Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

Este protocolo es importante porque permite la utilización de los sistemas de traducción libre de células existentes para el análisis de una sola molécula de la traducción eucariota activa. Las principales ventajas de esta técnica son que conserva las propiedades de traducción masiva, proporciona una resolución de una sola molécula y es relativamente fácil de adaptar a partir de otros ensayos de traducción masiva. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de traducción sin celdas que se haya verificado que permite una traducción eficiente dependiente de la tapa en condiciones masivas.

Hongyun Wang, investigador asociado, y Anthony Gaba, científico investigador principal del laboratorio Xiaohui Qu, demostrarán el procedimiento. Al menos tres horas antes de realizar un experimento de una sola molécula, encienda la incubadora del microscopio y reduzca el flujo de aire a una tasa baja para evitar una perturbación acústica excesiva del experimento. A continuación, ajuste la temperatura de la incubadora a la temperatura óptima específica para el sistema de traducción sin células.

Al menos una hora antes del experimento, presione el botón de encendido del láser detrás de la caja del láser, gire la llave de seguridad del láser y presione el botón de inicio para encender el láser. Encienda el microscopio y seleccione el modo de imagen, el objetivo y el conjunto de filtros. Encienda la cámara EMCCD, el controlador de etapa, la bomba de jeringa y la computadora y abra el software de la cámara, el láser, la etapa motorizada y la bomba de jeringa.

En el software de control láser, haga clic en conectar para establecer la intensidad del láser, desmarque la casilla del obturador y haga clic en control para arrastrar la barra deslizante de intensidad en la ventana emergente de control láser. Introduzca la profundidad de penetración para ajustar el láser al ángulo deseado y confirme que la caja del obturador esté cerrada para mantener el láser en el modo apagado cuando no esté tomando imágenes. Cuando la cámara se haya enfriado y estabilizado a su temperatura de trabajo designada, en el software de la cámara, seleccione cinética para el modo de adquisición e introduzca los parámetros de tiempo de exposición, longitud de la serie cinética y valor de ganancia de multiplicación de electrones.

Seleccione el directorio y asigne nombres de archivo para guardar el archivo de imagen de datos. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de modesto a rápido y agregue 500 microlitros de etanol al 70% a un tubo de microfuga. Inserte el extremo del tubo de la bomba de jeringa en la solución de etanol y use el software de la bomba de jeringa para alternar la bomba de jeringa entre los modos de extracción y dispensación para lavar el tubo tres veces con etanol y tres veces con agua sin RNasa.

Después del lavado final con agua, frote el extremo del tubo con una toallita de papel limpio para eliminar cualquier agua residual del interior del tubo y coloque el extremo del tubo en un tubo de microfuga limpio. Para la inmovilización de ARNm biotinilado de tres extremos primarios, coloque la cámara de flujo en el portamuestras del microscopio con el lado del cubreobjetos hacia abajo y asegure la cámara con cinta adhesiva. Use la cinta para cubrir las entradas y salidas del canal de flujo que no estén en uso y agregue 1.5 veces el volumen de una solución de estreptavidina de 200 microgramos por mililitro al canal de flujo.

Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave y limpie el canal tres veces con tres veces el volumen del tampón de lavado T50 por lavado y el pañuelo de laboratorio doblado. Después del último lavado, coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio y coloque el soporte y la cámara en la platina del microscopio. A continuación, acerque el objetivo al cubreobjetos hasta que el aceite de inmersión del objetivo entre en contacto con el cubreobjetos y mueva la platina de muestra de modo que la posición del canal de flujo esté directamente encima de la lente del objetivo.

En la pantalla táctil de control del microscopio, seleccione la pestaña de enfoque y haga clic en búsqueda de enfoque e inicio. Se escuchará un pitido cuando el plano de enfoque se alcance con éxito. En el software de la cámara, seleccione el modo en vivo.

En el software de control láser, abra el obturador láser y ajuste el nivel de intensidad del láser. Observe la imagen de fluorescencia en tiempo real en el modo en vivo y en la pantalla táctil de control del microscopio utilizando el control de paso fino para ajustar la posición del objetivo. En el software de la cámara, mueva la platina para evaluar el nivel de fondo de fluorescencia en varias áreas de la superficie de detección del canal de flujo.

Si la fluorescencia es baja, detenga el modo en vivo y cierre el obturador láser en el software de control láser y reemplace el tampón de lavado del canal de flujo con dos veces el volumen de la solución de ARNm biotinilado. Después de 15 minutos, lave el canal tres veces con tres veces el volumen del tampón compatible con la traslación por lavado. Para la detección de una sola molécula, ensamble tres veces el volumen de la mezcla de traducción recién descongelada sin ARNm y complementada con una concentración optimizada de anticuerpos marcados con fluorescencia en un tubo de microcentrífuga sobre hielo y gire brevemente el tubo para recoger la mezcla en la parte inferior del tubo.

Transfiera la mezcla de traducción al interior de la tapa de un tubo de microfuga de 700 microlitros y configure la bomba de jeringa en el modo de extracción. Inserte el extremo del tubo de la bomba en la mezcla de traslación e inicie la extracción de la jeringa. Cuando la mezcla de traducción haya entrado completamente en el tubo de la bomba, detenga la extracción, invierta la configuración de la bomba de jeringa al modo de dispensación y ajuste el flujo a una tasa óptima para la administración de la mezcla de traducción.

Encienda y detenga la jeringa para permitir que la mezcla de traducción llegue al final del tubo según sea necesario e inserte el extremo del tubo de la bomba en la entrada del canal de flujo, teniendo cuidado de evitar burbujas. Atornille el soporte metálico hecho a medida en la placa del soporte de muestras del microscopio para estabilizar la conexión y evaluar el enfoque del microscopio y la fluorescencia del área de imagen. Confirme que los parámetros de adquisición de películas son correctos y que se han introducido el nombre de archivo y el directorio adecuados para guardar los archivos.

Mueva la platina para permitir la obtención de imágenes de un área en el centro de la superficie de detección del canal de flujo. Y en la pestaña AF continuo, haga clic en los botones de inicio. Se escuchará un pitido cuando se haya alcanzado con éxito un plano de enfoque.

Después de reducir la luz ambiental, abra el obturador láser y haga clic en el botón tomar señal para comenzar a grabar. Después de cinco segundos, introduzca el comando run para entregar la mezcla de traducción en el canal de flujo. A continuación, grabe los datos durante un máximo de dos horas con una resolución de 0,5 a dos segundos por fotograma.

Para analizar los eventos de unión Cy3 ANTI-FLAG, se calcularon las intensidades de fluorescencia de los puntos de bandera alfa Cy3 seleccionados cuadro por cuadro para toda la película y se conectaron para formar una trayectoria de intensidad. Las trayectorias sin procesar pueden parecer ruidosas y pueden requerir un refinamiento con un filtro no lineal hacia adelante/atrás para reducir el ruido de fondo. Se puede lograr un mayor refinamiento utilizando algoritmos de detección de pasos para digitalizar trayectorias.

La unión de anticuerpos a un polipéptido naciente provoca un aumento instantáneo de la fluorescencia, mientras que la disociación del polipéptido del anticuerpo provoca una disminución instantánea de la fluorescencia. El histograma de tiempo de permanencia para el ARNm bandera de luciferasa se ajusta a una distribución normal logarítmica y produce una tasa de síntesis de péptidos de 2,5 más o menos 0,1 aminoácidos por segundo. El histograma del primer tiempo de llegada se ajusta a una función normal logarítmica desplazada, lo que ilustra el alto grado de heterogeneidad en la actividad de traducción de ARNm único.

Como indica el histograma, el primer evento de síntesis de péptidos en moléculas de ARNm de bandera de luciferasa individuales puede comenzar tan pronto como dos minutos y tan tarde como 20 minutos después de la administración de la mezcla de traducción. En comparación con la traducción con ARNm de bandera de luciferasa, el primer histograma de tiempo de llegada con traducción de ARNm de bandera de luciferasa de horquilla mostró una unión de anticuerpos más lenta. Sin embargo, el uso de mediciones masivas de luminiscencia de reacciones de traducción libre de células con estos mismos ARNm no resuelve las diferencias en la cinética de traducción.

La resolución de una sola molécula de este ensayo proporciona más información cinética de la traducción dependiente de la cápsula que no se puede lograr fácilmente con otros enfoques. La traducción libre de células eucariotas es sensible a pequeñas variaciones y condiciones experimentales. Por lo tanto, la atención al detalle y la coherencia son fundamentales cuando se utiliza este ensayo para detectar con precisión pequeñas diferencias en la traducción.