Name: Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a generar células pluripotentes de mamíferos mediante una estrategia de dos pasos que combina modificación epigenética y señales biomecánicas sin vectores virales.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y MiND FoodS Hub ID: 1176436. Todos los autores son miembros de la Acción COST CA16119 Guía y aptitud celular total 3-D in vitro (CellFit).

Todos los estudios fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Milán. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH). El aislamiento de células humanas de individuos adultos sanos fue aprobado por el Comité de Ética del Ospedale Maggiore Policlinico, Milán. Todos los métodos de nuestro estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.
1. Aislamiento de fibroblastos en la piel
NOTA: Todos los procedimientos descritos a continuación se pueden aplicar a fibroblastos aislados de diferentes especies de mamíferos, incluidos ratones, porcinos y humanos. Se aislaron células murinas de ratones machos de 7 semanas de edad y se recolectó tejido de piel porcina en el matadero local. Las células humanas se aislaron de pacientes adultos, después de un consentimiento informado por escrito.
<ol><li>Preparar solución de gelatina porcina al 0,1%.<ol>
<li>Pesar 0,1 g de gelatina porcina y disolverla en 100 ml de agua. Esterilizar la solución de gelatina en autoclave antes de su uso.</li>
		<li>Cubra la placa de Petri de 35 mm con gelatina porcina al 0,1% añadiendo 1,5 ml de la solución preparada. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cortar biopsias de piel de mamíferos (ratón, porcino y humano) de aproximadamente 2-5 cm de longitud y colocarlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco que contiene una solución antimicótica antimicótica al 2%. Conservar a + 4 °C hasta su uso. NOTA: Las colecciones de biopsia deben realizarse de acuerdo y previa aprobación del Comité Ético, de acuerdo con las pautas establecidas.</li>
	<li>Lave extensamente las biopsias recolectadas tres veces en PBS estéril fresco que contenga una solución antimicótica antimicótica al 2%.</li>
	<li>Recoger biopsias del último lavado y colocarlas en una placa de Petri estéril de 100 mm. Utilice un bisturí estéril para cortarlos en trozos de aproximadamente 2 mm3 de tamaño.</li>
	<li>Al final de la incubación de 2 h, retire el exceso de solución de gelatina de la placa de Petri de 35 mm (descrita en el paso 1.1.2) y, utilizando una pinza quirúrgica estéril, coloque inmediatamente 5-6 fragmentos de piel en cada plato de cultivo precubierto.</li>
	<li>Humedezca los fragmentos añadiendo gotas de 100 μL de medio de aislamiento de fibroblastos (Tabla 1) sobre cada uno de ellos. Cultivo a 37 °C en incubadora de CO2 al 5%. NOTA: Para evitar que el medio se evapore, coloque la placa de Petri de 35 mm dentro de una placa de Petri de 100 mm o más grande que contenga agua estéril. Asegúrese de tapar ambas placas de Petri.</li>
	<li>Después de 24 h de cultivo, compruebe la cantidad del medio en la placa de Petri de cultivo de 35 mm. Si es necesario, agregue 500 μL de medio de aislamiento de fibroblastos para mantener húmedos los fragmentos.</li>
	<li>Retire con cuidado el medio y refresque al menos cada 2 días de cultivo con una pipeta.</li>
	<li>Cuando los fibroblastos comienzan a crecer fuera de la piel, los fragmentos colocados en la placa de Petri de 35 mm (descritos en el paso 1.5.) y comienzan a formar una monocapa celular (generalmente 6 días). Retire las piezas de piel con una pinza quirúrgica estéril y cultivo en 2 ml de medio de aislamiento de fibroblastos.</li>
	<li>Continúe cultivando la monocapa celular a 37 °C en incubadora de CO2 al 5% hasta una confluencia del 80% y refresque el medio cada dos días.</li>
</ol>2. Cultivo de línea celular primaria de fibroblastos
<ol><li>Cuando los fibroblastos alcancen el 80% de confluencia, retire cuidadosamente el medio de aislamiento de fibroblastos y lave las células tres veces con 3 ml de PBS que contengan una solución antimicótica al 1%.</li>
	<li>Para la separación celular, añadir 600 μL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% en la placa de cultivo e incubar a 37 °C durante 3-5 min.</li>
	<li>Añadir 5,4 ml de medio de cultivo de fibroblastos para neutralizar la tripsina cuando las células comiencen a desprenderse de la placa de cultivo (Tabla 1).</li>
	<li>Desalojar las células mediante pipeteos repetidos y suaves. Placa de células en nuevas placas de cultivo (sin gelatina), manteniendo la relación de paso entre 1:2 y 1:4 (dependiendo de la tasa de crecimiento). NOTA: La centrifugación no es necesaria.</li>
	<li>Mantener las células en cultivo y cambiar de medio cada 2 días, hasta que hayan alcanzado el 80% de confluencia y pasarlas. NOTA: Propague los fibroblastos dos veces por semana para mantener un crecimiento vigoroso.</li>
</ol>3. Exposición de fibroblastos a 5-aza-CR
<ol><li>Prepare una solución de stock fresca de 1 mM 5-aza-CR.<ol>
<li>Pesar 2,44 mg de 5-aza-CR y disolverlo en 10 ml de DMEM alto en glucosa. Resuspend el polvo por vórtice. Esterilizar la solución con un filtro de 0,22 μm. NOTA: La solución madre 5-aza-CR debe prepararse inmediatamente antes de su uso.</li>
		<li>Preparar la solución de trabajo 5-aza-CR diluyendo 1 μL de solución madre de 5-aza-CR (3.1.1.) en 1 ml de medio de cultivo de fibroblastos. NOTA: La concentración de solución de trabajo 5-aza-CR es de 1 μM 1,2,3,8,9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tripsinizar las células como se describió anteriormente (2.1.-2.3.) y desalojar las células mediante el pipeteo repetido y suave.</li>
	<li>Recoge la suspensión celular y transfiérela a un tubo cónico.</li>
	<li>Cuente las células utilizando una cámara de conteo bajo un microscopio óptico a temperatura ambiente. Calcular el volumen de medio necesario para volver a suspender células para obtener 4 x 104 células en 30 μL de medio de cultivo de fibroblastos suplementado con 1 μM 5-aza-CR (ver paso 3.1.2.). NOTA: La fórmula a utilizar depende del tipo específico de cámara. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 150 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y el pellet de resuspend con el medio de cultivo de fibroblastos suplementado con 1 μM 5-aza-CR (ver paso 3.1.2.). Para el volumen del medio de cultivo de fibroblastos que se va a utilizar, véase el paso 3.4. NOTA: Como control negativo, las células resuspendentes obtienen la misma concentración en medio de cultivo de fibroblastos sin 5-aza-CR y proceden con la encapsulación celular en polvo de PTFE (paso 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. Encapsulación de fibroblastos en microbiorreactores de PTFE
<ol><li>Llene una placa de Petri de 35 mm con polvo de politetrafluoroetileno (PTFE) para producir un lecho (Figura 1A). NOTA: Utilice placas de Petri de bacteriología de 35 mm para evitar la adhesión de mármol líquido. Para obtener una cáscara delgada hidrofóbica y porosa, use un polvo de PTFE con un tamaño de partícula promedio de 1 μm y producido con una molienda máxima de 2.0 NPIRI. Esto permite la creación de mármoles líquidos permeables al gas. Además, el recubrimiento translúcido facilita la observación de los procesos de agregación celular en tiempo real Un tamaño de partícula más grande conduce a una alta polidispersidad que puede causar una evaporación elevada, deformidad y pérdida de la forma esférica, y la disolución prematura de los microbiorreactores.</li>
	<li>Dispensar 30 μL de gota única que contenga 4 x 104 células (ver pasos 3.4.- 3.5.) sobre el lecho de polvo (Figura 1B).</li>
	<li>Gire suavemente la placa de Petri de 35 mm en un movimiento circular para asegurarse de que el polvo PFTE cubra completamente la superficie de la gota líquida para formar un microbiorreactor de mármol líquido (Figura 1C).</li>
	<li>Recoja el microbiorreactor de mármol líquido utilizando una punta de pipeta de 1.000 μL, cortada en el borde, para acomodar el diámetro del mármol (Figura 1D, E). Coloque el microbiorreactor de mármol líquido en una placa de Petri de bacteriología limpia para estabilizarlo (Figura 1F). NOTA: Para crear una fricción para agarrar la canica dentro de la punta, corte las puntas de la pipeta con un diámetro aproximadamente ligeramente menor que el diámetro de la canica líquida.</li>
	<li>Transfiera el microbiorreactor de mármol líquido de la placa de Petri a una placa de 96 pocillos (una canica/pozo) (Figura 1G).</li>
	<li>Agregue lentamente 100 μL de medios desde el margen del pozo. El microbiorreactor comienza a flotar sobre el medio (Figura 1H). NOTA: El microbiorreactor se rompe en contacto directo con líquido, debido a la interrupción de la hidrofobicidad del PTFE. Como enfoque alternativo, los microbiorreactores de mármol líquido se pueden colocar individualmente en un plato de cultivo de bacteriología de 35 mm. En este caso, para evitar la evaporación del mármol líquido, la placa de Petri de 35 mm que contiene el microbiorreactor debe insertarse en una placa de Petri de 100 mm, previamente alicitada con agua estéril.</li>
	<li>Incubar microbiorreactor de mármol líquido durante 18 h a 37 °C en incubadora 5% CO2 1,2,3,8,9. NOTA: El tamaño de partícula de PTFE de 1 μm puede garantizar un intercambio de gases óptimo entre el líquido interior y el entorno circundante.</li>
	<li>Después de la incubación de 5-aza-CR durante 18 h, recoja el microbiorreactor de mármol líquido utilizando una punta de pipeta de 1.000 μL cortada en el borde (ver paso 4.5).</li>
	<li>Coloque el microbiorreactor en una nueva placa de Petri bacteriológica de 35 mm (Figura 1D-F).</li>
	<li>Use una aguja para perforar el mármol líquido y romperlo.</li>
	<li>Recuperar esferoides formados con una punta de pipeta de 200 μL, cortada en el borde, bajo un estereomicroscopio (Figura 1I,J). NOTA: Las células borradas epigenéticamente encapsuladas en PTFE forman una estructura esférica 3D (un agregado en cada mármol líquido).</li>
	<li>Para evaluar la adquisición del estado pluripotente en respuesta a 5-aza-CR, comprobar el inicio de la expresión génica relacionada con la pluripotencia, OCT4, NANOG, REX1 y SOX2, mediante PCR cualitativa (Tabla 2).</li>
	<li>Continúe con el segundo paso del protocolo como se describe a continuación.</li>
</ol>5. Cultivo en microbiorreactores de PTFE de células borradas epigenéticamente
<ol><li>Preparar medio de cultivo ESC fresco (Tabla 1).</li>
	<li>Transferir organoides en una placa de Petri que contenga medio ESC para lavar los residuos de 5-aza-CR (ver pasos 5.1.-5.2.).</li>
	<li>Preparar una nueva placa de Petri bacteriológica de 35 mm que contenga lecho de polvo de PTFE (véase también el paso 4.1.).</li>
	<li>Dispensar un solo organoide en una gota de medio de cultivo ESC de 30 μL sobre el lecho de polvo utilizando una punta de pipeta de 200 μL, cortada en el borde (ver pasos 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Gire suavemente la placa de Petri de 35 mm en un movimiento circular para formar un nuevo microbiorreactor de mármol líquido, recójalo con una punta de pipeta de 1.000 μL, corte en el borde y coloque el microbiorreactor recién formado en un pozo de placa de 96 pocillos (una canica / pozo) (ver pasos 4.3.-4.6.).</li>
	<li>Para hacer flotar los microbiorreactores, añadir 100 μL de medios desde el margen del pozo para bañar lentamente el mármol (véase la nota 4.7.).</li>
	<li>Cultive microbiorreactores de mármol líquido a 37 °C en incubadora de CO2 al 5% durante el tiempo que sea necesario. Cambiar de medio cada dos días, siguiendo el procedimiento descrito en 5.3.-5.7. NOTA: En el presente manuscrito se proporcionan los resultados obtenidos con cultivo de organoides durante 28 días. Sin embargo, si es necesario, se puede realizar un período de cultivo más largo.</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
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<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
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<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
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<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
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<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
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<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Durante las últimas décadas, varios estudios se centraron en el desarrollo de estrategias para revertir una célula diferenciada terminalmente hacia un estado menos comprometido y más permisivo. El protocolo aquí descrito permite la generación y el mantenimiento a largo plazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras diferenciadas terminalmente. El método combina dos pasos independientes que implican la inducción de un alto estado permisivo que se logra a través del borrado epigenético químico y su post...

Durante las últimas décadas, se revisó por completo el concepto ampliamente aceptado de progresión unidireccional hacia el compromiso y la diferenciación celular. Se ha demostrado que la especificación celular puede ser revertida, y una célula diferenciada terminalmente puede ser empujada hacia un estado menos comprometido y más permisivo, utilizando diferentes métodos.
Entre los varios métodos propuestos, uno de los métodos más prometedores implica el uso de compuestos químicos para inducir a las células a una llamada pluripotencia inducida químicamente. Las pequeñas moléculas utilizadas en este abordaje son capaces de interactuar y modificar la firma epigenética de una célula adulta madura, evitando la necesidad de cualquier vector transgénico y/o viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosos estudios han demostrado recientemente que es posible cambiar las células de un fenotipo a otro proporcionando estímulos bioquímicos y biológicos específicos que inducen la reactivación de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Estos eventos desmetilantes permiten la conversión de células diferenciadas terminalmente en un progenitor primitivo, una célula multipotente o de alta plasticidad/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Paralelamente, muchos estudios se han centrado recientemente en la comprensión de las señales relacionadas con la mecanodetección y, más concretamente, en la posibilidad de utilizar fuerzas mecánicas para influir directamente en la plasticidad y/o diferenciación celular 16,17,18,19. De hecho, se ha demostrado claramente que la matriz extracelular (ECM) juega un papel clave en el control del destino celular. En particular, las señales biomecánicas y biofísicas producidas por la ECM regulan directamente los mecanismos moleculares y las vías de señalización, influyendo en el comportamiento y las funciones celulares20,21. Estos datos recientes han allanado el camino para el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo 3D que imitan más de cerca el microambiente celular in vivo, replicando estímulos mecánicos y físicos que impulsan el comportamiento celular.
Aquí describimos un protocolo de dos pasos que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. En el primer paso, las células se incuban con la molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente es capaz de inducir una significativa desmetilación global del ADN a través de un efecto combinado de la acción directa mediada por la translocación 2 (TET2) 8,10 y la inhibición indirecta de las ADN metiltransferasas (DNMT)22,23. Este paso induce la eliminación de los bloqueos epigenéticos con una posterior reactivación de la expresión génica relacionada con la pluripotencia y, por tanto, la generación de células de alta plasticidad 1,2,3,8,10, en adelante denominadas "células borradas epigenéticamente". En el segundo paso, las células se encapsulan en un sistema de cultivo 3D. Para ello, se utiliza como microbiorreactor el compuesto sintético hidrofóbico no reactivo politetrafluoroetileno (PTFE; con un tamaño de partícula de 1 μm), que permite la creación de un microambiente celular inalcanzable mediante el uso de sistemas tradicionales de cultivo 2D10. Las partículas de polvo de PTFE se adhieren a la superficie de la gota líquida en la que las células se vuelven a suspender y aíslan el núcleo líquido de la superficie de soporte, al tiempo que permiten el intercambio de gases entre el líquido interior y el entorno circundante24. El "microbiorreactor de PTFE" así obtenido, también conocido como "Mármol Líquido", anima a las células a interactuar libremente entre sí, promoviendo el reordenamiento celular 3D 25,26,27, y extiende y mantiene de forma estable el estado de alta plasticidad adquirido a través de señales relacionadas con la biomenosensibilidad 10.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Componente del medio ESC</td></tr><tr><td>5-Azacitidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, para el borrado epigenético de fibroblastos</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Componente de la mezcla de nucleósidos para medio ESC</td></tr><tr><td>Solución antibiótica antimicótica (100 veces)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Componente de fibroblastos y medios ESC</td></tr><tr><td>CFX96 PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>NA</td><td>Termociclador para PCR cuantitativa</td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>Componente de la mezcla de nucleósidos para medio ESC</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Para el aislamiento de fibroblastos y el medio</td></tr> <tr><td>de cultivoDMEM, glucosa baja, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31885023</td><td>para medio ESC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; para biopsia y lavado celular y para la preparación de soluciones</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>mRNA</td></tr><tr><td>estraction ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>componente del medio ESC</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Componente de fibroblastos y medios ESC</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) Proteína humana recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PHG0024 Componente del medio ESC</td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Para recubrimiento de placas</td></tr><tr><td>Sistema de PCR GeneAmp 2700</td> Termociclador de <td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>para PCR cualitativa</td></tr><tr><td>ELISA de metilación global del ADN Kit</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>Estudio de metilación</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi ADN polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>PCR cualitativa</td></tr><tr><td>Guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>Componente de la mezcla de nucleósidos para el medio ESC Mezcla de</td></tr><tr><td>nutrientes F-10 de jamón</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td>para medio ESC</td></tr><tr><td>KnockOut Serum de repuesto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Componente del medio ESC</td></tr><tr><td>KOVA portaobjetos vítreo 10 con rejillas</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Para el recuento de células</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Leica MZ APO</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Para la observación de organoides</td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Componente de fibroblastos y medios ESC</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>11140035 Componente del medio ESC</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 y micro; Filtros de poros m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Para esterilización en solución</td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa M-MLV, RNasa H Minus, mutante puntual</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>Transcripción inversa de ARNm</td></tr><tr><td>Fotómetro de microplaca Multiskan FC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td><td>para lectura de placas ELISA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Microscopio de contraste de fase invertida</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Para célula observación</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Termociclador 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Termociclador para transcripción inversa</td></tr><tr><td>Poli(tetrafluoroetileno) 1 &mu; m tamaño de partícula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>Para la generación de microbiorreactores</td></tr>: <tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>K182001 Extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>TaqMan Expresión génica Cells-to-CT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>PCR cuantitativa</td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Componente de la mezcla de nucleósidos para medio ESC</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 100X20 mm, estándar</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td>Para el aislamiento de fibroblastos</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 35X10 mm, estándar</td><td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>Para el aislamiento de fibroblastos</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 35X10 mm, Suspensión</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Bacteriología Placa de Petri para el cultivo de mármol líquido</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos 96 Pozo,Estándar,F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>Para el cultivo</td></tr><tr><td>líquido de mármol Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Para la disociación de fibroblastos</td></tr><tr><td>Tubo 15ml, 120x17mm, PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>Para centrifugación en suspensión celular</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>Componente de la mezcla de nucleósidos para medio ESC</td></tr></tbody></table>

una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

El fenotipo celular puede ser revertido o modificado con diferentes métodos, con ventajas y limitaciones que son específicas para cada técnica. Aquí describimos una nueva estrategia que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. Se requieren dos pasos principales. En el primer paso, las células adultas maduras (diferenciadas terminalmente) se exponen al borrador epigenético 5-aza-citidina para llevarlas a un estado pluripotente. Esta parte del protocolo se desarrolló, basada en la creciente comprensión de los mecanismos epigenéticos que controlan el destino y la diferenciación celular, e implica el uso del modificador epigenético para borrar el estado diferenciado celular y luego conducir a una ventana transitoria de alta plasticidad.
En el segundo paso, las células borradas se encapsulan en microbiorreactores de politetrafluoroetileno (PTFE), también conocidos como mármoles líquidos, para promover el reordenamiento celular 3D para extender y mantener de manera estable la alta plasticidad adquirida. El PTFE es un compuesto sintético hidrófobo no reactivo y su uso permite la creación de un microambiente celular, lo que no se puede lograr en los sistemas tradicionales de cultivo 2D. Este sistema fomenta e impulsa el mantenimiento de la pluripotencia a través de señales relacionadas con la biomenosensing.
Los procedimientos técnicos descritos aquí son estrategias simples para permitir la inducción y el mantenimiento de un estado de alta plasticidad en células somáticas adultas. El protocolo permitió la derivación de células de alta plasticidad en todas las especies de mamíferos probadas. Dado que no implica el uso de la transfección génica y está libre de vectores virales, puede representar un avance tecnológico notable para las aplicaciones de la medicina traslacional. Además, el sistema de microbiorreactor proporciona un avance notable en la tecnología de organoides de células madre mediante la recreación in vitro de un microambiente específico que permite el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad, es decir, como ESC, iPSC, células borradas epigenéticamente y MSC.

El presente protocolo describe todos los pasos a realizar para generar y mantener de forma estable las células pluripotentes de mamíferos a partir de células somáticas adultas. Este método ha tenido éxito con fibroblastos aislados de diferentes especies de mamíferos, a saber, ratones, cerdos y humanos. Los resultados representativos aquí reportados se obtienen de todas las líneas celulares, independientemente de la especie de origen.
Los análisis morfológicos muestran que, tras 18 h de incubac...

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

El protocolo que se muestra en este video combina por primera vez el uso del borrado epigenético químico con señales biomecánicas para inducir y mantener la pluripotencia en células adultas terminalmente diferenciadas. La principal fortaleza de este protocolo es que no requiere vectores transgénicos o virales. Además, es robusto, altamente reproducible y flexible.Esta técnica no requiere el uso de transfección génica y, por lo tanto, representa un avance tecnológico notable para la medicina traslacional y la terapia celular, al tiempo que apoya el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad. Georgia Pennarossa, profesora asistente, y Teresina De Iorio, estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Comience preparando una solución madre fresca de 5-aza-CR de un milimolar.Pesar 2,44 miligramos de 5-aza-CR y disolverlo en 10 mililitros de DMEM con alto contenido de glucosa. Vuelva a suspender el polvo mediante vórtice y esterilice la solución con un filtro de 0,22 micrómetros. Prepare la solución de trabajo de 5-aza-CR diluyendo un microlitro de la solución madre en un mililitro de medio de cultivo de fibroblastos.Tripsinice las células como se desc

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Protocolos detallados para la introducción de una enzima de la división ingeniería-TET2 (sidra) en células de mamífero para químicas inducible hydroxymethylation de ADN y remodelación epigenéticos se presentan.

División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Como las células confluyan, deben ser subcultivaron o pasajes. Este vídeo demuestra un procedimiento de subcultivo tanto adherente y células en suspensión.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

Aprende a generar células pluripotentes de mamíferos mediante una estrategia de dos pasos que combina modificación epigenética y señales biomecánicas sin vectores virales.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos (Video) | JoVE Journal

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

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