Name: Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende la transformación mediada por Agrobacterium en arroz para editar genes con CRISPR-Cas9 y generar líneas estériles masculinas. Este protocolo permite estudiar la función de genes reproductivos en Oryza sativa.

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Los autores desean reconocer a Xiaofei Chen por proporcionar las inflorescencias de arroz joven y la asistencia en la elaboración del medio de cultivo del tejido de arroz. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900611).

1. construcción de vectores de expresión vegetal sgRNA-CAS9 y transformación mediada por Agrobacterium
<ol><li>Dirigirse a un gen estéril macho OsABCG15 en arroz según la literatura publicada28.</li>
	<li>Diseñe sgRNA para el sitio de destino ubicado entre 106-125 bp en el segundo exón de OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Utilice T4 polinucleótidos quinasa para sintetizar los oligos de sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' y 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCTTGAGGTGATGCTT').</li>
	<li>Utilice endonucleasa BbsI para digerir el vector de estructura básica psgR-Cas929.</li>
	<li>Ligar los oligos de sgRNA sintetizados con la columna vertebral linealizada psgR-Cas9 utilizando ligasa T4 siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Usando HindIII/EcoRI, digiere el casete sgRNA del paso 1.5 y el subclón en el sitio HindIII/EcoRI del vector binario pCAMBIA1300 para una transformación estable29.</li>
	<li>Confirmar el plásmido construido por digestión enzimática y secuenciación. Más tarde, transformar la construcción binaria en la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 y cultivarlas en placas de selección Kan/Rif a 28 oC durante 2-3 días.</li>
</ol>2. Transformación genética del arroz y cultivo de tejidos vegetales
<ol><li>Inducción y regeneración del callo NOTA: Utilice inflorescencias de arroz joven fresco como material de partida para inducir callo (Figura 2).<ol>
<li>Recoger las inflorescencias jóvenes del arrozal o casa verde en la etapa de meiosis, determinada por la longitud del florete de 1,6-4,8 mm (Figura 2A)29. Asegúrese de que las inflorescencias de arroz estén cubiertas con vaina de hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar.</li>
		<li>Lleve la inflorescencia a un banco estéril limpio. Cortarlo en trozos pequeños (cuanto más pequeño mejor) con tijeras esterilizadas y luego transferir esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2 (Figura 2B, Tabla 1).</li>
		<li>Incubar la placa en la oscuridad a 26oC durante unos 10-14 días para inducir callo (Figura 3A). NOTA: Utilice el callo recién formado para la infiltración de Agrobacterium (paso 2.2.7) directamente o vuelva a condicionar una vez más en medio NBD2 fresco para obtener más callos. Transfiera el callo al nuevo medio NBD2 cada 8-10 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformación y co-cultivo<ol>
<li>Utilice la bacteria A. tumefaciens que contiene el plásmido binario del paso 1.6 para la transformación. Conservar las cepas de A. tumefaciens en el medio YEB(Tabla 1) con 50% de glicerol a -80 oC para su uso posterior.</li>
		<li>Racha A. tumefaciens de una población de glicerol de -80 oC hasta un medio de agar YEB que contiene antibióticos selectivos(Tabla 1) y crece a 25–28 oC durante 48-72 h, para permitir que aparezcan colonias.</li>
		<li>Inocular una sola colonia de la placa YEB con antibióticos selectivos a 5 ml de medio líquido YEB que contenga los mismos antibióticos selectivos (Tabla 1), en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 ml. Agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 25–28 oC hasta que las bacterias crezcan a un OD600 de 0,5.</li>
		<li>Añadir 1 ml de suspensión bacteriana a 100 ml de medio YEB(Tabla 1) con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 ml y agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 28 oC durante 4 h.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger bacterias. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet bacteriano con medio AAM-AS(Tabla 1) y diluir la suspensión a un OD600 a 0,4. NOTA: El OD perfecto de la suspensión bacteriana es fundamental para una transformación eficiente. Ayuda a eliminar el crecimiento bacteriano excesivo en el callo.</li>
		<li>Recoger alrededor de 150 calli embriogénicos frágiles de color amarillo claro sano del paso 2.1.3 en un matraz estéril de 150 ml. Añadir 50–75 ml de suspensión de células bacterianas del paso 2.2.6 en el matraz estéril, y luego añadir unos 10–25 ml de medio AAM-AS fresco para sumergir la cali durante 10-20 minutos, temblando ocasionalmente.</li>
		<li>Vierta cuidadosamente la suspensión bacteriana del matraz y seque el exceso de suspensión bacteriana del callo utilizando papel de filtro estéril #1 o papel tisú. A continuación, colóquelos en un plato de Petri con medio NBD-AS (Tabla 1) cubierto con un papel de filtro estéril #1. Incubar a 25–28 oC en la oscuridad durante 3 días y comprobar si hay crecimiento excesivo bacteriano.</li>
	</ol></li>
	<li>Selección para callos resistentes<ol>
<li>Después de 3 días de co-cultivo, transfiera el callo a un plato estéril de Petri con un papel de filtro estéril.</li>
		<li>Secar al aire la calla durante 2 horas en un banco limpio. Asegúrese de que el callo no esté adherido al papel de filtro.</li>
		<li>Transfiera las pinzas uniformemente utilizando pinza estéril al medio de selección primario NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de cronotina)(Tabla 1). Calli de la cultura durante 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.</li>
		<li>Después de 2 semanas, transfiera las callos de forma uniforme a una placa nueva que contenga un medio de selección fresco NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultivar el calli durante otras 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de Callus<ol>
<li>Transfiera el callo al medio MS fresco (con 25 mg/L de higromicina y 150 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultura bajo la luz a 25-28 oC durante alrededor de 2 semanas.</li>
		<li>Repita el paso 2.4.1 una vez más.</li>
		<li>Transfiera los brotes al nuevo medio de LA MS (con 10 mg/L de higromicina) para proliferar más brotes.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción de raíz<ol>
<li>Transfiera los nuevos brotes a un medio MS de 1/2 (Tabla 1). Cultivo bajo la luz a 25oC - 28oC. Las plantas transformadas producen raíces en 2 semanas.</li>
		<li>Después de 1 semana, transferir las plantas a macetas limpias que cubren la planta para evitar la deshidratación.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificación genotipo
<ol><li>Recoger hojas jóvenes de plantas de nueva generación para la extracción total de ADN utilizando el método de bromuro de amonio de cepiltrimetil (CTAB)31.</li>
	<li>Utilizando el ADN genómico como plantilla, elija las imprimaciones (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' e Higromicina-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' ubicadas en la región de Higromicina) para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la integración y frecuencias de transgén(Figura 4). Las siguientes condiciones de PCR: 94 oC durante 5 min; 36 ciclos (94oC para 30 s; 56oC para 30 s; 72oC durante 1 min); 72oC durante 7 min. Las reacciones PCR exitosas producen un amplicon de 604 bp.</li>
	<li>Realizar otro PCR para amplificar la región genómica que rodea los sitios de destino CRISPR utilizando imprimaciones específicas (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTCTCAACAGTTTCT 3' y OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTAAATTACATTGCTAT 3') para identificar el genotipo de los transformadores. Las condiciones PCR son las mismas que en el paso 3.2.</li>
	<li>Utilice fragmentos de PCR del paso 3.3 directamente para la secuenciación de Sanger para identificar mutaciones.</li>
</ol>4. Observar el fenotipo básico del mutante
<ol><li>Preparar la solución I2-KI: disolver 2 g de KI (yoduro de potasio) en 10 ml de agua destilada y luego añadir 0,2 g de I2 (yodo resublimed) en él. Después de mezclar, llevar el volumen total a 100 ml con agua destilada.</li>
	<li>Preparar la solución FAA (63% etanol anhidro, 5% ácido acético glacial, 5% formaldehído y 27% agua) y mezclar antes de usar.</li>
	<li>Preparar la solución de tinción azul toluidina al 0,5%: disolver 0,5 g de azul toluidina en 100 ml de agua destilada.</li>
	<li>Realizar la observación fenotípica vegetativa, mediante la toma de imágenes de todas las plantas con una cámara digital.</li>
	<li>Realizar la observación del fenotipo reproductivo, eliminar la palea y el lema del florete. Tome fotos de las dedos enteros bajo un estereomicroscopio.</li>
	<li>Observe la viabilidad del polen por tinción de yodo.<ol>
<li>Escoge espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor, retira la palea y el lema para liberar las anteras.</li>
		<li>Tome 6 anras y colóquelas en un portaobjetos de vidrio. Añadir 1 gota de agua destilada, aplastar bien la antera con pinzas para liberar los granos de polen, y luego añadir 2-3 gotas de I2-KI solución. Cubra con el cubreobjetos.</li>
		<li>Observar bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, ningún color o amarillo-marrón teñido se atrofian o degeneran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar una sección semifina de arroz anther<ol>
<li>Fije las flores de arroz de diferentes etapas del desarrollo en una solución de la FAA. Vacíe los materiales a 4oC (generalmente 15 min) para permitir que el fijador penetre en los tejidos hasta que el material se hunda hasta el fondo de la botella de recogida.</li>
		<li>Reemplace con una nueva solución FAA al día siguiente. Una vez que el material se hunda hasta el fondo, sustituir con 70% de etanol y almacenar a 4 oC para uso a largo plazo.</li>
		<li>Deshidratar los materiales con diferentes gradientes de etanol (70%, 80%, 95% cada vez durante 30 min, 100% etanol para 2 h, 100% etanol que contiene un poco de tinte Safranin durante 2 h). NOTA: Agregue un poco de tinte de Safranin en el segundo etanol 100% para colorear las anteras para seccionarlas más fácilmente después.</li>
		<li>Realice la incrustación siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). A continuación, hornee en un horno a 60oC durante 48 horas antes de seccionar.</li>
		<li>Secise la muestra a un espesor de 2 m utilizando un microtoma. Agregue una gota de agua en el tobogán de vidrio. A continuación, recoger las secciones delgadas que contienen bloques de antera por fórceps y ponerlos en la superficie de la gota de agua en los portaobjetos.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en el baño de agua a 50 oC para esparcir completamente las secciones y dejar que se adhiera firmemente al tobogán.</li>
		<li>Utilice una solución azul toluidina al 0,5% para manchar los portaobjetos durante 30 min. A continuación, enjuague con agua y séquelo en la campana de humos. Sellar con pegamento de árbol neutro. Coloque suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y séquelo en la campana de humos.</li>
		<li>Observar y fotografiar la muestra bajo un microscopio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
</ol>

Los mutantes estériles masculinos artificiales son generados tradicionalmente por mutagénesis física, química o biológica aleatoria. Aunque se trata de técnicas poderosas, su naturaleza aleatoria no capitaliza la gran cantidad de conocimiento genómico moderno que tiene el potencial de ofrecer mejoras personalizadas en la cría molecular32. El sistema CRISPR-Cas9 ha sido ampliamente utilizado en plantas debido a sus medios simples y asequibles para manipular y editar ADN29,<s...

El arroz es el cultivo alimentario más importante, particularmente en los países en desarrollo, y representa un alimento básico para más de la mitad de la población mundial. En general, la demanda de grano de arroz está creciendo y se prevé que aumente un 50% para 2030 y un 100% para 20501,2. Las futuras mejoras en el rendimiento del arroz tendrán que capitalizar diversos recursos moleculares y genéticos que hacen del arroz un modelo excelente para la investigación monocoqueledonosa de las plantas. Estos incluyen un sistema de transformación eficiente, mapa molecular avanzado y base de datos accesible al público de etiquetas de secuencia expresadas, que se han generado a lo largo de muchos años3,,4. Una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos es la producción de semillas híbridas5,cuyo elemento central es la capacidad de manipular la fertilidad masculina. Comprender el control molecular de la fertilidad masculina en los cultivos de cereales puede ayudar a traducir los conocimientos clave en técnicas prácticas para mejorar la producción de semillas híbridas y mejorar la productividad de los cultivos6,,7.
La transformación genética es una herramienta clave para la investigación básica y la agricultura comercial, ya que permite la introducción de genes extraños o la manipulación de genes endógenos en las plantas de cultivo, y resulta en la generación de líneas modificadas genéticamente. Un protocolo de transformación adecuado puede ayudar a acelerar los estudios de biología genética y molecular para la comprensión fundamental de la regulación genética8. En las bacterias, la transformación genética tiene lugar de forma natural; sin embargo, en las plantas, se realiza artificialmente utilizando técnicas de biología molecular9,,10. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram-negativa transmitida por el suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas mediante la transferencia de ADN-T, una región de su plásmido Ti, a la célula vegetal a través de un sistema de secreción tipo IV11,12. En las plantas, la transformación mediada por A. tumefaciensse considera un método generalizado para la modificación del gen, ya que conduce a la integración estable y bajo del número de copia del ADN-T en el genoma del huésped13. El arroz transgénico se generó por primera vez a través de la transformación genética mediada por Agrobacteriuma mediados de la década de 1990 en el cultivarjaponica 14. Usando este protocolo, se obtuvieron varias líneas transgénicas en un período de 4 meses con una eficiencia de transformación del 10%-30%. El estudio indicó que hay dos pasos críticos para la transformación exitosa: uno es la inducción del callo embrionario a partir de semillas maduras y otro es la adición de acetosyringona, un compuesto fenólico, al cultivo bacteriano durante el cultivo, que permite una mayor eficiencia de transformación en plantas14,,15. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado con alteraciones menores en japonica16,17,18,19 así como otros cultivares como indica20,,21,22,23 y tropical japonica24,25. De hecho, más del 80% de los artículos que describen la transformación del arroz utilizan la transformación genética mediada por Agrobacteriumcomo herramienta13. Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de transformación genética utilizando semillas de arroz como material de partida para la inducción de callos16,17,18,19. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la inflorescencia joven como explantas para la producción de callos. En general, es importante establecer un protocolo rápido, reproducible y eficiente de transformación y regeneración genética para la genómica funcional y estudios sobre la mejora de los cultivos.
En los últimos años, el avance de la tecnología CRISPR-Cas9 ha dado lugar a un mecanismo preciso de edición del genoma para comprender la función génica y ofrecer mejoras agronómicamente importantes para la cría de plantas26,,27. CRISPR también ofrece una considerable promesa para la manipulación del desarrollo reproductivo masculino y la producción híbrida. En este estudio, utilizamos un sistema de eliminación de genes utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y lo acoplamos a un protocolo eficiente de transformación del gen del arroz utilizando inflorescencias jóvenes como explantas, creando así líneas estériles masculinas estables para el estudio del desarrollo reproductivo.

<table><tbody><tr><td>Ácido 1-naftalenacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, ácido 4-diclorofenoxiacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-benzilaminopurina (6-BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de aneurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>Sangon Biotech A100636</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de carne de vacuno</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolizado de ácido de caseína</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa anhidra</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sal disódica, dihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS Cámaras digitales SLR y de sistema compacto</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo totalmente automatizado</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) heptahidratado</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso monohidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td> Microscopios de 10013418 <td></td></tr><tr><td></td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Fitagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de potasio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potasio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de piridoxina (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sodio dihidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Microscopios estereoscópicos</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Kits de inclusión Technovit 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Alemania</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua para secciones de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-transformación genética mediada, producción transgénica, y su aplicación para el estudio del desarrollo reproductivo masculino en el arroz

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

La esterilidad masculina es un rasgo agronómico importante para la producción de semillas híbridas que generalmente se caracteriza por defectos funcionales en órganos reproductores/gametos masculinos. Los avances recientes en la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 permiten una alta eficacia de edición y mutaciones eliminatorias de los genes candidatos endógenos en sitios específicos. Además, la transformación genética mediada por Agrobacteriumdel arroz es también un método clave para la modificación de genes, que ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios públicos y privados. En este estudio, aplicamos las herramientas de edición del genoma CRISPR-Cas9 y generamos con éxito tres líneas mutantes estériles masculinas mediante la edición específica del genoma de OsABCG15 en un cultivar de japonica. Utilizamos un método modificado de transformación de arroz mediado por Agrobacteriumque podría proporcionar excelentes medios de emasculación genética para la producción de semillas híbridas en el arroz. Las plantas transgénicas se pueden obtener en un plazo de 2 a 3 meses y los transformantes homocigotos se examinaron mediante el genotipado mediante amplificación de PCR y secuenciación de Sanger. La caracterización fenotípica básica de la línea homocigota estéril masculina se realizó mediante observación microscópica de los órganos reproductores masculinos de arroz, análisis de viabilidad del polen por yoduro de potasio yodo (I2-KI)tinción semi-delgada sección transversal de los anteras en desarrollo.

Aquí se demuestra el uso de la tecnología de edición de genes para crear una línea estéril masculina para futuras investigaciones por Agrobacterium-transformación genética mediada en el arroz. Para crear la línea estéril masculina de osabcg15,se utilizó mutagénesis mediada por CRISPR-CAS9 para la construcción de vectores binarios. El sgRNA fue impulsado por el promotor OsU3, mientras que el casete de expresión de hSpCas9 fue impulsado por el promotor 35S doble, y el vector medio fue ensamblado en un sol...

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Las inflorescencias jóvenes como explant para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y un método de regeneración para revelar la función génica, así como para la mejora de los cultivos. Las inflorescencias jóvenes como explan para la producción de callos son importantes para establecer una transformación genética rápida y eficiente y el método de regeneración para revelar la función génica. La demostración en vídeo de esta técnica ayudará al espectador a entender el proceso de mantenimiento de los materiales para producir esa alineación transgénica deseada sin perder tiempo y esfuerzo.Comience por recoger inflorescencias de arroz jóvenes del campo de arroz o de un invernadero en la etapa de meiosis, asegurándose de que estén cubiertas con la vaina de la hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar. Lleve la inflorescencia a un banco de laboratorio estéril y córtelo en trozos pequeños con tijeras esterilizadas, luego transfiera los esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2.Incubar la placa en la oscuridad a 26 grados celsius durante 10 a 14 días para inducir callo. Para realizar la transformación, transfiera una sola colonia de la placa blanca EB con antibióticos selectivos a cinco mililitros de medio YEB líquido que contenga los mismos antibióticos en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 mililitros. Agitar el tubo en un agitador orbital a 250 veces g y 25 a 28 grados Celsius hasta que las bacterias crezcan a un OD 600 de 0.5.Añadir un mililitro de suspensión bacteriana a 100 mililitros de medio YEB con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 mililitros y agitar el matraz en un agitador orbital a 250 g y 28 grados Celsius durante cuatro horas. Centrifugar el cultivo a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger las bacterias. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet con medio AAM AS, luego diluya la suspensión a un OD 600 de 0.4.Después de la incubación, recoger alrededor de 150 calli embriogénicos amarillo claro sano en un matraz estéril de 150 mililitros. Añadir de 50 a 75 mililitros de la suspensión celular bacteriana en el matraz y luego añadir de 10 a 25 mililitros de AAM fresco como medio para sumergir la calla durante 10 a 20 minutos, temblando ocasionalmente. Vierta la suspensión bacteriana del matraz cuidadosamente y seque la cali con papel de filtro estéril, luego colóquela en un plato de Petri con un medio NBD AS y cúbralas con papel de filtro.Incubar los callos a 25 a 28 grados centígrados en la oscuridad durante tres días, controlándolos para detectar el crecimiento excesivo bacteriano. Después de tres días de cultivo, transfiera la calita a un plato estéril de Petri con papel de filtro y, a continuación, séquelos al aire durante dos horas en un banco limpio. Asegúrese de que las callas no estén adheridas al papel filtrante y transfiéralas al medio de selección primario NBD2.Después de dos semanas, transfiera el calli uniformemente a un nuevo plato que contenga un nuevo medio de selección, luego mueva el calli al medio de LA MS fresco para la diferenciación y los cogollos de brote al medio MS con 10 miligramos por litro de higromicina para proliferar más brotes. Transfiera los nuevos brotes a medio de media NIEBLA para la inducción de la raíz y los cultivo bajo la luz a 25 a 28 grados centígrados. Las plantas transformadas deben producir raíces dentro de dos semanas.Para realizar la observación del fenotipo reproductivo, retire la palea y el lema del floro y imagine las anteras enteras bajo un microscopio estéreo. Para observar la viabilidad del polen, escoja espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor y retire la palea y el lema para liberar las anteras. Tome seis anras y colóquelas en un tobogán de vidrio.Añadir una gota de agua destilada, aplastar la antera con pinzas para liberar los granos de polen, a continuación, añadir dos a tres gotas de solución de yodo y cubrir con un cubreobjetos. Observe la diapositiva bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, mientras que los granos sin color o los de color marrón amarillo teñido se atrofian o degeneran.Para realizar la microscopía de sección transversal, utilice una solución azul de 0,5% de toluidina para manchar los portaobjetos durante 30 minutos, luego enjuáguelos con agua y séquelos en la campana del humo. Una vez secas, sella las diapositivas con pegamento de árbol neutro, coloca suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y sécalos en la campana de humo, luego haz una imagen de la muestra bajo un microscopio. Este protocolo fue utilizado para crear una línea estéril masculina por agrobacterium-transformación genética mediada en arroz.Los calli embrionarios se utilizaron directamente para la transformación o subcultivo para la proliferación para obtener más calli para una mayor infección. Después de co-cultivar durante 48 horas, los calli fueron trasladados a una segunda ronda de medio de selección. Después de 10 a 14 días, los calli transformados mostraron microcalli recién formados mientras que los callos no transformados se volvieron marrones y murieron.Más tarde, las calis de color sanas y cremosas se transfirieron al medio de regeneración. Los calli transformados poco a poco mostraron puntos verdes. Estas manchas verdes se cultivaron en medio de regeneración para permitir el crecimiento del brote y luego se desplazaron a medio de la mitad de la NIEBLA para inducir raíces.Más tarde, se cosecharon brotes de cultivo sanos y vigorosos con raíces bien desarrolladas. En total, se obtuvieron 21 plántulas regeneradas. La amplificación de PCR para la región de Higromicina mostró que la frecuencia de transformación era de aproximadamente 85,71%Los transformantes fueron genotipados para identificar las mutaciones en los sitios de destino de sgRNA.Entre las 18 plantas transgénicas, ocho líneas heterocigotas y tres líneas homocigotas estaban crispr CAS9 positivas. Los mutantes nocautut homocigotos fueron validados por la observación básica de órganos reproductores masculinos. Las anras de osabcg15 eran más pequeñas y más pálidas que las del tipo salvaje y carecían de granos de polen maduros.Se realizó una microscopía de sección transversal para investigar los defectos morfológicos anther en osabcg15. En la etapa 10, las microoras de tipo salvaje se volvieron redondas y vacuoladas con exine teñido de azul oscuro. Por el contrario, las microorasporas osabcg15 colapsaron y se degradaron.Al intentar este protocolo, es importante asegurarse de que el material recogido está en fase de meiosis y controlar el tiempo de secado al aire de la calla.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Beernink, B. M. et al. Agroinoculación directa de plántulas de maíz mediante inyección con clones infecciosos del virus recombinante del mosaico de la cola de zorro y del virus del mosaico de la caña de azúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demuestra la administración mediada por Agrobacterium de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para el silenciamiento génico. Describe el proceso de infección por Agrobacterium , la propagación sistémica del virus y los cambios...

Administración mediada por agrobacterias de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para silenciamiento génico

En este video, demostramos la transformación genética del genoma del arroz utilizando un vector binario de Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria facilita la transferencia de un plásmido de ADN extraño utilizando proteínas de virulencia de Agrobacterium.

Transformación genética mediada por agrobacterias: un método para transformar genéticamente el genoma del arroz a través de Agrobacterium tumefaciens modificado genéticamente

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Los genes morfogénicos de las plantas se pueden utilizar para mejorar la transformación genética de los genotipos recalcitrantes. Aquí se describe un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium(QuickCorn) para tres importantes líneas de maíz público endogámico.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Debido a su aplicación versátil como especie modelo en diversos campos de estudio, existe la necesidad de un conjunto de herramientas de transformación genética en plátano de hoja estrecha (Plantago lanceolata).  Aquí, utilizando la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, se presenta un protocolo que da como resultado líneas transgénicas estables con una eficiencia de transformación del 20%.

Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens del plátano de hoja estrecha

Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.

Agrobacterium tumefaciens-Ingeniería genética mediada por microalgas verdes, Chlorella vulgaris

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

El protocolo describe el mejoramiento de variedades de arroz con almidón resistentes por diseño utilizando tecnologías de edición genómica de una manera precisa, eficiente y técnicamente simple.

Mejoramiento por Diseño de Arroz Funcional con Tecnologías de Edición Genómica

Presentamos un protocolo eficiente y optimizado para la transformación mediada por Agrobacterium de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sin procedimientos intensivos en recursos de cultivo de tejidos estériles. Utilizando un marcador de transformación visual y una tubería de regeneración de brotes se generaron con éxito transformantes casi clonales, avanzando así en los futuros estudios sobre la adaptación de las plantas al entorno submarino.

Transformación eficiente basada en regeneración mediada por agrobacterias de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica

Pruebas de sensibilidad visual de las lagartijas con un paradigma de condicionamiento operante que utiliza la reproducción de vídeo de puntos aleatorios kinematograms e invertebrados generadas por ordenador.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Aprende la transformación mediada por Agrobacterium en arroz para editar genes con CRISPR-Cas9 y generar líneas estériles masculinas. Este protocolo permite estudiar la función de genes reproductivos en Oryza sativa.

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz (Video) | JoVE Journal

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

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