Name: Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en la amígdala de ratones libremente comportados utilizando microscopía miniaturizada head-mount. Este protocolo permite monitorear hasta 150 células activas simultáneamente.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Samsung Science and Technology Foundation (Número de proyecto SSTF-BA1801-10).

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
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El autor no tiene nada que revelar

Las técnicas de cirugía hábiles son esenciales para lograr imágenes ópticas de calcio in vivo exitosas con microscopía en miniatura de montaje en la cabeza en regiones cerebrales más profundas como la amígdala como la describimos aquí. Por lo tanto, aunque este protocolo proporciona una guía para procesos quirúrgicos optimizados de fijación de placa base e implantación de lentes GRIN, es posible que sean necesarios procesos de optimización adicionales para pasos críticos. Como se menciona en la sección de protocolo, las ...

El calcio es un segundo mensajero omnipresente, jugando un papel crucial en casi todas las funciones celulares8. En las neuronas, el disparo potencial de acción y la entrada sináptica causan un cambio rápido de libre intracelular [Ca2+]9,10. Por lo tanto, el seguimiento de los transitorios de calcio proporciona una oportunidad para monitorear la actividad neuronal. Los GECIs son potentes herramientas que permiten monitorear [Ca2+] en poblaciones celulares definidas y compartimentos intracelulares11,12. Entre muchos tipos diferentes de indicadores de calcio a base de proteínas, GCaMP, una sonda Ca2+ basada en una sola molécula GFP13,es la GECI más optimizada y por lo tanto ampliamente utilizada. A través de múltiples rondas de ingeniería, se han desarrollado una serie de variantes de GCaMP12,14,15,16. Utilizamos uno de los GCaMPs recientemente desarrollados, GCaMP7b, en este protocolo16. Los sensores GCaMP han contribuido en gran medida al estudio de las funciones de circuito neural en una serie de organismos modelo como la toma de imágenes de los transitorios Ca2+ durante el desarrollo17,la imagen in vivo en una capa cortical específica18,la medición de la dinámica de circuito en el aprendizaje de tareas motoras19 y la imagen de la actividad del conjunto celular relacionada con la memoria de miedo asociativa en el hipocampo y la amígdala20,21.
La imagen óptica de los GECIs tiene varias ventajas22. La codificación genética permite que los GECIs se expresen de forma estable durante un período de tiempo a largo plazo en un subconjunto específico de células definidas por perfil genético o patrones específicos de conectividad anatómica. Las imágenes ópticas permiten un monitoreo simultáneo crónico in vivo de cientos a miles de neuronas en animales vivos. Se han desarrollado algunos sistemas ópticos de imágenes para imágenes in vivo y análisis de GECIs dentro del cerebro de ratones que se comportan libremente con microscopios de fluorescencia miniaturizados de montaje en la cabeza21,23,24,25. A pesar de que la técnica de imagen óptica in vivo basada en GECIs, la lente GRIN y un microscopio en miniatura de montaje en la cabeza son una poderosa herramienta para estudiar el vínculo entre la actividad y el comportamiento de los circuitos neuronales, aplicar esta tecnología a la amígdala ha sido difícil debido a varios problemas técnicos relacionados con la orientación de la lente GRIN a las células que expresan GECIs en la amígdala sin causar artefactos de movimiento que reducen severamente la calidad de la adquisición de imágenes y la búsqueda de células que expresan GECIs. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para los procedimientos quirúrgicos de fijación de placa base e implantación de lentes GRIN que son pasos críticos para obtener imágenes ópticas de calcio in vivo exitosas en la amígdala. Aunque este protocolo se dirige a la amígdala, la mayoría de los procedimientos descritos aquí son comúnmente aplicables a otras regiones cerebrales más profundas. Aunque este protocolo se basa en un sistema en particular (por ejemplo, Inscopix), el mismo propósito puede lograrse fácilmente con otros sistemas alternativos.

<table><tbody><tr><td>Aguja 26G</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&alpha;-GFP</td> Cirugía a <td>medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento Acrílico-Dental (Ortho-jet Acrílico Rosa)</td><td>Lang</td><td>1334-rosa</td><td>Cirugía & Fijación de la placa base</td></tr><tr><td>Manipulador de flujo de aire</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04 Fijación de</td><td>la placa base</td></tr><tr><td>Amoxicilina</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>Placa base</td> para cirugía <td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Fijación de la placa base</td></tr><tr><td>Cubierta de la placa base</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Fijación de la placa base</td></tr><tr><td>Aparato de comportamiento (cámara)</td><td>Coulbourn Instrumento</td><td>Testcage</td><td>Prueba de comportamiento</td></tr><tr><td>Aparato de comportamiento (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Prueba de comportamiento</td></tr><tr><td>Jaula de carbono</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Placa base Accesorio</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de datos</td><td>INSCOPIX INSCOPIX</td><td>Software de procesamiento de datos</td><td>Placa base Adjunto & Prueba de comportamiento</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Taladro</td> de cirugía <td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Fresa de cirugía</td></tr><tr><td></td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Aguja de vidrio</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Cirugía Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Hamilton Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Placa de cabeza de cirugía</td></tr><tr><td></td><td>Neurotar</td><td>Modelo 5</td><td>Llave</td></tr><tr><td>hexagonal de</td> cirugía <td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Accesorio de placa</td></tr><tr><td>base Ordenador portátil</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Surgery & Fijación de la placa base</td></tr><tr><td>Soporte de la lente, varilla estereotáxica (kit de implantes INSCOPIX proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Pinza</td></tr> para <tr><td>microscopio</td> quirúrgico <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td> Microscopio de <td>fijación de la placa base</td></tr><tr><td>, software DAQ, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Fijación de la placa base & Prueba de comportamiento</td></tr><tr><td>Jaula para casa móvil</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Accesorio de placa base</td></tr><tr><td>Brazo motriz</td><td>Neurostar</td><td>Cirugía personalizada</td><td>Software</td></tr> de <tr><td>brazo moteado</td><td>Neurostar</td><td>Cirugía personalizada</td><td></td></tr><tr><td>Tablero de NI</td><td>Instrumento</td><td></td> nacional <td>Prueba de comportamiento</td></tr><tr><td>Unión epoxi extraíble</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Cemento de resina (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C& B</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Tornillo de cráneo</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Portaelectrodos estereotáxico</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Manipulador estereotámico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Fijación de placa base</td></tr></tbody></table>

imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

El monitoreo in vivo en tiempo real de las actividades neuronales en animales en movimiento libre es uno de los enfoques clave para vincular la actividad neuronal con el comportamiento. Para ello, se ha desarrollado y aplicado con éxito a muchas estructuras cerebrales1,2,3,4,5,6una técnica de imágenes in vivo que detecta transitorios de calcio en las neuronas utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), un microscopio de fluorescencia miniaturizado y una lente de índice refractivo degradado (GRIN). Esta técnica de imágenes es particularmente potente porque permite la toma de imágenes simultáneas crónicas de poblaciones celulares genéticamente definidas durante un período a largo plazo hasta varias semanas. Aunque útil, esta técnica de imagen no se ha aplicado fácilmente a las estructuras cerebrales que se encuentran en lo profundo del cerebro como la amígdala, una estructura cerebral esencial para el procesamiento emocional y la memoria del miedo asociativo7. Hay varios factores que dificultan la aplicación de la técnica de imagen a la amígdala. Por ejemplo, los artefactos de movimiento generalmente ocurren con más frecuencia durante las imágenes realizadas en las regiones cerebrales más profundas porque un microscopio de montaje en la cabeza implantado en las profundidades del cerebro es relativamente inestable. Otro problema es que el ventrículo lateral se coloca cerca de la lente GRIN implantada y su movimiento durante la respiración puede causar artefactos de movimiento altamente irregulares que no se pueden corregir fácilmente, lo que dificulta la formación de una vista de imagen estable. Además, debido a que las células de la amígdala suelen estar silenciosas en un estado de reposo o anestesiado, es difícil encontrar y enfocar las células objetivo que expresan GECI en la amígdala durante el procedimiento de placa base para obtener imágenes posteriores. Este protocolo proporciona una guía útil sobre cómo dirigirse eficientemente a las células que expresan GECI en la amígdala con microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza para obtener imágenes de calcio in vivo exitosas en una región cerebral más profunda. Se observa que este protocolo se basa en un sistema particular (por ejemplo, Inscopix) pero no se limita a él.

Validación de la implantación de lentes GRIN Antes de conectar crónicamente la placa base al cerebro mediante la cementación, la implantación de la lente GRIN debe ser validada. En animales con implantación exitosa de lentes, tanto las células que expresan GCaMP como los vasos sanguíneos se observaron claramente dentro de un rango de plano focal determinado por la distancia entre la lente objetiva del microscopio y la lente GRIN implantada(Figura 2<stron...

La imagen de calcio microendoscópica in vivo es una herramienta invaluable que permite el monitoreo en tiempo real de las actividades neuronales en animales que se comportan libremente. Sin embargo, aplicar esta técnica a la amígdala ha sido difícil. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para atacar con éxito las células de amígdala con un microscopio miniaturizado en ratones.

Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Pueden surgir muchos desafíos cuando se utiliza la microscopía miniaturizada para obtener imágenes de calcio in vivo de la amígdala. Este protocolo proporciona pautas que ahorran tiempo para lograr imágenes de calcio in vivo exitosas. Las imágenes de calcio in vivo permiten la obtención simultánea y continua de imágenes de poblaciones celulares definidas genéticamente durante un período de hasta varias semanas, un proceso que anteriormente no era posible.Para la inyección de AAV, con el ratón anestesiado asegurado en un marco estereotáxico, alinee la altura del bregma y la lambda con el alfiler e identifique la ubicación específica en el cráneo expuesto y desinfectado para la craneotomía. Utilice un taladro equipado con una broca de 0,6 milímetros para hacer cuidadosamente una craneotomía de 1,6 milímetros con una velocidad de perforación de 18.000 revoluciones por minuto y lave el cráneo con PBS estéril. Reste la diferencia dorsoventral entre el bregma y la superficie cerebral expuesta de 4,2 milímetros, la coordenada dorsoventral de la implantación del cristalino basada en un bregma para calcular el valor de la distancia A, y cargue tres microlitros de aceite mineral y 0,7 microlitros de un genoma viral mayor de uno por 10 al 13 por mililitro de la solución de AAV en una pipeta de vidrio.Retire la clavija del soporte de la sonda estereotáxica para permitir que la pipeta se fije al marco y coloque la pipeta sobre el lugar de inyección preparado. Cuando la hemorragia se haya detenido por completo, inserte la punta de la pipeta de vidrio de 4,3 milímetros en el tejido cerebral desde la coordenada del bregma dorsoventral y use una bomba de inyección para administrar todo el volumen del virus antes de retirar lentamente la pipeta. Cuando se haya inyectado todo el virus, perfore el cráneo dos veces más, como se ha demostrado para permitir la implantación de dos tornillos de cráneo, y lave las fracciones del cráneo con PBS.A continuación, implante los tornillos esterilizados con etanol al 70% lo más profundamente posible e instale un brazo quirúrgico motorizado en el marco estereotáxico. Conecte el hardware requerido a una computadora portátil en la que esté instalado el software de control y use un soporte de cánula para asegurar de manera estable una aguja de calibre 26 en el marco estereotáctico. Después de calcular las coordenadas para el sitio de inserción de la aguja, use el manipulador estereotáxico para colocar la punta de la aguja en la superficie expuesta del cerebro e hidratar el tejido cerebral con dos o tres gotas de PBS.Introduzca las coordenadas de la amígdala dorsoventral y lateral adecuadas en el software y haga clic en Ir a para bajar la aguja. Cuando la aguja se haya detenido por completo, introduzca 45 milímetros en el cuadro de posición de inicio y haga clic en Pasar a para elevar la aguja. Cuando la aguja deje de moverse, retire el PBS de la superficie del cerebro y desinstale el soporte de la aguja y la cánula del marco estereotáxico.Fije el soporte de la lente a la varilla estereotáxica y fije la lente GRIN al soporte de la lente. Esterilice la lente con etanol al 70% y fije la varilla estereotáxica al marco estereotáxico. Coloque la punta de la lente GRIN en el sitio designado en la superficie del cerebro y reste el valor absoluto de A de la coordenada dorsoventral de la superficie del cerebro para determinar la coordenada dorsoventral para la implantación de la lente.Hidrate el tejido cerebral con dos o tres gotas adicionales de PBS y use el brazo motorizado para establecer la profundidad de descenso a 1.000 micrómetros y la altura de elevación a 300 micrómetros. Cuando la lente GRIN llegue al sitio objetivo, retire el PBS y aplique con cuidado cemento dental de resina alrededor de la lente GRIN, los tornillos y las paredes laterales de los tornillos. Cuando el cemento dental se haya endurecido, retire el soporte de la lente y aplique cemento acrílico en la superficie del cráneo.A continuación, reemplace el soporte de la lente con una placa de cabeza pegada con cinta adhesiva a la punta de la varilla en orientación horizontal. Baje lentamente la varilla hasta que la placa de la cabeza se coloque en la parte superior del manguito de la lente antes de bajar la placa de la cabeza 1.000 micrómetros hasta que la lente se encuentre en el borde derecho del anillo interno de la placa de la cabeza. Use cemento acrílico para unir la placa de la cabeza a las capas de cemento y use una película de parafina para proteger la superficie de la lente GRIN implantada del polvo, luego aplique una unión epoxi removible sobre la película de parafina para asegurar la película a la superficie de la lente y devolver al animal a su jaula con monitoreo hasta que esté completamente recostado.Para evaluar la calidad de la implantación de la lente GRIN, coloque una jaula de carbono debajo del ratón anestesiado en la barra de la cabeza de un sistema de jaula para casas móviles y abra el flujo de aire para que la jaula se mueva libremente sin fricción. Utilice una pinza de microscopio y un manipulador estereotáxico para alinear verticalmente un microscopio miniaturizado con el marco antes de bajar el microscopio hasta que la superficie de la lente GRIN implantada aparezca en el campo de visión de la imagen dentro del software. Alinee el centro de la lente GRIN implantada con el centro del campo de visión y capture la imagen de la superficie de la lente GRIN implantada, luego levante lentamente la lente del objetivo del microscopio mientras observa la imagen para ver la apariencia de células que expresan GCaMP.En los animales con un implante exitoso del cristalino, tanto las células que expresan GCaMP como los vasos sanguíneos se pueden observar claramente dentro de un solo rango de plano focal. Por el contrario, en animales con implantación fuera del objetivo, no se observa una imagen clara de las células que expresan GCaMP dentro del rango del plano focal, aunque los vasos sanguíneos pueden observarse con cierta dificultad. En el caso de una lente fuera de la visión, no se pueden visualizar ni los vasos sanguíneos ni las células que expresan GCaMP y se puede observar un borde brillante en la lente GRIN implantada.En los animales con un implante exitoso de lente GRIN, aproximadamente 50 a 150 células probablemente espontáneamente activas suelen mostrar un cambio de fluorescencia significativo dentro del campo de visión en la amígdala lateral, incluso sin tono. Tras la presentación del tono, solo unas pocas celdas muestran un cambio específico del tono de la señal GCaMP según lo determinado por el análisis de imagen delta F. Cuando se realiza el mismo análisis en ratones inyectados con AAV que expresan GFP como control, las células que expresan GFP se detectan dentro del rango del plano focal y ninguna célula muestra un cambio de fluorescencia significativo con o sin tono.La verificación histológica de la expresión de GCaMP y la focalización de la lente GRIN no revela signos de daño tisular debido a la inflamación del tejido cerebral alrededor de la lente GRIN. Si la velocidad de la aguja o de la lente no es constante, puede causar artefactos de movimiento y una mala calidad de imagen. El uso de un brazo de cirugía motorizada puede ayudar.Si el sistema de cuidado de la casa móvil no está listo durante el paso de fijación de la placa base, se puede utilizar una baja concentración de gas isoflurano para anestesiar el ratón durante la fijación de la placa base.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Fuente: Lee, H. et. al., Imágenes exitosas de calcio in vivo con un microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza en la amígdala de un ratón que se comporta libremente. J. Vis. Exp. (2020)Este video muestra imágenes de calcio in vivo en un ratón utilizando un índice de refracción de gradiente, o lente GRIN, y un microscopio miniaturizado. La configuración combina la fijación de la cabeza dentro de un sistema de jaula móvil sin fricción, estimulando las neuronas y desencadenando la entrada...

Imágenes microendoscópicas de calcio en tiempo real en un ratón que se mueve libremente

Fuente: Thapa, R., et. al., Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio en el cerebro profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)El video muestra imágenes de calcio en tiempo real utilizando un miniscopio en un ratón transducido, correlacionando la actividad neuronal con el comportamiento.

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Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

El giro dentado del hipocampo lleva a cabo funciones esenciales y distintas en el aprendizaje y la memoria. Este protocolo describe un conjunto de procedimientos robustos y eficientes para la obtención de imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado en ratones que se mueven libremente.

Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones 

Este protocolo investiga la relación cerebro-comportamiento en el hipocampo CA1 en ratones que navegan por una columna de olor. Proporcionamos un protocolo paso a paso, que incluye cirugía para acceder a imágenes del hipocampo, entrenamiento conductual, registro y procesamiento del cerebro con miniscopio GCaMP6f, y datos de comportamiento para decodificar la posición del ratón a partir de la actividad neuronal ROI.

Miniscopio que registra señales de calcio en el hipocampo de ratones que navegan por una columna de olor

Este protocolo detalla la imagen in vivo de calcio de neuronas hipotalámicas utilizando un microscopio miniaturizado (miniscopio) en ratones que se comportan libremente durante la manipulación del estado social (aislamiento social y reencuentro social). Este método permite la obtención de imágenes a resolución neuronal única de la actividad hipotálmica que representa la necesidad social y la saciedad social, facilitando estudios mecanicistas de la homeostasis social.

In Vivo Imagen de calcio con microscopio miniaturizado en el hipotálamo para comprender los comportamientos sociales en ratones

Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en la amígdala de ratones libremente comportados utilizando microscopía miniaturizada head-mount. Este protocolo permite monitorear hasta 150 células activas simultáneamente.

Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente (Video) | JoVE Journal

Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente

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