Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Este método define con precisión las mutaciones de la calreticulina en pacientes con sospecha de afección hematológica, especialmente cuando otras opciones diagnósticas son limitadas o hay una superposición con afecciones no hematológicas. La principal ventaja de la técnica de espejo de alta resolución es la detección de las variantes genéticas somáticas comunes en la región caliente del gen de la calreticulina en el límite aceptable de detección y a un costo asequible. Esta técnica permite el diagnóstico rápido y no invasivo de los trastornos mieloproliferativos, especialmente la trombocitemia esencial y la mielofibrosis primaria.

Actualmente no tiene ningún efecto en la elección de la terapia en estos pacientes. Sin embargo, esto puede cambiar en el futuro. Comience por preparar la mezcla maestra de qPCR HRM como se describe en el manuscrito del texto, haciendo suficiente para tres réplicas de cada muestra de ADN y control.

Mezcle el contenido de la reacción golpeando e invirtiendo suavemente el tubo y agitando el vórtice durante dos o tres segundos, luego gire brevemente el tubo para recoger las gotas dispersas. Transfiera 19 microlitros de la mezcla maestra qPCR HRM a cada pocillo de la placa de reacción óptica de 96 pocillos. Pipetear un microlitro de los controles negativos, controles positivos y muestras en los pocillos apropiados de la placa para el control sin plantilla o NTC a un microlitro de ARN estériles y agua libre de ADN utilizada para preparar la mezcla maestra de qPCR HRM en lugar de ADN.

Selle firmemente la placa de reacción con la película adhesiva óptica para evitar la evaporación durante el funcionamiento. Luego gírelo a 780 veces G a temperatura ambiente durante un minuto. Compruebe que el líquido esté en el fondo de los pocillos en la placa de reacción y ejecute el ensayo.

Asigne los controles y las muestras a los pozos apropiados en el software del sistema de instrumentos y cambie el protocolo de amplificación de instrumentos predeterminado. Programe el instrumento tal como se describe en el manuscrito del texto para realizar el análisis de disociación inmediatamente después de la qPCR. Cuando finalice la ejecución, revise y verifique el gráfico de amplificación.

En el menú de experimentos del software del sistema de instrumentos, seleccione la opción de gráfico de amplificación. Si no se muestra ningún dato, haga clic en el botón verde Analizar. En la pestaña Gráfico de amplificación del menú desplegable Tipo de trazado, seleccione el gráfico que muestra los datos de amplificación como las lecturas de fluorescencia, normalizadas a la fluorescencia de la referencia pasiva en función del número de ciclo, En el menú desplegable de color de trazado, seleccione muestra.

En el menú desplegable tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación lineal, verifique que el ciclo de inicio y fin de línea base esté configurado correctamente. El ciclo final debe establecerse unos ciclos antes del número de ciclo en el que se detecta una señal fluorescente significativa. En el menú desplegable tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación log 10, muestre la línea de umbral en el gráfico seleccionando la opción de umbral y ajuste el umbral.

La línea de umbral debe cruzar la fase exponencial en las curvas de qPCR. Verifique que todos los pocillos de muestreo y de control positivo tengan curvas de amplificación normales y que no haya amplificación en los pocillos NTC. Un gráfico de amplificación normal muestra un aumento exponencial de la florescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35.

En las curvas de fusión derivadas, revise las regiones de pre y post fusión o las líneas de temperatura. Las regiones pre y post fusión deben estar dentro de un área plana donde no haya grandes picos o pendientes en los niveles fluorescentes. Si es necesario, establezca el inicio y la parada de las líneas de temperatura previa y posterior a la fusión, a una distancia aproximada de 0,5 grados centígrados entre sí.

Reinicie el análisis si los parámetros están ajustados haciendo clic en el botón analizar. En la pestaña de configuración de parcela de la pestaña de maceta de diferencia, elija una de las réplicas de control de tipo salvaje como ADN de referencia y reinicie el análisis haciendo clic en el botón analizar. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, confirme que todos los controles positivos tengan el genotipo correcto y que el NTC no se haya amplificado.

De la tabla de pocillos, seleccione un pozo de control para resaltar la curva de fusión correspondiente en las parcelas de análisis y confirme que el color de la línea corresponde al genotipo correcto. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, revise detenidamente las visualizaciones de los gráficos de las muestras desconocidas y compárelas con las visualizaciones de los gráficos de los controles. Seleccione los pocillos que contienen las réplicas de la muestra desconocida y alinee las curvas de fusión con los controles en una secuencia ordenada seleccionando los pocillos que contienen controles uno por uno.

Analice el resultado de la muestra desconocida en la pestaña Gráfica de diferencias para comprobar que los resultados obtenidos son coherentes. Seleccione los pocillos que contienen las réplicas de muestra desconocida y alinee las curvas de fusión con los controles en una secuencia ordenada, seleccionando los pocillos que contienen controles uno por uno. Ejecute productos qPCR HRM en un gel prefabricado de agarosa al 4 % que contenga una cepa de ácido nucleico fluorescente.

Ejecute solo un NTC negativo positivo y se replica la qPCR HRM de muestra. Retire el gel prefabricado y el casete del paquete, luego retire el peine e inserte el gel en el aparato de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir una muestra de 10 microlitros a 20 microlitros con agua estéril libre de ARN y ADN y cargar cada pocillo con 20 microlitros de la muestra diluida.

Diluya tres microlitros de solución estándar del tamaño del ADN en 20 microlitros y cárguela en el pocillo marcador. Llene los pozos vacíos con 20 microlitros de ARN estéril y agua libre de ADN. Seleccione inmediatamente el programa de acuerdo con el porcentaje de gel que se está ejecutando y configure el tiempo de ejecución en el aparato en 20 minutos.

Inicie la electroforesis dentro de un minuto después de cargar las muestras. Una vez completada la electroforesis, visualice el ADN y el gel mediante el uso de luz azul o transiluminación UV. Y la región de interés de ADN amplificada con éxito con un aumento exponencial de fluorescentes que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 y valores muy estrechos del ciclo de cuantificación en todas las réplicas y controles es un requisito previo para la identificación fiable de la variación genética mediante análisis de fusión de alta resolución.

El análisis HRM se realiza inmediatamente después de la qPCR, las regiones de fusión activas de las muestras, los controles y el NTC se utilizan para crear sus gráficos de curva de fusión alineados. Las regiones pre y post fusión correctamente establecidas son importantes para visualizar e identificar correctamente la variación genética en las muestras. Aquí se muestran las curvas de fusión alineadas y los diferentes potes.

Las muestras desconocidas están estrechamente alineadas con uno de los controles positivos. Las regiones de pre y post fusión o las líneas de temperatura configuradas incorrectamente dan como resultado curvas de fusión alineadas y diferentes gráficos donde la identificación correcta de la varianza genética es más difícil. La variante genética en la muestra se puede identificar comparando el patrón de bandas de la muestra con los controles.

Y combinando la HRM y la electroforesis en gel de agarosa. La identificación correcta de la variante genética solo se puede realizar para las muestras que contienen la misma variante genética que uno de los controles utilizados en el ensayo HRM. Las muestras que contienen variantes genéticas raras de calreticulina difieren en el resultado de la HRM y el patrón de bandas de electroforesis.

Al intentar este protocolo, es importante comparar cuidadosamente las visualizaciones de los gráficos de la curva de fusión alineada de las muestras conocidas y de control.