Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

Este protocolo brinda a los científicos la oportunidad de caracterizar cristales de proteínas incrustados en materiales altamente viscosos, así como otros materiales blandos que actualmente son difíciles de caracterizar utilizando las configuraciones existentes. Con este método, las muestras se preparan en jeringas de vidrio, montadas directamente en el inyector, lo que hace que el sistema de inyectores sea fácil de usar y minimice el desperdicio de muestras. Para preparar cristales en un medio de alta viscosidad, primero centrifugar la solución de cristal a baja velocidad para formar una bolita de cristal suave.

Después de eliminar el exceso de medio, fije un acoplador al extremo de una jeringa de vidrio de 100 microlitros y cargue 28 microlitros de la solución de cristal en el cilindro de la jeringa. Inserte lentamente el émbolo en la parte superior de la jeringa y empuje suavemente la solución hasta el extremo de la punta del acoplador. Para eliminar las burbujas, use un dedo enguantado para aplicar una presión muy suave en la parte superior de la punta de la aguja del acoplador desafilada para crear un sello y retraiga el émbolo para alejar la solución de la punta de la aguja y crear una acumulación de presión dentro de la jeringa, luego retire el dedo para liberar rápidamente la presión y reventar las burbujas dentro de la jeringa.

Alternativamente, sostenga la jeringa en una mano con la aguja hacia arriba y el émbolo encajado entre dos dedos y gire rápidamente el brazo que sostiene la jeringa en una dirección dos o tres veces. La fuerza centrífuga resultante expulsará las burbujas de aire de la jeringa. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, use una espátula fina para agregar 42 microlitros de grasa de silicona de alto vacío directamente a la parte superior de una segunda jeringa de 100 microlitros y presione el émbolo hasta el final para eliminar las burbujas de aire y asegurarse de que no haya espacio de aire en el extremo de la jeringa.

Cuando se hayan eliminado todas las burbujas de ambas jeringas, sosteniendo ambas jeringas por los extremos, conecte las jeringas con el acoplador. Para mezclar las muestras, presione suavemente secuencialmente la solución de cristal y los émbolos de la jeringa de grasa de silicona de 50 a 100 veces hasta que los materiales se mezclen completamente y parezcan homogéneos. A continuación, visualice los cristales bajo un microscopio óptico.

Para determinar la concentración de cristales en la grasa de silicona, cuente el número de cristales en un área específica utilizando las imágenes del microscopio óptico. Para disminuir la concentración de cristales, repita la preparación de cristales utilizando un mayor volumen de grasa de silicona o diluya el pellet de cristal en tampón de cristalización antes de la configuración de la jeringa. Para aumentar la concentración de cristales, repita la preparación de cristales utilizando un volumen menor de grasa de silicona, teniendo cuidado de no reducir la viscosidad por debajo de 10 segundos pascales.

Cuando se haya obtenido la concentración adecuada de cristales, mueva toda la muestra a una sola jeringa y reemplace el acoplador con una aguja de inyección de 108 micras de diámetro interior atornillada muy firmemente en la base de la jeringa. Para configurar el inyector, seleccione las herramientas y el modo de referencia y el interruptor de límite negativo y comience a buscar y deje que el software funcione hasta que el tornillo se retraiga lo suficiente como para que una jeringa de 100 microlitros quepa debajo del tornillo. Inserte la aguja de una jeringa vacía a través de la ranura en el soporte de la jeringa para montar la jeringa en el inyector y alinee la jeringa contra el soporte.

Envuelva una junta tórica a través de la sección media de la jeringa, fijando el anillo a los ganchos a cada lado de la jeringa y enrolle una segunda junta tórica alrededor de los ganchos en la sección superior de la jeringa. Asegúrese de que una parte de la segunda junta tórica esté colocada encima de la jeringa de vidrio. Para preparar la jeringa de muestra, cebe la jeringa, coloque la tapa del inyector en el cabezal del émbolo de la jeringa de muestra y cargue la jeringa en el inyector.

Mueva el tornillo de accionamiento a la parte superior de la tapa. En el software de control del inyector, seleccione el modo de velocidad y active el modo de velocidad. Establezca el valor de configuración en 3.000 revoluciones por minuto y haga clic en aplicar valor de configuración.

A medida que el tornillo se acerque a la tapa del cabezal del émbolo de la jeringa, cambie el valor de ajuste a cero. Una vez que se realiza el contacto, haga clic en aplicar valor de configuración para activar el valor preestablecido, deteniendo el tornillo al instante. A continuación, mueva suavemente la tapa para asegurarse de que queda firmemente sujeta en su lugar.

Para hacer funcionar el inyector, cambie el valor de ajuste a 100 revoluciones por minuto e inspeccione visualmente la punta para observar la muestra a medida que comienza a extruirse. Después de cerrar la conejera, disminuya el valor de ajuste en decrementos de 10 hasta que se observe un flujo lento pero estable de material. Si el flujo de muestra no fluye bien, aumente el valor de ajuste en incrementos de 10 revoluciones por minuto hasta que el flujo se vuelva más recto.

Si el chorro no se estabiliza, inserte un recogedor de muestras de poliestireno debajo del chorro de muestras para ayudar a guiar la muestra. Alternativamente, inserte un embudo de succión Venturi en el recogedor de muestras, que se puede conectar al tubo de salida de aire ubicado en la caseta del sincrotrón australiano. Para determinar el caudal de la corriente, utilice la calculadora de caudal del dispositivo Lipidico.

Determinar la velocidad óptima de funcionamiento de la muestra para el inyector es crucial para la estabilidad del flujo. Un caudal lento da como resultado una expansión de la grasa de silicona que sale del inyector, mientras que un caudal más rápido produce un chorro más delgado. Regularmente se ha observado el enroscamiento de la corriente de medios viscosos.

Para superar este problema en muestras altamente cargadas, se puede usar un colector de poliestireno para introducir una fuerza electrostática débil. En este análisis se utilizó una jeringa de vidrio que contenía 26 microlitros de cristales de lisozima suspendidos en grasa de silicona. Se recopiló una cantidad suficiente de datos en 38 minutos, lo que permitió la generación del mapa de densidad electrónica que rodea a los enlaces disulfuro en la estructura de lisozima.

Recuerde usar un pequeño volumen de muestra en el portaobjetos de vidrio para evaluar la concentración de cristal de la muestra y determinar si es necesario corregir la viscosidad. La versatilidad del inyector permite la caracterización radiográfica de otros materiales altamente viscosos. Por ejemplo, estructuras líquidas iónicas que utilizan investigación con baterías o materiales coloidales que utilizan productos lácteos.