Name: Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a preparar cristales proteicos en medios viscosos para cristalografía en serie usando el inyector Lipidico en el sincrotrón australiano. Este protocolo minimiza el desperdicio de muestra y facilita la caracterización de materiales blandos.

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Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Imágenes Moleculares Avanzadas (CE140100011) del Consejo Australiano de Investigación (http://www.imagingcoe.org/). Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, y hizo uso del detector de la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer (ACRF).

1. Preparación de cristales en un medio viscoso alto utilizando jeringas de vidrio
<ol><li>Centrífuga la solución de cristal suavemente (~ 1,000 x g, ~ 10 min a 22 °C) para formar un pellet de cristal suave y eliminar el exceso de búfer. Esto dará lugar a una alta concentración de cristales en el pellet que se puede utilizar para la recopilación de datos. NOTA: Para evitar la dilución del medio viscoso aumentar la concentración de cristal en este paso. Optimice la relación entre el medio viscoso y el volumen de cristal para cada muestra para obtener una alta concentración de cristales manteniendo una alta viscosidad para los medios. Centrífuga la solución de cristal para formar un pellet y eliminar el exceso de amortiguador para aumentar la concentración de cristal en la solución, como se describe en Darmanin et. 29.</li>
	<li>Configure dos jeringas de 100 μL con un acoplador.</li>
	<li>Fije el acoplador hasta el final de la primera jeringa y agregue 28 μL de solución de cristal a la parte superior de la jeringa. Lentamente, inserte el émbolo en la parte superior de la jeringa y empuje suavemente la solución hasta el final de la punta del acoplador, eliminando las burbujas de aire que se formen. Para ello, siga uno de los dos métodos que se describen a continuación. NOTA: El volumen de cristales que se añadirán al soporte viscoso alto puede variar si no cambia significativamente la viscosidad de la muestra general.<ol>
<li>Primer método: Utilice cambios rápidos de presión para reventar las burbujas de aire.<ol>
<li>Coloque cuidadosamente un dedo con guantes en la parte superior del punto de aguja del acoplador contundente y (muy suavemente) aplique presión para crear un sello. No aplique demasiada presión, ya que esto puede resultar en una lesión en el palo de la aguja.</li>
			<li>Ahora tire del émbolo hacia atrás para alejar la solución del punto de la aguja, esto generará una acumulación de presión en la jeringa.</li>
			<li>Suelte rápidamente la presión en la parte superior de la jeringa quitando el dedo enguantado de la punta de la aguja contundente. Tenga cuidado, si la muestra está demasiado cerca de la punta cuando se retira el dedo puede rociar resultando en la pérdida de la muestra. El rápido cambio de presión dentro de la jeringa reventará las burbujas de aire. Repita hasta que se hayan eliminado todas las burbujas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segundo método: Usar la "centrífuga humana" para eliminar las burbujas de aire.<ol>
<li>Coloque la jeringa en una mano con la aguja hacia arriba y el émbolo encajado entre dos dedos, para que no pueda moverse.</li>
			<li>Gire rápidamente el brazo sosteniendo la jeringa en una dirección 2–3 veces, la fuerza centrífuga resultante en la muestra forzará cualquier burbuja de aire fuera de la jeringa. Tenga cuidado, si se hace demasiado lentamente la muestra se puede perder.</li>
			<li>Inspeccione la jeringa en busca de burbujas de aire, si las burbujas permanecen, repita los pasos 1.3.2.1 – 1.3.2.2 hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Usando una espátula fina, agregue ~42 μL de grasa de silicona de alto vacío directamente a la parte superior de la segunda jeringa. Empuje el émbolo hasta el final, eliminando todas las burbujas de aire y asegurándose de que no haya brecha de aire en el extremo de la jeringa. NOTA: La composición precisa de la grasa de silicona no es crítica, ya que actúa como un portador inerte. Un valor de viscosidad de >10 Pa.s o relación de aproximadamente 60:40 grasa de silicona a solución cristalina es óptimo para la inyección, sin embargo, es posible que esto pueda variar dependiendo de las características exactas de la muestra. Ajuste el volumen de solución de cristal añadido a la grasa de silicona para optimizar la concentración de cristal en la mezcla, como se describe en la discusión. Los medios altamente viscosos distintos de la grasa de silicona se pueden utilizar siempre y cuando sean compatibles con la muestra30,31,32,33.</li>
	<li>Asegúrese de que no haya burbujas de aire en ninguna de las dos jeringas y unir las jeringas usando el acoplador. Sostenga las jeringas verticalmente agarrando sólo el extremo de la jeringa, ya que calentar la jeringa debido al calor generado por los dedos puede afectar a la muestra.</li>
	<li>Mezcle la muestra deprimiendo suavemente el émbolo en el lado de la solución de cristal para que se mezcle en la grasa de silicona y luego empuje el émbolo en el lado de la grasa de silicona, de modo que empuje la muestra hacia el lado de la solución de cristal. Suavemente, repita este proceso de 50 a 100 veces para que la muestra se mezcle a fondo y se vea homogénea. NOTA: Si los cristales se cultivan directamente en medios altamente viscosos (por ejemplo, fase cúbica lipídica, LCP), no se requieren pasos 1.1–1.6. Los protocolos para el cultivo de cristales dentro de las jeringas se pueden encontrar en Liu et.al. 34,35. Siga este protocolo hasta la consolidación de muestras, paso 10, donde toda la muestra está ahora contenida en una jeringa y se elimina el búfer de cristalización. La adición de 7.9MAG no es necesaria para este protocolo. En su lugar, retire todo el exceso de líquido de la jeringa empujando suavemente el émbolo hacia abajo en la muestra hasta que no quede más líquido en la jeringa.</li>
	<li>Visualice los cristales bajo un microscopio óptico a través de la jeringa o, para obtener mejores resultados, extraiga una pequeña cantidad (~1 μL) en una diapositiva de vidrio y coloque un resbalón de cubierta en la parte superior.</li>
	<li>Compruebe la concentración de cristal.<ol>
<li>Determine la concentración de cristal en la grasa de silicona contando el número de cristales en un área específica utilizando las imágenes ópticas del microscopio. Para obtener mejores resultados, una alta densidad de cristales dispensados uniformemente en todo el medio es ideal (>106 cristales/ml) con el fin de obtener una alta tasa de golpe de cristal.</li>
		<li>Ajuste la concentración de cristal en la jeringa cambiando la relación de cristales a medios viscosos en los pasos 1.3 y 1.4.<ol>
<li>Para disminuir la concentración de cristal, diluya los cristales de la jeringa aumentando la cantidad de grasa de silicona/soporte HV en el paso 1.4 o diluyendo el pellet de cristal en solución con el búfer de cristalización antes de configurar las jeringas en el paso 1.1.</li>
			<li>Para aumentar la concentración de cristal, disminuya la cantidad de grasa de silicona en el paso 1.4, pero tenga en cuenta no reducir la viscosidad por debajo de 10 Pa.s. NOTA: La concentración de cristal reportada aquí fue optimizada para esta muestra específica y tamaño de cristal. Sin embargo, la concentración de cristal ideal dependerá del tamaño del cristal, el tamaño del haz, el diámetro interno de la aguja (I.D.) y el flujo de rayos X incidente. Esto se puede determinar a partir de la tasa de golpe con una tasa de golpe óptima de ~ 30% considerado como 'bueno'. En la práctica, la concentración de cristal debe optimizarse para diferentes muestras durante el tiempo de haz para obtener la velocidad de golpe deseada. Comienza con una alta concentración de cristales, 109 cristales/ml. El procedimiento para ajustar la concentración de cristal se administra en Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>El protocolo se puede pausar aquí hasta que el inyector esté listo para la recopilación de datos.<ol>
<li>Si los cristales se cultivan en LCP, entonces escindelos y déjelos permanecer en jeringas hasta por unos días a temperatura ambiente.</li>
			<li>Si los cristales se han transferido a un medio viscoso alto diferente (por ejemplo, grasa de silicona), se debe realizar una prueba de estabilidad de los cristales a lo largo del tiempo antes de la medición. Esto determinará cuánto tiempo los cristales son estables en el medio inerte (idealmente > 8 h) y el límite de tiempo para la recopilación de datos. Aquí, los cristales de lysozyme estuvieron estables durante días en grasa de silicona y no mostraron signos de disolución cuando se inspeccionaron con un microscopio óptico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mueva toda la muestra a una jeringa antes de desconectar el acoplador. Desconecte el acoplador de la jeringa y coloque la aguja de inyección. Atornille firmemente la aguja en la base de la jeringa y asegúrese de que esté fijada firmemente para evitar fugas. Para este experimento se utilizó una aguja de identificación de 108 μm (longitud de la aguja 13 mm, estilo punto 3). Dependiendo del tamaño del cristal y del tamaño del haz, coloque una aguja de identificación de 51 μm o 108 μm. NOTA: Se requiere una prueba previa de la secuencia de muestras antes del tiempo de haz para poder seleccionar el tamaño correcto de la aguja del inyector. Dependiendo de las características de la muestra (es decir, viscosidad, carga, composición del búfer) y la identificación de la aguja, las muestras fluirán de manera diferente. Por lo tanto, se recomienda probar una variedad de tamaños de aguja para producir el flujo más estable con la aguja de identificación más pequeña posible para maximizar la relación señal-ruido durante la recopilación de datos.</li>
	<li>Si el inyector ya está montado y alineado en la línea de haz, muévase a la sección 3 y monte la jeringa de muestra directamente en el inyector. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>2. Montaje y control del inyector
<ol><li>Monte el inyector en la línea de haz. Retire la boquilla criogénica en la línea de haz MX2 y la reemplazó con el inyector. Afloje el tornillo de sujeción que sostiene la boquilla criogénica y colóquela en el soporte situado junto a la etapa motorizada.</li>
	<li>Levante el inyector de su carro sosteniendo la manija negra y colóquela en el escenario motorizado.<ol>
<li>Para sujetar el inyector a la etapa motorizada; apretar a mano la perilla del tornillo de sujeción negro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte una jeringa vacía en el inyector<ol>
<li>En la interfaz de control del ordenador del inyector (es decir, software de control de posición EPOS), seleccione Modo de homing en Herramientas en el menú de software. A continuación, seleccione Interruptor de límite negativo y Inicie Homing, deje que el software funcione hasta que el tornillo se retraiga lo suficiente como para que la jeringa encaje debajo del tornillo. Si se deja ejecutar sin supervisión, el interruptor de límite detiene el tornillo automáticamente.</li>
		<li>Monte una jeringa vacía ('maniquí') en el inyector insertando la aguja a través de la hendidura en el soporte de la jeringa. Alinee la jeringa contra el soporte.</li>
		<li>Abrocha la jeringa con dos O-anillos.<ol>
<li>Envuelva el primer anillo O a través de la sección media de la jeringa que lo une a los ganchos a ambos lados de la jeringa.</li>
			<li>Enrosque el segundo anillo O alrededor de los ganchos en la sección superior de la jeringa y luego coloque una parte del anillo O en la parte superior de la jeringa de vidrio como se muestra en la demostración y la Figura 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinee el inyector con el haz de rayos X<ol>
<li>Mueva la etapa motorizada con el inyector hacia el punto de interacción de rayos X a través del software de control de la línea de haz. Esto se puede visualizar utilizando la cámara en línea. El tamaño y la posición de la viga son denotados por una cruz roja en la pantalla y la etapa motorizada se puede mover para alinear la aguja con la región de interacción de rayos X.</li>
		<li>Ajuste la posición x e y del escenario para alinear la aguja con la cruz roja.</li>
		<li>Ajuste la posición z hasta que la punta de la aguja entre en el foco.</li>
		<li>Verifique la alineación de la punta de la aguja y el haz de rayos X visualmente comprobando que la punta de la jeringa se encuentra con el punto de mira que son visibles en la imagen del microscopio óptico generada por la cámara de línea de haz.</li>
		<li>Una vez alineada la punta de la aguja, mueva la punta por encima de los pelos cruzados ~100 μm. Esto elimina la dispersión de rayos X de la punta de la aguja. NOTA: El montaje y alineación del inyector en la línea de haz MX2 en el sincrotrón debe ser llevado a cabo por los científicos de la línea de haz y se puede completar en menos de 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montaje de la jeringa de muestra
<ol><li>Reemplace la jeringa vacía por la jeringa de muestra siguiendo el paso 2.3.</li>
	<li>Coloque la tapa del inyector en la cabeza del émbolo de la jeringa de muestra.</li>
	<li>Mueva el tornillo de accionamiento a la parte superior de la tapa.</li>
	<li>En el software de control del inyector, seleccione Modo velocidad.</li>
	<li>Entrada 3000 rpm (~115 nL/s) como valor de ajuste y pulse Aplicar valor de ajuste.</li>
	<li>Cuando el tornillo de accionamiento toque la tapa de la cabeza del émbolo de la jeringa, detenga el motor.<ol>
<li>Ajuste el valor de rpm a cero en el software de control del inyector cambiando el Valor de ajuste a '0' a medida que el tornillo se acerca a la tapa.</li>
		<li>Una vez realizado el contacto, active el valor preestablecido pulsando Aplicar valor de ajuste para detener el tornillo al instante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mueva suavemente la tapa para asegurarse de que está firmemente sujetada en su lugar. NOTA: Cada vez que se introduce un nuevo valor establecido en el cuadro Valor de configuración del software de control, solo se activa después de pulsar Aplicar valor de ajuste.</li>
</ol>4. Ejecutar el inyector
<ol><li>Después de que el tornillo de la unidad de tapa ha hecho contacto firme con la parte superior del émbolo cambiar el valor de ajuste rpm a 100. Esto equivale a ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Inspeccione visualmente la punta de la aguja cuando la muestra salga por primera vez o mire la imagen de la cámara de la aguja para observar cuándo la muestra comienza a extruirse de la punta de la aguja.</li>
	<li>Realice una búsqueda de la choza, cierre la puerta de la choza y encienda la viga de rayos X. A partir de este punto el inyector debe ser operado remotamente desde fuera de la cabaña.</li>
	<li>Ajuste las rpm hasta que se genere una secuencia estable.<ol>
<li>Disminuya el valor de ajuste de rpm a 90.</li>
		<li>Repita el paso 4.4.1, disminuyendo el valor de ajuste de rpm en incrementos de 10, para ralentizar la secuencia, pero aún así mantener una secuencia estable. Para la grasa de silicona se utilizó un valor de 30 rpm. NOTA: El rango de rpm típico varía entre 30 – 100 rpm (1 – 4 nL/s) dependiendo de las características de la muestra y el tiempo de exposición a rayos X. En general, las rpm deben ajustarse para producir el caudal más lento (para minimizar el consumo de la muestra) manteniendo al mismo tiempo una corriente estable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Administrar una secuencia de ejemplo que no fluya bien.<ol>
<li>Siga aumentando el valor de ajuste de rpm en incrementos de 10 hasta que la secuencia se vuelva más recta. Si la secuencia no se estabiliza, incluso después de aumentar el valor de ajuste de rpm al valor máximo de 100 rpm intente mejorar la estabilidad mediante la implementación de uno de los dos métodos descritos a continuación.<ol>
<li>Primer método: Inserte un captador de muestras de poliestireno debajo de la secuencia de muestras para ayudar a guiar la muestra. Este método funciona bien para secuencias de ejemplo altamente cargadas.</li>
			<li>Segundo método: Inserte un embudo de succión venturi en el captador de muestras. Para suministrar aire al embudo, conéctelo al tubo de salida de aire situado en la choza. Este método puede ayudar a dirigir y estabilizar el flujo de muestra independientemente de la carga de la corriente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que se logra un flujo constante y constante, inicie la recopilación de datos y optimice la distancia del detector según un experimento de cristalografía de rayos X normal. NOTA: Las rpm se convierten en caudal utilizando la tabla de conversión suministrada en la información suplementaria, 'Calculadora de dispositivos Lipidico'. Introduzca el valor de rpm, los diámetros de las agujas y los volúmenes de jeringas para calcular el caudal utilizando esta calculadora.</li>
</ol>

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</ol>

MK trabaja para diseños de Kusel. Kusel Design, un desarrollador de dispositivos de laboratorio personalizado, fue contratado por el Dr. Peter Bentsen de la Universidad La Trobe y el Dr. Tom Caradoc-Davies de ANSTO y para desarrollar un dispositivo de bajo costo para permitir estudios de alto viscoso en la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano. El dispositivo fue desarrollado en estrecha consulta con el Dr. Caradoc-Davies. Los autores no tienen intereses financieros competidores.

Se ha desarrollado un HVI alternativo, ideal para llevar a cabo experimentos SX en fuentes sincrotrón. Tiene dos ventajas clave sobre los HVIs existentes. En primer lugar, es fácil de instalar en la línea de haz que permite el cambio rápido entre la cristalografía convencional y SX, sólo ~ 30 minutos es necesario para la instalación y alineación en MX2. En segundo lugar, las jeringas de muestra utilizadas para cultivar cristales se pueden utilizar directamente como reservorios para inyección, lo que limita el desperdicio...

La cristalografía en serie (SX) es una técnica que se desarrolló inicialmente en el contexto de láseres electrónicos libres de rayos X (XFELs)1,2,3,4. Aunque los enfoques de destino fijos se pueden utilizar para SX5,6,7, normalmente, los sistemas de inyectores se emplean para entregar cristales en un flujo continuo al haz de rayos X. Debido a que combina datos de un gran número de cristales, SX evita la necesidad de cualquier alineación de cristal durante el experimento, y permite recopilar datos a temperatura ambiente8,9. Con la ayuda de un inyector adecuado, los cristales se transmiten uno por uno en el área de interacción de rayos X y los datos de difracción resultantes se recogen en un detector de área9,10. Hasta la fecha, SX ha tenido éxito en la resolución de una serie de estructuras proteicas1,11,12,13 incluyendo cristales demasiado pequeños para medir utilizando cristalografía convencional. También ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la dinámica molecular resuelta en el tiempo mediante la explotación de la duración del pulso femtosegundo de la XFEL. Al iniciar reacciones bomba-sonda con fuentes láser ópticas, se han realizado estudios en profundidad en el fotosistema II14,15,proteína amarilla fotoactiva16,17,citocromo C oxidasa18,así como bacteriorhodopsina19,20,21. Estos estudios han sondeado la dinámica de transferencia de electrones que se produce después de la activación de la luz que demuestra el potencial significativo de la cristalografía en serie para comprender los procesos biológicos resueltos por el tiempo.
El desarrollo de la cristalografía en serie también es cada vez más frecuente en las fuentes de sincrotrón9,12,20,22,23,24. SX basado en sincrotrón permite medir un gran número de cristales individuales eficientemente a temperatura ambiente utilizando un sistema de inyector adecuado. Este enfoque es adecuado para cristales más pequeños, por lo tanto, además de requerir un detector rápido de velocidad de fotogramas para recopilar los datos, también se requiere un haz microenfoque. En comparación con la cristalografía convencional, SX no implica el montaje y alineación de cristales individuales en el haz de rayos X. Debido a que los datos de un gran número de cristales individuales se fusionan, la dosis de radiación recibida por cada cristal se puede reducir sustancialmente en comparación con la cristalografía convencional. Synchrotron SX también se puede aplicar al estudio de reacciones resueltas en el tiempo, incluso hasta el régimen de milisegundos, siempre que haya un detector con una velocidad de fotogramas suficientemente alta (por ejemplo, 100 Hz o más). Se han llevado a cabo varios experimentos de cristalografía en serie en el sincrotrón utilizando inyectores que se desarrollaron inicialmente en fuentes XFEL20,22,23. Los dos tipos más comunes de inyector son la boquilla virtual dinámica de gas (GDVN)25 y el inyector viscoso alto (HVI)9,24,26,27,28. El GDVN es ideal para inyectar baja viscosidad, muestras líquidas, pero requiere altos caudales para lograr flujos estables, lo que a su vez conduce a altas tasas de consumo de muestras. Por el contrario, los HVI son adecuados para muestras de alta viscosidad que permiten la generación de una corriente estable a caudales mucho más bajos, lo que conduce a un consumo de muestra mucho menor. El inyector HVI, por lo tanto, favorece la entrega de muestras cuando un portador viscoso es preferible (por ejemplo, a base de lípidos para proteínas de membrana) y/o grandes cantidades de muestra no están disponibles. Los inyectores SX son generalmente difíciles de usar y requieren una amplia capacitación para operar. También implican largos protocolos de transferencia de muestras, ya que la muestra necesita ser cargada en un depósito especializado, esto generalmente tiene un alto riesgo asociado con que se pierda la muestra ya sea en el "volumen muerto" o a través de fugas en las conexiones. Por lo tanto, es deseable optimizar el diseño del inyector para mitigar cualquier pérdida antes de que la muestra llegue al haz de rayos X.
Recientemente, los primeros resultados de SX se publicaron usando Lipidico23 con un objetivo de lysozyme, utilizando un detector Eiger 16M. Este diseño del inyector limita el desperdicio de muestras al minimizar el número de pasos implicados en pasar de la cristalización inicial a la transferencia de cristales al inyector, seguido de la entrega de muestras al haz de rayos X. Este manuscrito describe y muestra el procedimiento de transferencia de muestras a partir de la preparación de la muestra, pasando al proceso de inyección y, finalmente, a la recopilación de datos, utilizando el mismo recipiente de cristalización. También se describe el funcionamiento del inyector.

<table><tbody><tr><td>Lisozima de clara de huevo de gallina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Se utiliza para cultivar cristales para probar el inyector y los cristales se transfieren a la grasa de silicona. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Grasa de silicona de alto vacío</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>Se utiliza para probar el inyector. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Aguja inyectora (108 &micro; m ID)</td><td>Nº</td><td>de pieza de Hamilton: 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Jeringas herméticas de vidrio, 100 y micro; l</td><td>Nº</td><td>de pieza de Hamilton: 7656-01</td><td>Jeringas utilizadas para la inyección de muestras. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Acoplador de jeringa LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>Acoplador de jeringa para mezclar las muestras</td></tr><tr><td>Inyector lipídico</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO</td><td></td><td>Se trata de un equipo específico al que se puede acceder a través de la Universidad de La Trobe / ANSTO Instalación Australiana de Sincrotrón</td></tr></tbody></table>

protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Se ha desarrollado una instalación para realizar mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. Esta instalación incorpora un inyector de alto viscoso construido específicamente, Lipidico, como parte de la línea de haz de cristalografía macromolecular (MX2) para medir un gran número de pequeños cristales a temperatura ambiente. El objetivo de esta técnica es permitir que los cristales se cultieran/transfieran a jeringas de vidrio para ser utilizados directamente en el inyector para la recopilación de datos de cristalografía en serie. Las ventajas de este inyector incluyen la capacidad de responder rápidamente a los cambios en el caudal sin interrupción de la corriente. Existen varias limitaciones para este inyector de alta viscosidad (HVI) que incluyen una restricción a las viscosidades de muestra permitidas a >10 Pa.s. La estabilidad de la secuencia también puede ser un problema en función de las propiedades específicas del ejemplo. Aquí se presenta un protocolo detallado sobre cómo configurar muestras y utilizar el inyector para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. El método demuestra la preparación de la muestra, incluyendo la transferencia de cristales de liozima a un medio viscoso alto (grasa de silicona), y el funcionamiento del inyector para la recolección de datos en MX2.

Lipidico es un HVI construido como un sistema de entrega alternativo para su uso en MX2 (Figura 1). Es ideal para SX, donde los cristales se cultivan en fase cúbica lipídica o se transfieren a un medio inerte viscoso alto.
Para demostrar la aplicación del inyector, la grasa de silicona mezclada con cristales de liozima se utilizó para recopilar datos SX en la línea de haz MX2 en el sincrotrón australiano. Para montar el inyector en la línea de haz MX2, la boquilla...

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.

Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Este protocolo brinda a los científicos la oportunidad de caracterizar cristales de proteínas incrustados en materiales altamente viscosos, así como otros materiales blandos que actualmente son difíciles de caracterizar utilizando las configuraciones existentes. Con este método, las muestras se preparan en jeringas de vidrio, montadas directamente en el inyector, lo que hace que el sistema de inyectores sea fácil de usar y minimice el desperdicio de muestras. Para preparar cristales en un medio de alta viscosidad, primero centrifugar la solución de cristal a baja velocidad para formar una bolita de cristal suave.Después de eliminar el exceso de medio, fije un acoplador al extremo de una jeringa de vidrio de 100 microlitros y cargue 28 microlitros de la solución de cristal en el cilindro de la jeringa. Inserte lentamente el émbolo en la parte superior de la jeringa y empuje suavemente la solución hasta el extremo de la punta del acoplador. Para eliminar las burbujas, use un dedo enguantado para aplicar una presión muy suave en la parte superior de la punta de la aguja del acoplador desafilada para crear un sello y retraiga el émbolo para alejar la solución de la punta de la aguja y crear una acumulación de presión dentro de la jeringa, luego retire el dedo para liberar rápidamente la presión y reventar las burbujas dentro de la jeringa.Alternativamente, sostenga la jeringa en una mano con la aguja hacia arriba y el émbolo encajado entre dos dedos y gire rápidamente el brazo que sostiene la jeringa en una dirección dos o tres veces. La fuerza centrífuga resultante expulsará las burbujas de aire de la jeringa. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, use una espátula fina para agregar 42 microlitros de grasa de silicona de alto vacío directamente a la parte superior de una segunda jeringa de 100 microlitros y presione el émbolo hasta el final para eliminar las burbujas de aire y asegurarse de que no haya espacio de aire en el extremo de la jeringa.Cuando se hayan eliminado todas las burbujas de ambas jeringas, sosteniendo ambas jeringas por los extremos, conecte las jeringas con el acoplador. Para mezclar las muestras, presione suavemente secuencialmente la solución de cristal y los émbolos de la jeringa de grasa de silicona de 50 a 100 veces hasta que los materiales se mezclen completamente y parezcan homogéneos. A continuación, visualice los cristales bajo un microscopio óptico.Para determinar la concentración de cristales en la grasa de silicona, cuente el número de cristales en un área específica utilizando las imágenes del microscopio óptico. Para disminuir la concentración de cristales, repita la preparación de cristales utilizando un mayor volumen de grasa de silicona o diluya el pellet de cristal en tampón de cristalización antes de la configuración de la jeringa. Para aumentar la concentración de cristales, repita la preparación de cristales utilizando un volumen menor de grasa de silicona, teniendo cuidado de no reducir la viscosidad por debajo de 10 segundos pascales.Cuando se haya obtenido la concentración adecuada de cristales, mueva toda la muestra a una sola jeringa y reemplace el acoplador con una aguja de inyección de 108 micras de diámetro interior atornillada muy firmemente en la base de la jeringa. Para configurar el inyector, seleccione las herramientas y el modo de referencia y el interruptor de límite negativo y comience a buscar y deje que el software funcione hasta que el tornillo se retraiga lo suficiente como para que una jeringa de 100 microlitros quepa debajo del tornillo. Inserte la aguja de una jeringa vacía a través de la ranura en el soporte de la jeringa para montar la jeringa en el inyector y alinee la jeringa contra el soporte.Envuelva una junta tórica a través de la sección media de la jeringa, fijando el anillo a los ganchos a cada lado de la jeringa y enrolle una segunda junta tórica alrededor de los ganchos en la sección superior de la jeringa. Asegúrese de que una parte de la segunda junta tórica esté colocada encima de la jeringa de vidrio. Para preparar la jeringa de muestra, cebe la jeringa, coloque la tapa del inyector en el cabezal del émbolo de la jeringa de muestra y cargue la jeringa en el inyector.Mueva el tornillo de accionamiento a la parte superior de la tapa. En el software de control del inyector, seleccione el modo de velocidad y active el modo de velocidad. Establezca el valor de configuración en 3.000 revoluciones por minuto y haga clic en aplicar valor de configuración.A medida que el tornillo se acerque a la tapa del cabezal del émbolo de la jeringa, cambie el valor de ajuste a cero. Una vez que se realiza el contacto, haga clic en aplicar valor de configuración para activar el valor preestablecido, deteniendo el tornillo al instante. A continuación, mueva suavemente la tapa para asegurarse de que queda firmemente sujeta en su lugar.Para hacer funcionar el inyector, cambie el valor de ajuste a 100 revoluciones por minuto e inspeccione visualmente la punta para observar la muestra a medida que comienza a extruirse. Después de cerrar la conejera, disminuya el valor de ajuste en decrementos de 10 hasta que se observe un flujo lento pero estable de material. Si el flujo de muestra no fluye bien, aumente el valor de ajuste en incrementos de 10 revoluciones por minuto hasta que el flujo se vuelva más recto.Si el chorro no se estabiliza, inserte un recogedor de muestras de poliestireno debajo del chorro de muestras para ayudar a guiar la muestra. Alternativamente, inserte un embudo de succión Venturi en el recogedor de muestras, que se puede conectar al tubo de salida de aire ubicado en la caseta del sincrotrón australiano. Para determinar el caudal de la corriente, utilice la calculadora de caudal del dispositivo Lipidico.Determinar la velocidad óptima de funcionamiento de la muestra para el inyector es crucial para la estabilidad del flujo. Un caudal lento da como resultado una expansión de la grasa de silicona que sale del inyector, mientras que un caudal más rápido produce un chorro más delgado. Regularmente se ha observado el enroscamiento de la corriente de medios viscosos.Para superar este problema en muestras altamente cargadas, se puede usar un colector de poliestireno para introducir una fuerza electrostática débil. En este análisis se utilizó una jeringa de vidrio que contenía 26 microlitros de cristales de lisozima suspendidos en grasa de silicona. Se recopiló una cantidad suficiente de datos en 38 minutos, lo que permitió la generación del mapa de densidad electrónica que rodea a los enlaces disulfuro en la estructura de lisozima.Recuerde usar un pequeño volumen de muestra en el portaobjetos de vidrio para evaluar la concentración de cristal de la muestra y determinar si es necesario corregir la viscosidad. La versatilidad del inyector permite la caracterización radiográfica de otros materiales altamente viscosos. Por ejemplo, estructuras líquidas iónicas que utilizan investigación con baterías o materiales coloidales que utilizan productos lácteos.

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Describimos procedimientos para la preparación y administración de microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía en serie en láseres de electrones libres de rayos X y fuentes de sincrotrón. Estos protocolos también se pueden aplicar para la incorporación y administración de microcristales de proteínas solubles, lo que reduce sustancialmente el consumo de muestras en comparación con la inyección líquida.

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

Aquí, se describe cómo utilizar la selección automática y opciones de recopilación de datos disponibles en algunos beamlines del sincrotrón. Los científicos enviaran muestras de cryocooled el sincrotrón, las propiedades de difracción son evaluadas, los conjuntos de datos son recogidos y procesados y, cuando sea posible, una solución de la estructura se lleva a cabo, todo ello sin intervención humana.

Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas

El éxito de un experimento de Cristalografía de femtosegundo serial tiempo resuelto es dependiente en la entrega de la muestra eficiente. Aquí, describimos protocolos para optimizar la extrusión de bacteriorhodopsin microcristales de un inyector micro-extrusión de alta viscosidad. La metodología se basa en la homogeneización de la muestra con un nuevo acoplador de tres vías y la visualización con una cámara de alta velocidad.

Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de muestras criogénicas y la transferencia de cristales a la estación final de vacío en la línea de haz I23 en Diamond Light Source, para experimentos de cristalografía de rayos X macromoleculares de longitud de onda larga.

Protocolo de preparación y transferencia de muestras para cristalografía de longitud de onda larga en vacío en Beamline I23 en Diamond Light Source

Aquí, describimos cómo utilizar las tuberías automatizadas de cristalografía macromolecular para el análisis rápido de complejos de ligando-proteína y proteína de proteína a proteína y el cribado de fragmentos a gran escala basado en la tecnología CrystalDirect en el Laboratorio HTX en EMBL Grenoble.

Las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de EMBL HTX en Grenoble

Esta contribución describe cómo configurar la cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal y cómo realizar la recopilación automatizada de datos en serie a temperatura ambiente utilizando la plataforma de cristalización en chip.

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Presentamos un protocolo para la cristalización de proteínas utilizando la instalación de cristalización en el Complejo de Investigación en Harwell y la posterior recopilación de datos cristalográficos de rayos X in situ de cristales dentro de las placas en la línea de luz de Cristalografía Macromolecular Versátil in situ (VMXi) de Diamond. Describimos los requisitos de la muestra, los protocolos de cristalización y las pautas de recopilación de datos.

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante

Aprende a preparar cristales proteicos en medios viscosos para cristalografía en serie usando el inyector Lipidico en el sincrotrón australiano. Este protocolo minimiza el desperdicio de muestra y facilita la caracterización de materiales blandos.

Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

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