Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción
26 de septiembre de 2020
Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.
La Western blot es un método establecido que detecta antígenos en una membrana transferida y se usa comúnmente en la investigación biomédica, pero se necesitan horas o días para completar todo el procedimiento. Usando la combinación de la tecnología de mejora inmunológica con drenaje y reposición cíclicos, una vez que tenga una membrana de bloqueo, todo el procedimiento se puede realizar en tan solo 20 minutos sin sacrificar la sensibilidad. Debido a que la transferencia de Western es común a muchas áreas de investigación diferentes, tiene una amplia aplicabilidad para acelerar la investigación.
El uso exitoso de este protocolo se basa en la optimización de la dilución de anticuerpos con reactivos que mejoran la inmunorreacción y el tiempo de incubación. Comience incubando las membranas de PVDF en tampones de bloqueo apropiados durante una hora con agitación a temperatura ambiente. Mientras se incuban las membranas, prepare el agente potenciador de inmunorreacción al 10% en una solución o IRE1 con agua destilada y vértice bien, luego diluya el anticuerpo primario con IRE1 al 10%, mezclándolo suave y completamente.
Recoja la membrana de PVDF con pinzas y drene brevemente la solución de bloqueo. Inserte la membrana en un tubo cónico con anticuerpo primario, asegurándose de que toda la membrana se adhiera a la pared del tubo y que el lado de la membrana que originalmente estuvo en contacto con el gel esté hacia adentro. Tapa bien el tubo.
Inserte el tubo en una botella de vidrio para el horno de hibridación y encienda el horno. Incube la membrana con una rotación de seis RPM durante al menos cinco minutos. Detenga la rotación y retire con cuidado la membrana de PVDF del tubo con pinzas.
Coloque la membrana en un recipiente con 50 mililitros de PBST y enjuáguela, luego enjuáguela en un recipiente con agua destilada hasta que no aparezcan burbujas, lo que eliminará la mayor parte del anticuerpo. Transfiera la membrana a una centrifugadora de ensaladas que contenga 250 mililitros de PBST. Coloque la canasta del colador en la ruleta y asegúrese de que la tapa se haya colocado de manera segura, luego active la ruleta y hágala funcionar durante 20 a 30 segundos.
Deseche la solución y enjuague brevemente el interior de la centrifugadora con agua destilada. Agregue 250 mililitros de PBST en el spinner y repita el centrifugado, luego incube la membrana con los anticuerpos secundarios y lávela nuevamente como se describe en el manuscrito del texto. Coloque un trozo de película flexible semitransparente sobre una superficie plana.
Mezcle dos componentes del sustrato quimioluminiscente en un tubo de cinco mililitros e inmediatamente transfiera 1,5 mililitros del sustrato mezclado a la película semitransparente. Coloque la membrana de PVDF sobre la solución y transfiera el resto de la solución de sustrato a la membrana. Incubar la membrana de PVDF con el sustrato mezclado durante un minuto.
Recoja la membrana de PVDF con unas pinzas y drene brevemente la solución de sustrato. Coloque la membrana entre un par de películas transparentes y visualícela en modo quimioluminiscente. Aquí se muestran las cantidades de antígeno y anticuerpo necesarias respectivamente para la detección quimioluminiscente de Western blot.
Tanto en incubaciones estáticas como en CDR, el uso de soluciones IRE aumentó la sensibilidad. Del mismo modo, la concentración mínima de anticuerpos anti-6s His tag se redujo de 100 a 50 nanogramos por mililitro en condiciones estáticas y de 100 a 12,5 nanogramos por mililitro en condiciones CDR. La incubación CDR durante 5 o 10 minutos redujo drásticamente el límite de detección en comparación con la incubación estática.
Además, la combinación de CDR con IRE reveló una sensibilidad superior en el Western blot, incluso dentro del período de incubación extremadamente corto. Aquí se demuestra la aplicación exitosa de este método a una Western blot con detección fluorescente. La detección fluorescente, a diferencia de la detección quimioluminiscente, tiene la capacidad única de detectar múltiples objetivos en la misma mancha al mismo tiempo sin eliminar y volver a probar los anticuerpos.
La fosfatasa alcalina marcada con His y la beta-actina en los lisados celulares se detectaron simultáneamente utilizando un fluoróforo de dos colores. La incubación de CDR con IRE no solo aceleró la detección, sino que también aumentó la sensibilidad. Durante la incubación, la membrana debe permanecer unida a la pared del tubo.
El tubo debe girarse horizontalmente para que la solución se lave continuamente sobre la superficie de la membrana. Este protocolo aceleró significativamente nuestra productividad en la investigación, que depende en gran medida de los procedimientos de transferencia occidentales.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica de inmunotransferencia ultrarrápida que reduce significativamente el tiempo necesario para el procedimiento. Al utilizar la tecnología de drenaje y reposición cíclicos (CDR) junto con un agente potenciador de la inmunoreacción, todo el proceso puede completarse en tan solo 20 minutos sin comprometer la sensibilidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación biomédica
- Técnicas de inmunotransferencia
- Tecnología inmunoestimulante
Antecedentes
- La transferencia Western es un método ampliamente utilizado para detectar antígenos.
- Los procedimientos tradicionales de transferencia Western pueden llevar horas o incluso días.
- Mejorar la velocidad de esta técnica puede aumentar la eficiencia de la investigación.
- El estudio se centra en optimizar la dilución de anticuerpos y los tiempos de incubación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo de inmunotransferencia más rápido.
- Mantener la sensibilidad mientras se reduce el tiempo del procedimiento.
- Mostrar la amplia aplicabilidad de la técnica en diversas áreas de investigación.
Métodos Utilizados
- Uso de la tecnología de drenaje y recarga cíclicos (CDR).
- Incorporación de un agente potenciador de la inmunoreacción (IRE1).
- Bloqueo de membranas de PVDF en tampones adecuados.
- Optimización de la dilución de anticuerpos y los tiempos de incubación.
Resultados principales
- Todo el procedimiento de inmunotransferencia puede completarse en 20 minutos.
- Se mantiene una alta sensibilidad durante todo el proceso.
- Una optimización exitosa conduce a una detección efectiva del antígeno.
- El método muestra potencial para un uso amplio en diversos campos de investigación.
Conclusiones
- La técnica desarrollada acelera significativamente el inmunotransferencia.
- Combinar la tecnología CDR con agentes inmunoestimulantes es efectivo.
- Este avance puede facilitar resultados de investigación más rápidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El inmunotransferencia sigue siendo una técnica fundamental en la validación de objetivos y el análisis de biomarcadores, aunque sus largos periodos de incubación generan cuellos de botella en los flujos de trabajo de descubrimiento de alto rendimiento. Este método de ultraalta velocidad reduce el tiempo del ensayo de horas a 20 minutos, manteniendo la sensibilidad e permitiendo un análisis rápido de la expresión proteica en múltiples muestras. El enfoque facilita pruebas de hipótesis más rápidas y la identificación de candidatos principales al mejorar el rendimiento del ensayo sin comprometer la calidad de los datos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación rápida de hipótesis terapéuticas mediante la detección acelerada de proteínas.
- Valor operativo: Reduce el tiempo por blot, lo que permite analizar más objetivos en paralelo durante la validación temprana de dianas.
- Valor predictivo: Mantiene la sensibilidad del ensayo, facilitando evaluaciones confiables del acoplamiento a la diana y la modulación de la vía.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce lecturas cuantitativas y reproducibles de expresión proteica adecuadas para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Compatible con detección quimioluminiscente y fluorescente, lo que permite la multiplexación y una selección flexible de lecturas.
- Escalabilidad: El formato cíclico de drenaje y reposición favorece la adaptación a flujos de trabajo automatizados o semiautomatizados.
Investigación Traduccional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita el análisis consistente de proteínas desde el descubrimiento hasta los modelos preclínicos utilizando el mismo método de detección rápida.
- Alineación de Biomarcadores: Permite la evaluación de modificaciones postraduccionales e isoformas de proteínas relevantes para los mecanismos de enfermedad.
- Reducción de Riesgos: Acelera la validación de biomarcadores diana, reduciendo la incertidumbre en las decisiones de avance preclínico.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la selección de interacción con el blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde la cuantificación rápida de proteínas orienta ciclos iterativos de diseño.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir mediciones rápidas y repetidas de niveles de proteínas bajo distintas condiciones experimentales.
- Selección: Genera resultados cuantitativos estandarizados que permiten comparar la unión de anticuerpos entre condiciones y muestras.
- Análisis: Ofrece límites de detección sensibles (por ejemplo, menores requerimientos de concentración de anticuerpos) que mejoran la relación señal-ruido en el análisis de dianas de baja abundancia.
- Investigación Traducional: Permite un monitoreo consistente de proteínas en diferentes tipos de muestras, apoyando la validación de biomarcadores en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Representa una técnica compatible con plataformas, aplicable en múltiples proyectos y áreas terapéuticas debido a su amplia compatibilidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la detección rápida y reproducible de proteínas.
- Valor operativo: Mejora el rendimiento del laboratorio y la eficiencia de los reactivos al reducir los tiempos de incubación y el consumo de anticuerpos.
- Valor estratégico: Permite decisiones más rápidas de avance/no avance en la selección de objetivos al acelerar los ciclos de generación de datos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos oportunos de validación de objetivos para decisiones de inversión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere familiaridad con las técnicas de drenado y reposición cíclicos y el manejo de agentes potenciadores de inmunoensayos.
- Necesita equipos estándar para inmunotransferencia, incluyendo horno de hibridación, centrífuga para membranas, y sistemas de detección para lecturas quimioluminiscentes o fluorescentes.
- Exige la optimización de la dilución de anticuerpos y los tiempos de incubación al integrar el agente potenciador de la reacción inmune.
- Requiere capacitación para garantizar un manejo adecuado de la membrana durante los pasos de drenado y centrifugado, a fin de mantener la integridad de la señal.
- Es más adecuado para laboratorios que realizan inmunotransferencias con frecuencia, donde los ahorros de tiempo se acumulan al analizar múltiples dianas y condiciones.
