Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

El protocolo que se muestra en este video combina por primera vez el uso del borrado epigenético químico con señales biomecánicas para inducir y mantener la pluripotencia en células adultas terminalmente diferenciadas. La principal fortaleza de este protocolo es que no requiere vectores transgénicos o virales. Además, es robusto, altamente reproducible y flexible.

Esta técnica no requiere el uso de transfección génica y, por lo tanto, representa un avance tecnológico notable para la medicina traslacional y la terapia celular, al tiempo que apoya el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad. Georgia Pennarossa, profesora asistente, y Teresina De Iorio, estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Comience preparando una solución madre fresca de 5-aza-CR de un milimolar.

Pesar 2,44 miligramos de 5-aza-CR y disolverlo en 10 mililitros de DMEM con alto contenido de glucosa. Vuelva a suspender el polvo mediante vórtice y esterilice la solución con un filtro de 0,22 micrómetros. Prepare la solución de trabajo de 5-aza-CR diluyendo un microlitro de la solución madre en un mililitro de medio de cultivo de fibroblastos.

Tripsinice las células como se describe en el manuscrito del texto y desaloje con un pipeteo suave. A continuación, recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo cónico. Cuente las células utilizando una cámara de recuento bajo un microscopio óptico.

Centrifugar la suspensión celular a 150 veces G durante cinco minutos. A continuación, se retira el sobrenadante y se vuelve a suspender el pellet para obtener 40.000 células en 30 microlitros de medio de cultivo de fibroblastos suplementado con 5-aza-CR de un micromolar. Llene una placa de Petri de 35 milímetros con polvo de PTFE para producir un lecho y dispense los 30 microlitros de células en el lecho de polvo.

Gire suavemente la placa de Petri con un movimiento circular para asegurarse de que el polvo de PTFE cubra completamente la superficie de la gota líquida para formar un microbiorreactor de mármol líquido. Recoja el microbiorreactor de mármol líquido utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros que se ha cortado para adaptarse al diámetro del mármol. Coloque el microbiorreactor en una placa de Petri bacteriología limpia para estabilizarlo.

A continuación, transfiera el microbiorreactor de la placa de Petri a una placa de 96 pocillos. Agregue lentamente 100 microlitros de medio desde el borde del pocillo. El microbiorreactor debe flotar sobre el medio.

Incubar el microbiorreactor de mármol líquido durante 18 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Después de la incubación, recoja el microbiorreactor de mármol líquido con una punta de pipeta de 1000 microlitros y colóquelo en una nueva placa de Petri bacteriológica de 35 milímetros. Usa una aguja para perforar el mármol líquido y romperlo.

Recupere los esferoides formados con una punta de pipeta de 200 microlitros que se ha cortado en el borde con un microscopio estereoscópico. Para lavar los residuos de 5-aza-CR, transfiera los organoides a una placa de Petri que contenga medio ESC. Prepare una nueva placa de Petri de 35 milímetros que contenga el lecho de polvo de PTFE y dispense un solo organoide en una gota de 30 microlitros de medio de cultivo ESC sobre el polvo con una punta de pipeta cortada de 200 microlitros.

Gire suavemente el plato con un movimiento circular para formar un nuevo microbiorreactor de mármol líquido y transfiéralo a un pocillo de una placa de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de medio desde el borde del pozo para bañar lentamente el mármol. Cultivo de los microbiorreactores de mármol líquido a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Los análisis morfológicos muestran que después de una incubación de 18 horas con el agente desmetilante 5-aza-CR, los fibroblastos de tres especies de mamíferos encapsulados en microbiorreactores de PTFE se agregaron y formaron estructuras esféricas 3D con una geometría de tamaño uniforme. En condiciones 3D, el 86,31% de las células encapsuladas modificaron notablemente su fenotipo. Por el contrario, las células post-5-aza-CR cultivadas en condiciones estándar 2D eran considerablemente más pequeñas en tamaño, con núcleos granulados y conservaban una distribución monocapa.

Los cambios morfológicos se acompañaron del inicio de la expresión génica relacionada con la pluripotencia, tanto en células 3D como 2D post-5-aza-CR. Se observó transcripción para POU clase cinco homeobox one, NANOG homeobox, proteína de dedo de zinc ZFP42 y región determinante del sexo Ybox2, que están ausentes en los fibroblastos no tratados. También se observó una regulación positiva significativa de la translocación 10-11, la molécula de adhesión de células epiteliales 2 y los genes de cadherina 1 en células 3D post-5-aza-CR en comparación con células cultivadas en placas de plástico estándar 2D.

Paralelamente, se detectó una regulación a la baja del antígeno de superficie celular marcador específico de fibroblastos Thy1 en células post-5-aza-CR 3D y 2D. Se confirmó una disminución significativa de los niveles de metilación en las células post-5-aza-CR 3D y 2D con ELISA. Los niveles de metilación del ADN fueron significativamente más bajos en las células 3D post-5-aza-CR en comparación con las células cultivadas en condiciones 2D.

Además, las células 3D post-5-aza-CR conservaron la estructura esférica 3D adquirida, los altos niveles de expresión de genes relacionados con la pluripotencia y los bajos niveles de metilación del ADN durante 28 días, momento en el que se detuvo el cultivo. Los microbiorreactores también se pueden utilizar para mantener las condiciones óptimas para los cultivos de células progenitoras, así como para aumentar la eficiencia de la diferenciación terminal.