Name: Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprende blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología CDR y agentes inmuno-potenciadores para detectar antígenos en solo 20 minutos sin perder sensibilidad. Este método optimiza la dilución de anticuerpos y acelera la investigación biomédica.

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Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramuros, Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre, Institutos Nacionales de Salud. S.H. fue apoyado por el Programa de Estudio estudiantil de asociación público-privada de Japón en el extranjero, y H.N. y K.Y. fueron por Valor y V Beca de Capacitación en El Extranjero de Drogas.

1. SDS-PAGE y transferir a una membrana PVDF
<ol><li>Realice SDS-PAGE para separar las proteínas en función del tamaño relativo. NOTA: Cualquier sistema de gel comercial o casero está bien. Por favor, siga el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Transfiera proteínas separadas de un gel a una membrana PVDF. NOTA: Los métodos de transferencia comunes (transferencia semi-seca o húmeda) son adecuados. Por favor, siga el protocolo del fabricante.</li>
</ol>2. Bloqueo de membranas PVDF
<ol><li>Incubar las membranas en amortiguadores de bloqueo adecuados durante 1 h con agitación a temperatura ambiente. NOTA: Dependiendo del anticuerpo principal y del sistema de detección, se debe seleccionar un búfer de bloqueo adecuado. Por ejemplo, los bloqueadores más típicos son BSA, leche seca sin grasa, caseína y polímeros sintéticos comerciales. PBS y/o TBS con 0,1% Tween20 son los búferes más utilizados. Este paso de bloqueo se puede realizar durante la noche a 4 °C.</li>
</ol>3. Incubación con anticuerpo primario
<ol><li>Prepare una solución agente-1 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-1) con agua destilada. Vórtice bien.</li>
	<li>Prepare el anticuerpo primario diluido con un 10% IRE-1. Mézclalo suave y a fondo.</li>
	<li>Si utiliza una membrana más grande (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), agregue 8 ml de la solución de anticuerpos en tubos centrífugas cónicos de 50 ml. Si utiliza una membrana más pequeña (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), agregue 3 ml de la solución de anticuerpos en tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml (Tabla de materiales).</li>
	<li>Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de bloqueo. Inserte la membrana PVDF en este tubo con los dedos enguantados y asegúrese de que toda la membrana se adhiere a la pared del tubo. Cuando la membrana PVDF se inserta en un tubo, se enfrenta al "lado proteico" de la membrana que originalmente estaba en contacto con el gel hacia adentro. Cierre bien la tapa.</li>
	<li>Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación. NOTA: Cuando se utilicen tubos de 14 ml para esta incubación, inserte un tubo de 14 ml en el tubo de 50 ml, utilizando un par de soportes de anillo de plástico para mantener el tubo interno en el centro del tubo de 50 ml.</li>
	<li>Encienda el horno de hibridación.</li>
	<li>Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos. NOTA: Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir la membrana con la solución de anticuerpos uniformemente. Calibrar la dilución del anticuerpo y el tiempo de incubación antes del experimento real.</li>
</ol>4. Lavado de membrana
<ol><li>Detenga la rotación.</li>
	<li>Retire cuidadosamente la membrana PVDF del tubo con pinzas y coloque la membrana en un recipiente con 50 ml de PBS-T.</li>
	<li>Enjuague brevemente la membrana con PBS-T.</li>
	<li>Enjuague la membrana del recipiente con agua destilada hasta que no aparezcan burbujas. Esto es para eliminar la mayoría del anticuerpo.</li>
	<li>Transfiera la membrana PVDF del recipiente al hilandero de ensalada que contiene 250 ml de PBS-T.</li>
	<li>Coloque la cesta del colador en el spinner. Asegúrese de que la tapa se haya puesto de forma segura.</li>
	<li>Activa el spinner y corre durante unos 20-30 s.</li>
	<li>Deseche la solución y enjuague brevemente el interior del hilandero con agua destilada.</li>
	<li>Agregue 250 mL de PBS-T en el spinner otra vez.</li>
	<li>Repita los pasos 4.6 y 4.7.</li>
</ol>5. Incubación con el anticuerpo secundario
<ol><li>Prepare una solución agente-2 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-2) con agua destilada. Vórtice bien.</li>
	<li>Prepare el anticuerpo secundario diluido con un 10% IRE-2. Mézclalo suave y a fondo.</li>
	<li>Seleccione el volumen de la solución de anticuerpos y el tubo como se indica en el paso 3.3.</li>
	<li>Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente. Inserte la membrana PVDF en el tubo como se indica en el paso 3.4.</li>
	<li>Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación.</li>
	<li>Encienda el horno de hibridación.</li>
	<li>Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos. Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir uniformemente la membrana con la solución de anticuerpos. NOTA: Calibrar el tiempo de incubación antes del experimento real. Cuando el anticuerpo secundario esté conjugado fluorescentemente, realice la incubación en la oscuridad.</li>
</ol>6. Lavado de membrana
<ol><li>Siga los pasos 4.1 a 4.10.</li>
</ol>7. Adquisición de imágenes
<ol><li>Detección de quimioluminiscentes<ol>
<li>Coloque una pieza de película flexible semi-trasplantada (10 cm x 15 cm) sobre una superficie plana.</li>
		<li>Mezcle 2 componentes del sustrato quimioluminiscente en un tubo de 5 ml.</li>
		<li>Transfiera inmediatamente 1,5 ml del sustrato mixto a la película flexible semi-trasplante y coloque la membrana PVDF sobre ella. A continuación, transfiera el resto de la solución de sustrato a la membrana.</li>
		<li>Incubar la membrana PVDF con el sustrato mixto en una película flexible semitransparente durante 1 min.</li>
		<li>Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de sustrato.</li>
		<li>Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.</li>
		<li>Adquiera la imagen bajo modo quimioluminiscente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detección fluorescente<ol>
<li>Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente.</li>
		<li>Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.</li>
		<li>Adquiera la imagen en modo fluorescente. NOTA: Los pasos 7.1 y 7.2 deben realizarse cerca de la máquina de imágenes para garantizar la máxima sensibilidad.</li>
		<li>Cuando la señal de fondo es alta, realice un paso de lavado en un recipiente con 80-100 ml de PBS-T: 10 minutos de enjuague 3 veces para el anticuerpo primario y 5 minutos de enjuague 6 veces para el anticuerpo secundario. NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios diluidos con soluciones IRE del 10% se pueden utilizar hasta 8-10 veces sin pérdida de sensibilidad6. La solución debe mantenerse a 4 °C durante un mes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacol+Toxicology+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li>
<li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li>
<li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li>
<li>Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: 
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<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+but+not+Obsolete%3A+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li>
<li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852(2016).</li>
<li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li>
<li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li>
</ol>

Los autores no han declarado intereses competidores directamente relevantes para el contenido de este artículo.

Western blot es una técnica analítica ampliamente utilizada para detectar proteínas específicas que se desarrolló ~Hace 40 años7,8. Desde entonces, la técnica ha seguido evolucionando, con innovaciones posteriores mejorando la sensibilidad, velocidad y cuantificación de la técnica2,9,10,11,12,</su...

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es una técnica poderosa y fundamental en una amplia gama de disciplinas científicas y clínicas. Esta técnica se utiliza para examinar la presencia, la abundancia relativa, la masa molecular relativa y las modificaciones post-traslacionales de las proteínas1. Combinado con el análisis de imágenes digitales, este método puede analizar de forma fiable la abundancia de proteínas y modificaciones de proteínas2. Aunque la mancha occidental se realiza de forma rutinaria, es un método que consume mucho tiempo y requiere mucho trabajo. Se requieren largas incubaciones del anticuerpo con membranas. Aquí, describimos una modificación del método de incubación que supera esta limitación sin sacrificar la sensibilidad.
Durante la incubación de la membrana, los anticuerpos flotan en solución mientras que los antígenos se inmovilizan en la membrana. Debido a su alta afinidad, la tasa de unión de anticuerpos al antígeno es más rápida que la difusión de anticuerpos de la solución a granel a la membrana. Esto crea una "capa de agotamiento" de baja concentración (Figura 1). Los anticuerpos más distantes pueden tardar horas en llegar a la membrana a través de la difusión pasiva, que es el principal factor responsable de los largos tiempos de incubación en esta técnica. Este efecto se denomina limitación de transporte masivo (MTL)3. Se ha propuesto que el drenaje repetitivo y la reposición de la solución que contiene anticuerpos puedan interrumpir la capa de agotamiento y superar el MTL4. Aquí, hemos ideado una técnica única que implementa este concepto cíclico de drenaje y reposición (CDR) para disminuir el efecto de MTL en un protocolo tradicional de hinchazón occidental y acortar notablemente el período de incubación requerido.
Con el fin de mantener la sensibilidad de detección con un corto tiempo de incubación, hicimos uso de una tecnología de mejora de la inmunorreacción que acelera la reacción antígeno-anticuerpo, mejorando así la relación señal-ruido5. Muchos agentes de mejora de inmunorreacción disponibles comercialmente (IRE) constan de 2 componentes (Solución 1 y 2, véase Tabla de Materiales). La composición o mecanismo de acción patentado de la IRE no se ha divulgado, pero hemos encontrado previamente que la IRE disminuyó la constante de disociación entre el antígeno y el anticuerpo en ensayos de unión de fase sólida, lo que indica que el aumento de la afinidad es, al menos en parte, responsable del efecto de mejora del IRE6. La combinación de CDR con IRE produce un protocolo de distensión occidental de ultra alta velocidad que reduce todo el tiempo de procedimiento sin sacrificar la sensibilidad.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ensayo de PP de alta claridad con fondo redondo de 14 ml, graduado, con tapa a presión</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Apollo Película de transparencia para impresoras láser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cualquier tipo de película de transparencia para impresoras láser está bien.</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>Cualquier tipo de sistema de adquisición de imágenes está bien para la detección quimioluminiscente y/o fluorescente.</td></tr><tr><td>Puede obtener la solución potenciadora de la inmunorreacción de señal</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>CARNATION Clavel instantáneo de leche en polvo descremada</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-ratón IgG, Rábano picante peroxidasa unido F (ab')2 fragmentos de ovejas</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-conejo IgG, Rábano picante peroxidasa ligado a F(ab')2 fragmentos de burro</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4 N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>Cualquier horno de hibridación está bien siempre que los tubos se giren uniformemente en posición horizontal.</td></tr><tr><td>Membrana de PVDF Immobilon-P, 0,45 y micro; m tamaño de poro</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Anticuerpo secundario anti-IgG de cabra anti-conejo</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Sustrato quimioluminiscente</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&szlig; actina de ratón</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo Odyssey (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>Tampón de bloqueo para detección fluorescente</td></tr><tr><td>OXO Centrifugadora de ensaladas OXO</td><td></td><td>32480V2B</td><td>Cualquier centrifugadora de ensaladas está bien siempre que las membranas de PVDF se enjuaguen vigorosamente sin rasgarse.</td></tr><tr><td>Película de sellado</td><td>Parafilm Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>película flexible semitransparente</td></tr><tr><td>Tapones de rosca de polietileno de punta plana para tubos de centrífuga de fondo cónico de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Anillos para sujetar un tubo de 14 ml en el centro de un tubo de 50 ml</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado en un taller mecánico</td></tr><tr><td>Conejo anti-6X Su etiqueta</td><td>anticuerpo Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es un método canónico para la investigación biomédica. Se utiliza comúnmente para determinar el tamaño relativo y la abundancia de proteínas específicas, así como modificaciones de proteínas post-traslacionales. Esta técnica tiene una rica historia y permanece en uso generalizado debido a su simplicidad. Sin embargo, el procedimiento de hinchazón occidental famosamente toma horas, incluso días, para completar, con un cuello de botella crítico siendo los largos tiempos de incubación que limitan su rendimiento. Estos pasos de incubación son necesarios debido a la lenta difusión de anticuerpos de la solución a granel a los antígenos inmovilizados en la membrana: la concentración de anticuerpos cerca de la membrana es mucho menor que la concentración a granel. Aquí, presentamos una innovación que reduce drásticamente estos intervalos de incubación mediante la mejora de la unión de antígenos a través del drenaje cíclico y la reposición (CDR) de la solución de anticuerpos. También utilizamos una tecnología de mejora de la inmunorreacción para preservar la sensibilidad del ensayo. Una combinación del método CDR con un agente comercial de mejora de la inmunorreacción aumentó la señal de salida y redujo sustancialmente el tiempo de incubación de anticuerpos. La mancha occidental de ultra alta velocidad resultante se puede lograr en 20 minutos sin ninguna pérdida de sensibilidad. Este método se puede aplicar a las manchas occidentales utilizando detección quimioluminiscente y fluorescente. Este sencillo protocolo permite a los investigadores explorar mejor el análisis de la expresión proteica en muchas muestras.

Este ejemplo ilustra la eficacia del método CDR junto con la tecnología de inmunoenhancing en western blot. La incubación estática se realizó en una película flexible semitransparente donde las membranas PVDF fueron incubadas con la solución de anticuerpos, mientras que la incubación de CDR fue en un horno de hibridación mediante tubos giratorios que contenían las membranas y la solución de anticuerpos (Movie). La Figura 2 mostró cantidades de antígeno y anticuerpos, respectivamente, necesar...

Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.

Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

La Western blot es un método establecido que detecta antígenos en una membrana transferida y se usa comúnmente en la investigación biomédica, pero se necesitan horas o días para completar todo el procedimiento. Usando la combinación de la tecnología de mejora inmunológica con drenaje y reposición cíclicos, una vez que tenga una membrana de bloqueo, todo el procedimiento se puede realizar en tan solo 20 minutos sin sacrificar la sensibilidad. Debido a que la transferencia de Western es común a muchas áreas de investigación diferentes, tiene una amplia aplicabilidad para acelerar la investigación.El uso exitoso de este protocolo se basa en la optimización de la dilución de anticuerpos con reactivos que mejoran la inmunorreacción y el tiempo de incubación. Comience incubando las membranas de PVDF en tampones de bloqueo apropiados durante una hora con agitación a temperatura ambiente. Mientras se incuban las membranas, prepare el agente potenciador de inmunorreacción al 10% en una solución o IRE1 con agua destilada y vértice bien, luego diluya el anticuerpo primario con IRE1 al 10%, mezclándolo suave y completamente.Recoja la membrana de PVDF con pinzas y drene brevemente la solución de bloqueo. Inserte la membrana en un tubo cónico con anticuerpo primario, asegurándose de que toda la membrana se adhiera a la pared del tubo y que el lado de la membrana que originalmente estuvo en contacto con el gel esté hacia adentro. Tapa bien el tubo.Inserte el tubo en una botella de vidrio para el horno de hibridación y encienda el horno. Incube la membrana con una rotación de seis RPM durante al menos cinco minutos. Detenga la rotación y retire con cuidado la membrana de PVDF del tubo con pinzas.Coloque la membrana en un recipiente con 50 mililitros de PBST y enjuáguela, luego enjuáguela en un recipiente con agua destilada hasta que no aparezcan burbujas, lo que eliminará la mayor parte del anticuerpo. Transfiera la membrana a una centrifugadora de ensaladas que contenga 250 mililitros de PBST. Coloque la canasta del colador en la ruleta y asegúrese de que la tapa se haya colocado de manera segura, luego active la ruleta y hágala funcionar durante 20 a 30 segundos.Deseche la solución y enjuague brevemente el interior de la centrifugadora con agua destilada. Agregue 250 mililitros de PBST en el spinner y repita el centrifugado, luego incube la membrana con los anticuerpos secundarios y lávela nuevamente como se describe en el manuscrito del texto. Coloque un trozo de película flexible semitransparente sobre una superficie plana.Mezcle dos componentes del sustrato quimioluminiscente en un tubo de cinco mililitros e inmediatamente transfiera 1,5 mililitros del sustrato mezclado a la película semitransparente. Coloque la membrana de PVDF sobre la solución y transfiera el resto de la solución de sustrato a la membrana. Incubar la membrana de PVDF con el sustrato mezclado durante un minuto.Recoja la membrana de PVDF con unas pinzas y drene brevemente la solución de sustrato. Coloque la membrana entre un par de películas transparentes y visualícela en modo quimioluminiscente. Aquí se muestran las cantidades de antígeno y anticuerpo necesarias respectivamente para la detección quimioluminiscente de Western blot.Tanto en incubaciones estáticas como en CDR, el uso de soluciones IRE aumentó la sensibilidad. Del mismo modo, la concentración mínima de anticuerpos anti-6s His tag se redujo de 100 a 50 nanogramos por mililitro en condiciones estáticas y de 100 a 12,5 nanogramos por mililitro en condiciones CDR. La incubación CDR durante 5 o 10 minutos redujo drásticamente el límite de detección en comparación con la incubación estática.Además, la combinación de CDR con IRE reveló una sensibilidad superior en el Western blot, incluso dentro del período de incubación extremadamente corto. Aquí se demuestra la aplicación exitosa de este método a una Western blot con detección fluorescente. La detección fluorescente, a diferencia de la detección quimioluminiscente, tiene la capacidad única de detectar múltiples objetivos en la misma mancha al mismo tiempo sin eliminar y volver a probar los anticuerpos.La fosfatasa alcalina marcada con His y la beta-actina en los lisados celulares se detectaron simultáneamente utilizando un fluoróforo de dos colores. La incubación de CDR con IRE no solo aceleró la detección, sino que también aumentó la sensibilidad. Durante la incubación, la membrana debe permanecer unida a la pared del tubo.El tubo debe girarse horizontalmente para que la solución se lave continuamente sobre la superficie de la membrana. Este protocolo aceleró significativamente nuestra productividad en la investigación, que depende en gran medida de los procedimientos de transferencia occidentales.

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

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El análisis por inmunotransferencia

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Western Blot: Preparación de muestras para la detección

Este video describe la transferencia occidental basada en quimioluminiscencia de lisados inmunoprecipitados. La técnica ayuda a determinar el procesamiento y la activación de proteínas. La señal quimioluminiscente detectada es proporcional al nivel de procesamiento de proteínas durante su activación.

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