso 3.4. cuando se utilizan anticuerpos secundarios. NOTA: Para el procedimiento de tinción, se pueden utilizar anticuerpos primarios ya conjugados con fluorocromos (como los utilizados para la citometría de flujo) y lo recomendamos para la ganancia de tiempo y especificidad. De hecho, incluso si los anticuerpos primarios del ratón pueden ser utilizados seguidos de anticuerpos anti-ratón secundarios, como lo demostramos aquí, a menudo hemos observado tinción no específica de los vasos sanguíneos debido a la inmunoglobulina circulante. Por lo tanto, para evitar este problema, los anticuerpos primarios que ya están etiquetados son muy recomendables y aquí proporcionamos evidencia de que los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo son compatibles con nuestro procedimiento. Sin embargo, en el caso específico de un antígeno que se expresa en niveles bajos, un paso de amplificación de señal a través de anticuerpos secundarios es obligatorio; cuando el único anticuerpo primario disponible se hace en ratón, una perfusión cardíaca de los ratones con PBS durante al menos 5 minutos en el sacrificio puede eliminar una gran proporción de inmunoglobulina circulante y, por lo tanto, la tinción no específica.</li>
</ol>4. Procedimiento de limpieza para el ratón y el tejido adiposo blanco humano
<ol><li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 50% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 70% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 95% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.</li>
	<li>Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante la noche.</li>
	<li>Sumergir el tejido en una botella de vidrio de 20 ml con una tapa de plástico (ver tabla de materiales) que contenga 5 ml de salicilato de metilo (ver Tabla de materiales)bajo una capucha química y agitar el recipiente de vidrio, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante al menos 2 h. NOTA: El procedimiento de compensación podría acelerarse significativamente (si fuera necesario) evitando los pasos 4.3. y 4.5., aunque la calidad final de compensación se reduciría ligeramente.</li>
</ol>5.3D-confocal imágenes de tejido adiposo blanco transparente
<ol><li>Transfiera el tejido a una cámara de imágenes metálicas equipada con un fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales)bajo una capucha química y llene la cámara con salicilato de metilo fresco. NOTA: Para asegurar el tejido en su lugar, y así evitar que flote o se mueva hacia los lados en la cámara, aplique múltiples cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm (ver Tabla de Materiales)en la parte superior del tejido al montarlo en la cámara.</li>
	<li>Coloque la cámara de imágenes en un microscopio confocal invertido.</li>
	<li>Imagen del tejido utilizando un objetivo de baja ampliación (por ejemplo, objetivo 4x) para generar unos pocos cm3 mapas 3D de todo el tejido adiposo o de la muestra de tejido humano.</li>
	<li>Seleccione varias áreas para el muestreo de tejido con mayor aumento. Normalmente, utilice un objetivo de aire de larga distancia de 20x que proporcione una buena relación entre resolución y profundidad. Adquirimos grandes imágenes de mosaico con pilas z de entre 600 y 2000 m de profundidad. NOTA: Utilice un objetivo de larga distancia para profundizar en el tejido.</li>
</ol>6. Extracción de resultados cuantitativos de las imágenes de tejido adiposo 3D
NOTA: La segmentación de las diferentes estructuras y la posterior extracción de la información cuantitativa de la pila de imágenes 3D generada en el punto 5 se pueden realizar utilizando cualquiera de las muchas opciones de software de análisis de imágenes existentes, ya sea comercial o freeware. En los siguientes puntos, describimos una estrategia que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio para extraer información cuantitativa de imágenes de tejido adiposo 3D utilizando software comercial (ver Tabla de materiales).
<ol><li>Convierta las pilas 3D en el formato de software para liberar espacio de memoria.</li>
	<li>Segmente las celdas.<ol>
<li>Abra el módulo Cell del software.</li>
		<li>Cambie el ajuste de Detección celular a Tinción de membrana plasmática.</li>
		<li>Elija el canal fluorescente del marcador utilizado para delinear la periferia celular (phalloidina que etiqueta la actina cortical o marcadores de membrana plasmática como F4/80 para macrófagos, TCR-β para células T o racimo de proteínas CD de diferenciación específicas para subtipos de células inmunitarias).</li>
		<li>Configure los umbrales y proporcione un rango de tamaño de celda esperado (es decir, de 1 a 200 m para la detección de celdas).</li>
		<li>Ejecute la segmentación. Se generará un volumen correspondiente a la pila z con las celdas segmentadas codificadas por colores con un color diferente para cada una de las celdas vecinas.</li>
		<li>Aplicar filtros estadísticos (tamaño, redondez, circularidad, etc.) en la pestaña estadística para excluir artefactos de segmentación y/o refinar las celdas segmentadas a la célula de interés en función de su tamaño (es decir, 20-200 m para los adipocitos; 5-25 m para macrófagos; 1-3 m para linfocitos).</li>
		<li>Extraiga medidas y datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) de la pestaña de estadísticas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segmente componentes celulares (núcleos, vesículas, etc.) o vasos como estructura. NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.<ol>
<li>Abre el módulo Surface del software.</li>
		<li>Seleccione el canal fluorescente del marcador utilizado para etiquetar específicamente el componente subcelular para reconstruirlo en 3D.</li>
		<li>Configure los umbrales y proporcione un rango del tamaño de diámetro esperado de la estructura (es decir, 0,5-5 m para núcleos; 0-100 m para recipientes; etc.).</li>
		<li>Ejecute la segmentación. Se generará un volumen con la estructura celular segmentada. Las mediciones y los datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) se pueden extraer de la pestaña de estadísticas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segmentar los vasos como un continuo tubular. NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.<ol>
<li>Abra el módulo Filamentos del software.</li>
		<li>Seleccione el canal fluorescente correspondiente a la tinción del recipiente.</li>
		<li>Configure los umbrales para la intensidad de fluorescencia y seleccione el número adecuado de nodos de conexión esperados.</li>
		<li>Ejecute la segmentación. Los filamentos que representan la red de buques se generarán en 3D. Las mediciones se pueden extraer de la pestaña de estadísticas, lo que permite obtener datos cuantitativos, incluida la longitud del buque, el número de ramificaciones de los buques, etc.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).</li>
<li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+changes+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).</li>
<li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation%3A+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li>
<li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).</li>
<li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Las modificaciones que se producen dentro del tejido adiposo a lo largo de la progresión patológica, como la de la obesidad, son fundamentales para la comprensión de los mecanismos detrás de la patología. Estudios pioneros que revelaron estos mecanismos en el tejido adiposo se han basado en enfoques globales como la proteómica entera del tejido adiposo21,la citometría de flujo22,,23,y la transcriptómica24,,</su...

La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa de tejido adiposo y se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo, dado que las personas con obesidad tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, enfermedades hepáticas y algunos tipos de cáncer.
Una función fisiológica fundamental del tejido adiposo es modular la glucosa de todo el cuerpo y la homeostasis lipídica1,2. Durante el período de alimentación, los adipocitos (es decir, las células principales del tejido adiposo) almacenan el exceso de glucosa y lípidos proporcionado por una comida en triglicéridos. Durante el ayuno, los adipocitos descomponen los triglicéridos en ácidos grasos no esterificados y glicerol para mantener la demanda de energía del cuerpo. Durante el desarrollo de la obesidad, el tejido adiposo se expande aumentando el tamaño (hipertrofa) y/o el número (hiperplasia) de adipocitos1,para aumentar su capacidad de almacenamiento. Cuando la expansión del tejido adiposo alcanza su límite, una constante altamente variable entre los pacientes, los lípidos restantes se acumulan en otros órganos metabólicos incluyendo músculos e hígado3,,4, lo que conduce a su fracaso funcional e inicia complicaciones cardio-metabólicas relacionadas con la obesidad1,,5. Por lo tanto, identificar los mecanismos que rigen la expansión del tejido adiposo es un desafío clínico clave.
Las modificaciones morfológicas documentadas dentro de los tejidos adiposos durante la obesidad están vinculadas a su disfunción patológica. Se han utilizado varios procedimientos de tinción para describir la organización tisular del tejido adiposo, incluyendo actina6,marcadores vasculares7, marcadores de gotas de lípidos8, y marcadores específicos de células inmunitarias9,10. Sin embargo, debido al enorme diámetro de los adipocitos (50 a 200 m)11, es esencial analizar una gran parte de todo el tejido en tres dimensiones con el fin de analizar con precisión los dramáticos cambios estructurales de AT observados durante la obesidad. Sin embargo, debido a que la luz no penetra en un tejido opaco, no es posible tomar imágenes en 3D dentro de una gran muestra de tejido utilizando microscopía de fluorescencia. En la literatura se han notificado métodos de limpieza de tejidos para hacerlos transparentes (para una revisión, véase12), lo que permite limpiar los tejidos y realizar una microscopía de fluorescencia de tejido entero en profundidad. Estos métodos ofrecen oportunidades sin precedentes para evaluar la organización celular 3D en tejido sano y enfermo. Cada uno de los métodos descritos tiene ventajas e inconvenientes, y por lo tanto debe ser cuidadosamente seleccionado dependiendo del tejido estudiado (para una revisión, ver13). De hecho, algunos enfoques requieren un largo período de incubación y/o el uso de materiales o compuestos que sean caros, tóxicos o difíciles de obtener14,,15,,16,,17,,18,,19. Aprovechando uno de los primeros compuestos utilizados hace un siglo por Werner Spalteholz para limpiar los tejidos20,hemos establecido un protocolo fácil de usar y económico que está muy bien adaptado para la limpieza de todos los depósitos de tejido adiposo humano y ratón en cualquier laboratorio con equipos típicos que incluyen una capucha química, un agitador orbital controlado por temperatura y un microscopio confocal.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL</td><td>Tubos Eppendorff - Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico de 15</td><td>mL Tubos Falcon - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm</td><td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio de 20 ml</td><td>Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo conjugado anti-mouse-alexa647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>anti-conejo-Alexa647-anticuerpo conjugado</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE anticuerpo Biolegend</td><td></td><td>BLE145703</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD31</td><td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>Dilución: 1/50</td></tr><tr><td>Software comercial de análisis 3D - Instrumento</td><td></td> <td>IMARIS Oxford</td><td>con módulo de célula</td></tr><tr><td>Microscopio confocal - Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Concentración de stock: 5 mg/mL; dilución 1/1000</td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Glut4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53566</td><td>Dilución: 1/50</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Lectin-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1 Concentración de</td><td>existencias : 2 y micro; g/&micro; L; Inyección intravenosa: 50 y micro; L/mices</td></tr><tr><td>Cámara de imagen metálica equipada con fondo de cristal - Cámara AttoFluor</td><td>Thermofisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Salicilato de metilo</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de perilipina</td><td>Progen</td><td>651156</td><td>Dilución: 1/50</td></tr><tr><td>Faloidina-alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>Anticuerpo TCR-&beta;-PB</td><td>Biolegend</td><td>BLE109225</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>TH anticuerpo</td><td>AbCam</td><td>ab112</td><td>Dilución: 1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3d

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

La obesidad es un importante problema de salud pública en todo el mundo que aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa del tejido adiposo (AT) debido a la hiperplasia de adipocitos y/o hipertrofia, lo que conduce a una profunda remodelación de su estructura tridimensional. De hecho, la capacidad máxima de AT para expandirse durante la obesidad es fundamental para el desarrollo de patologías asociadas a la obesidad. Esta expansión AT es un importante mecanismo homeostático para permitir la adaptación a un exceso de ingesta de energía y para evitar el derrame de lípidos nocivos a otros órganos metabólicos, como el músculo y el hígado. Por lo tanto, entender la remodelación estructural que conduce al fracaso de la expansión AT es una cuestión fundamental con alta aplicabilidad clínica. En este artículo, describimos un método de limpieza simple y rápido que se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para explorar la morfología del ratón y el tejido adiposo blanco humano por imágenes fluorescentes. Este método de compensación AT optimizado se realiza fácilmente en cualquier laboratorio estándar equipado con una capucha química, un agitador orbital con temperatura controlada y un microscopio fluorescente. Además, los compuestos químicos utilizados están fácilmente disponibles. Es importante destacar que este método permite resolver la estructura 3D AT manchando varios marcadores para visualizar específicamente los adipocitos, las redes neuronales y vasculares, y la distribución de células inmunitarias innatas y adaptativas.

Usando el procedimiento descrito aquí y resumido en la Figura 1,pudimos manchar y limpiar ópticamente el tejido adiposo blanco humano y ratón como se presenta en la Figura 2A y la Figura 2B,respectivamente. El tejido transparente se transfirió a la cámara de imágenes metálicas para realizar imágenes confocales(Figura 3A). El aclaramiento mejoró drásticamente la profundidad de las imágenes tisulares que ...

Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Este protocolo permite el análisis de la estructura tridimensional de muy grande humano en la microscopía de ballet de tejido adiposo de ratón. Facilitar la vinculación de la disfunción patológica con cambios estructurales de tejidos adiposos. Este proceso de limpieza es muy simple, muy bien adaptado para limpiar el tejido adiposo humano en ratones calientes y utilizar menos disolvente tóxico como etanol o salicilato de metilo en comparación con otros protocolos claros.Comience sumergiendo el ratón cosechado o el tejido adiposo blanco humano en al menos 10 mililitros de formaldehído de 4% de potencia en PBS en un tubo de plástico de 15 mililitros preferentemente bajo una capucha química. Agitar el tejido en una placa de rodadura a temperatura ambiente durante una hora antes de transferir el tubo a una placa de rodadura a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente enjuague el tejido adiposo blanco fijo en 10 mililitros de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de fijador y transferir el tejido a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,3% de glicina en PBS durante una incubación de una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 revoluciones por minuto.Cuando se hayan acaloder los grupos de aldehído libre restantes, sumerja el tejido en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,2% Tritón X-100 en PBS durante una incubación de dos horas con temblores a 37 grados centígrados. Al final de la incubación tratar el tejido con 10 mililitros de 0.2%Tritón X-100 y 20%DMSO con temblor a 37 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente sumerja el tejido en un tubo de plástico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% desoxicolato y 20%DMSO en PBS durante una incubación de al menos 24 horas a 37 grados Celsius con temblor.Al final de la incubación, enjuague el tejido con 10 mililitros de 0,2% Tritón X-100 en PBS en un agitador orbital a 100 revoluciones por minuto durante una hora. Seguido por la inmersión en 15 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante 12 horas a 37 grados Celsius con temblor. Para la tinción del tejido adiposo blanco.Transfiera el tejido a 300 microlitros de 0,2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS, complementados con los anticuerpos primarios de interés en un microtubo de 1,5 mililitros, protécterelo de la luz con papel de aluminio y coloque el tubo en un tubo Falcon de 50 mililitros. Coloque el tubo en el agitador orbital durante una incubación de dos días a 37 grados Celsius con temblor. Al final de la incubación enjuague el tejido dos veces en 10 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante cinco horas a 37 grados Celsius con temblor y protección contra la luz.Después del segundo enjuague lavar el tejido en 10 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA y PBS durante 16 a 48 horas a 37 grados Celsius con temblor, luego transfiera el tejido a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 300 microlitros de 0,2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS, complementado con los anticuerpos secundarios apropiados y proteger el tubo de la luz usando papel de aluminio. Después de una incubación de dos días a 37 grados Celsius en una coctelera, lave el tejido dos veces en 10 mililitros de 0.2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante cinco horas a 37 grados Celsius con temblor protegido de la luz. Después del segundo lavado, enjuague el tejido en un tubo que contenga 10 mililitros de 0,2%Tritón X-100 fresco, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante 16 a 48 horas a 37 grados Celsius con temblor y protección de la luz.Seguido de un lavado de dos horas en 10 mililitros de PBS solo a 37 grados Celsius con temblor y protección de la luz. Para la limpieza de tejido adiposo blanco al final del lavado PBS sumergir el tejido y 10 mililitros de una serie de concentración de etanol de envío ascendente para una incubación de dos horas por concentración a temperatura ambiente con temblores protegidos de la luz como se indica. A la mañana siguiente sumerja el tejido en una botella de vidrio de 20 mililitros con una tapa de plástico que contenga cinco mililitros de salicilato de metilo en una campana de humo.El tejido adiposo blanco todavía es claramente visible en esta etapa. Agitar el recipiente protegerlo de la luz a temperatura ambiente durante al menos dos horas. El tejido adiposo blanco se convierte en un trasplante completo.Para la imagen confocal 3D del tejido adiposo blanco teñido y transparente montar una cámara de imágenes metálicas equipada con un fondo de vidrio y en una campana de humo transferir el tejido a la cámara. Llene la cámara con salicilato de metilo fresco. Finalice el montaje de la cámara añadiendo un pequeño resbalón de cubierta para estabilizar el tejido y un gran resbalón de cubierta para cerrar la cámara.Coloque la cámara en una etapa de microscopio confocal invertido para la toma de imágenes de tejido con bajo aumento para generar unos pocos mapas 3D de centímetro cúbico de toda la muestra de tejido adiposo. Después de la generación de mapas 3D, utilice un objetivo de aire de larga distancia 20X que proporcione una buena relación entre la resolución y la profundidad para seleccionar varias áreas para el muestreo de tejido con un aumento más alto. Para la segmentación de celdas, convierta pilas 3D en el formato de software para liberar espacio de memoria.Antes de abrir el módulo celular del software. Cambie el ajuste de detección celular a la tinción de membrana plasmática y seleccione el canal fluorescente del marcador utilizado para delinear la periferia celular. A continuación, configure los umbrales, proporcione un rango de los tamaños de celda esperados y ejecute la segmentación.Los efectos de la limpieza en el tejido adiposo blanco humano y ratón se pueden observar a simple vista. La limpieza también mejora drásticamente la profundidad de la imagen del tejido que se puede adquirir. Y facilita la generación de imágenes 3D de tejido entero y la generación de mapas 3D de la ampliación 4X.El mapeo 3D permite además la selección de diferentes áreas de interés a una ampliación de 20X a una profundidad de dos milímetros. La tinción específica de gotas de lípidos y adipocitos se puede lograr utilizando anticuerpos perilipina y anti-GLUT4 respectivamente. Los vasos sanguíneos se pueden detectar utilizando un anticuerpo CD31 o una inyección intravenosa de Lectin DyLight 649 poco antes del sacrificio.Los macrófagos y las células T se pueden visualizar utilizando anticuerpos anti-fitoerytrina CD301 y anticuerpos azules anti TCR beta Pacífico. La red nerviosa periférica se puede detectar utilizando anticuerpos anti tirosina hidroxilasa. Usando estos etiquetados se puede determinar el tamaño medio y la distribución del tamaño de los adipocitos y la densidad de la red de los vasos sanguíneos dentro del tejido adiposo.Es crucial seguir el tiempo de ocupación como se ha demostrado porque una mala preparación de la muestra no resultará en una buena calidad de imagen. Este protocolo se puede combinar con un avanzado sistema de imágenes o se puede acoplar al software gratuito de análisis de imágenes posterior al procesamiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Formación de vasos sanguíneos y la inervación simpática juegan papeles fundamentales en la remodelación del tejido adiposo. Sin embargo, quedan cuestiones técnicas en visualizar y medir cuantitativamente el tejido adiposo. Aquí presentamos un protocolo para etiquetar correctamente y comparar cuantitativamente la densidad de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en diferentes tejidos adiposos.

Co de tinción de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en el tejido adiposo

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

El reemplazo del tejido muscular sano con grasa intramuscular es una característica prominente de las enfermedades y afecciones humanas. Este protocolo describe cómo visualizar, visualizar y cuantificar la grasa intramuscular, lo que permite el estudio riguroso de los mecanismos subyacentes a la formación de grasa intramuscular.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

Explore la estructura tridimensional del tejido adiposo blanco de ratón y humano mediante un protocolo de aclarado con metilsalicilato. Este método simplificado utiliza solventes menos tóxicos y permite visualizar vasculatura, células inmunes y gotas lipídicas con imágenes 3D de alta resolución.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

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