Name: Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprende a detectar interacciones entre proteínas de membrana tipo III del Golgi en células HEK293 vivas mediante el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Este método sensible permite identificar complejos heterólogos sin efectos nocivos por sobreexpresión.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención n.º 2016/23/D/NZ3/01314 del Centro Nacional de Ciencias (NCN), Cracovia, Polonia.

1. Generación de plásmidos de expresión
<ol><li>Examinar la topología de membrana de las proteínas de interés utilizando una herramienta de predicción de topología.</li>
	<li>Diseñar la estrategia de clonación para que los fragmentos más grandes y más pequeños se enfrenten al citoplasma una vez que las proteínas de fusión se hayan insertado en las membranas de Golgi. Si, como en el caso aquí presentado, tanto N- como C-termini de las proteínas de interés están orientadas citoplasmáticamente, etiquete las proteínas de ocho maneras posibles (ver Figura 1B). Si N- o C-terminal de una o ambas proteínas de interés está orientada luminalmente, excluirla del etiquetado.</li>
	<li>Subclónea los genes de interés en vectores de expresión apropiados (ver Tabla de Materiales) siguiendo protocolos de clonación estándar. NOTA: Se recomienda probar todas las orientaciones posibles, ya que algunas opciones de etiquetado pueden no funcionar debido a una proximidad insuficiente, orientación subóptima o restricciones espaciales.</li>
</ol>2. Transfección transitoria de los plásmidos de expresión en las células
<ol><li>Cosechar el cultivo celular adherente HEK293T por tripsinización y resuspendir las células en un medio de crecimiento completo dedicado. Coloque las celdas (2 x 104/100 μL/pozo) en una placa inferior transparente, de 96 pocillos. Ajuste el número total de pozos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas. NOTA: Intente usar solo los 60 pocillos internos de la placa para minimizar los cambios térmicos y evitar la evaporación durante la noche. El uso de placas recubiertas de poli-D-lisina es muy recomendable, como las indicadas en la Tabla de Materiales, de lo contrario las celdas pueden desprenderse durante los pasos de lavado posteriores.</li>
	<li>Cultive las células durante la noche en condiciones estándar (37 °C, 5% co2).</li>
	<li>Al día siguiente transfectar las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión obtenidos en el punto 1.1.<ol>
<li>Diluir los plásmidos de expresión en un medio libre de suero (ver Tabla de Materiales) a 6,25 ng/μL para cada constructo.</li>
		<li>Agregue el reactivo de transfección a base de lípidos en una proporción adecuada de lípidos a ADN e incube de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Añadir 8 μL de mezcla de lípidos:ADN a los pocillos designados. Mezcle el contenido de la placa mediante una rotación suave. Esto da como resultado la transfección de ambos constructos de expresión a 50 ng/pocillo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultive las células durante 20-24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% CO2). NOTA: El cultivo de las células durante más tiempo puede resultar en niveles más altos de expresión de proteínas de fusión, lo que puede promover una asociación no específica entre los fragmentos.</li>
</ol>3. Intercambio medio
<ol><li>Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado con 100 μL de un medio sin suero en cada pozo. Asegúrese de que las células no se hayan desprendido tras el intercambio de medios. NOTA: Este paso debe realizarse 2-3 h antes de la adición de la solución de trabajo de furimazina. La abstinencia sérica minimiza el fondo causado por la autoluminiscencia de furimazina.</li>
</ol>4. Preparación de la solución de trabajo de furimazina
<ol><li>Justo antes de la medición, mezcle 1 volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución (una dilución de 20 veces). NOTA: El volumen total de la solución de trabajo de furimazina a preparar depende del número de pocillos individuales a analizar (la solución de trabajo de furimazina se agrega al medio de cultivo celular en una proporción de 1:5, por lo tanto, a cada pozo previamente lleno con 100 μL de un medio libre de suero se deben agregar 25 μL de la solución de trabajo de furimazina).</li>
	<li>Agregue la solución de trabajo de furimazina a los pozos designados (25 μL/pocillo). Mezcle suavemente la placa a mano o usando un agitador orbital (por ejemplo, 15 s a 300-500 rpm).</li>
</ol>5. Medición de luminiscencia
<ol><li>Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia.<ol>
<li>Para los experimentos que se van a realizar a 37 °C equilibrar la placa durante 10-15 min a la temperatura indicada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione los pozos a analizar.</li>
	<li>Luminiscencia de lectura con tiempo de integración de 0,3 s. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta 2 h cuando sea necesario.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Calcule los valores medios y las desviaciones estándar para todas las combinaciones probadas y de control.</li>
	<li>Analice datos utilizando ANOVA unidireccional con múltiples comparaciones.</li>
	<li>Calcular los valores de cambio de pliegue dividiendo una luminiscencia media obtenida para combinaciones de interés por una luminiscencia media obtenida para los controles negativos correspondientes. Evaluar los resultados. NOTA: El enfoque de análisis de datos propuesto aquí asume que la interacción puede ser reclamada si la luminiscencia obtenida para la combinación probada es estadísticamente significativamente mayor que la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente y, al mismo tiempo, la relación de estos dos valores supera 10.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado que permite la demostración de complejos heterólogos formados entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi, como los NST, utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida. El enfoque propuesto para el análisis e interpretación de datos implica relacionar la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés con la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente, que está compuesta por una de las proteínas de interés fus...

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para verificar la presencia de interacciones heterólogas entre las proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi en células humanas transfectadas transitoriamente utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida. El procedimiento ha sido probado más extensamente contra transportadores de azúcar de nucleótidos (NST), pero también pudimos obtener resultados positivos para otras proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi cuyos N- y / o C-termini se enfrentan al citoplasma.
Nuestro grupo de investigación explora el papel de los NST en la glicosilación de macromoléculas. Los NST son proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi y/o ER con N- y C-termini frente al lado citoplasmático de la membrana organelástica1. Se cree que los NST transportan azúcares activados por nucleótidos a través de las membranas de orgánulos para suministrar glicosiltransferasas con sus sustratos. Los NST forman dímeros y/o oligómeros superiores2,3,4,5,6,7,8,9,10. Además, también se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST6,11. También se demostró que los NST forman complejos con enzimas de glicosilación funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos una alternativa a la técnica utilizada actualmente, el enfoque FRET basado en imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM), para estudiar las interacciones de los NST y las proteínas residentes de Golgi funcionalmente relacionadas, por lo que decidimos probar el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Nos permitió identificar una nueva interacción entre un NST y una enzima de glicosilación funcionalmente relacionada9.
La modificación más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida, NanoBiT, se utiliza en el protocolo presentado aquí15. Se basa en la reconstitución de la enzima luciferasa (por ejemplo, NanoLuc) de los dos fragmentos: el grande, denominado como BiT grande o LgBiT, una proteína de 17,6 kDa, y el pequeño, compuesto de solo 11 aminoácidos, denominado BiT pequeño o SmBiT. Las dos proteínas de interés se fusionan con los fragmentos complementarios y se expresan transitoriamente en una línea celular humana. Si las dos proteínas de fusión interactúan, se produce una luminiscencia in situ tras la adición de un sustrato permeable a la célula. Estos dos fragmentos han sido optimizados para que se asocien con una afinidad mínima a menos que se unan mediante una interacción entre las proteínas de interés a las que se fusionan.
En general, los métodos basados en bioluminiscencia tienen algunas ventajas sobre los basados en la fluorescencia. Las señales bioluminiscentes tienen una mayor relación señal-ruido porque la luminiscencia de fondo es insignificante en comparación con la señal derivada de la luciferasa16. En contraste, los enfoques basados en la fluorescencia generalmente sufren de un fondo relativamente alto causado por el fenómeno de la autofluorescencia. Además, la bioluminiscencia es menos perjudicial para las células analizadas que la fluorescencia, ya que en el primer caso no hay necesidad de excitar la muestra. Por esas razones, los enfoques bioluminiscentes para estudiar los IBP in vivo superan a los métodos fluorescentes comúnmente utilizados como la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) o la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC).
Nuestro protocolo se basa en referir la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés a la luminiscencia obtenida para la combinación de control. Este último incluye la de las proteínas probadas que se fusiona con un fragmento más grande y una proteína de control (por ejemplo, HaloTag), fusionada con un fragmento más pequeño. Esta última es una proteína de origen bacteriano que no se espera que interactúe con ninguna de las proteínas de mamíferos. El uso de esta proteína como control plantea limitaciones a la topología de los pares de proteínas residentes de Golgi a analizar. Dado que en las células de mamíferos esta proteína se sintetiza en el citoplasma, ambas proteínas de interés deben tener al menos una cola citoplasmática.
Este enfoque puede ser particularmente útil para el cribado inicial de IBP. Puede convertirse en el método de elección cuando las proteínas de fusión de interés se expresan a niveles que son simplemente insuficientes para que se apliquen otros enfoques. Del mismo modo, el ensayo de complementación de luciferasa dividida puede ser la mejor opción si las proteínas de interés se expresan en niveles altos, pero esto afecta negativamente su localización subcelular o se sabe que fuerza interacciones no específicas. Dado que el fragmento más pequeño tiene solo 11 aminoácidos, el ensayo de complementación de luciferasa dividida se puede aplicar cuando el uso de etiquetas más grandes es imposible. Finalmente, se puede emplear para confirmar aún más los datos obtenidos utilizando otras técnicas, como en el caso presentado aquí.

<table><tbody><tr><td>Solución de tripsina-EDTA al 0,25% Línea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>celular de mamíferos adherente</td></tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lisina 96 pocillos Blanco/Transparente Fondo plano Microplaca tratada con TC, con tapa</td><td>Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de cultivo celular</tr><tr><td>Suplementos de cultivo celular (suero bovino fetal inactivado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptamicina)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Expresión de plásmidos que codifican proteína(s) de interés no marcados con fragmentos</td><td></td><td></td><td></td>de NanoBiT</tr><tr><td>Reactivo de transfección FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Lector de microplacas (o un lector de microplacas de luminiscencia diferente)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento dedicado a la línea celular utilizada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiales y reactivos para la clonación molecular estándar (bacterias, polimerasa termoestable, enzimas de restricción, ADN ligasa, materiales y reactivos para la purificación de ácidos nucleicos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT MCS Starter System</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>Este kit contiene vectores que permiten el marcaje de las proteínas de interés con fragmentos de NanoBiT en diferentes orientaciones, así como el plásmido de control que codifica la proteína HaloTag fusionada con SmBiT y un par de plásmidos de control positivo.</td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de células vivas Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>Este kit contiene furimazina, que es un sustrato que permite la detección de la actividad de NanoLuc en células vivas, y un tampón de dilución dedicado.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital Agitador</td><td></td><td></td><td></td></tr> Software <tr><td>para el análisis de datos (p. ej., GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo iii residentes de golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

El objetivo de este protocolo es explorar la aplicabilidad de la variante más reciente de complementación de luciferasa dividida para demostrar complejos heterólogos formados por transportadores de azúcar de nucleótidos (NST). Estas proteínas multitransmembrana residentes en ER y Golgi transportan los azúcares nucleótidos sintetizados citoplasmáticamente a través de las membranas de orgánulos para suministrar enzimas que median la glicosilación con sus sustratos. Los NST existen como dímeros y/oligómeros superiores. También se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST. Para verificar si la técnica es adecuada para estudiar el fenómeno de heteromerización de NST, la probamos contra una combinación de los dos NST residentes en Golgi que previamente se ha demostrado que se asocian por varios otros medios. El ensayo de complementación con luciferasa parece ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana residentes en Golgi, ya que no requiere altos niveles de expresión, que a menudo desencadenan una mala localización de las proteínas y aumentan el riesgo de falsos positivos.

Para obtener los datos más fiables en este enfoque se deben probar todas las combinaciones posibles (ver Figura 1). Paralelamente, deben incluirse controles positivos y negativos. El control positivo debe consistir en las dos proteínas que se sabe que interactúan, de las cuales una está fusionada con el fragmento más grande y la otra está fusionada con el fragmento más pequeño. El control negativo idealmente debería consistir en las dos proteínas de membrana de tipo III que no interactúan et...

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Nuestro protocolo permite identificar y analizar las interacciones entre proteínas multi transmembrana del retículo endoplásmico y el complejo de Golgi en células vivas a bajos niveles de expresión. La principal ventaja de esta técnica es que tiene una sensibilidad especial, lo que permite evitar altos niveles de sobreexpresión que a menudo son perjudiciales para la salud celular y pueden alterar la localización subcelular de las proteínas. Recoja el cultivo de células T HEK293 adherentes mediante tripsinización y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento completo dedicado.Coloque las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo blanco y fondo transparente. Ajuste el número total de pozos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas. Luego, cultive las células durante la noche en condiciones estándar.Al día siguiente, transfecte las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión. Diluya los plásmidos en un medio sin suero a 6,25 nanogramos por microlitro para cada construcción y agregue el reactivo de transfección a base de lípidos. Agregue una proporción adecuada de lípidos a ADN.Incube los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, agregue ocho microlitros de la mezcla de ADN lipídico a los pocillos designados. Mezcle el contenido de la placa con una rotación suave y cultive las células durante 20 a 24 horas en condiciones estándar.Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado en cada pocillo con 100 microlitros de un medio libre de suero, asegurándose de que las células no se desprendan al intercambiar el medio. Justo antes de medir la luminiscencia, mezcle un volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución. Agregue 25 microlitros de la solución de trabajo de furimazina en cada pocillo y mezcle suavemente el plato a mano o con un agitador orbital.Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia y equilibre la placa a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Seleccione los pozos a analizar y lea la luminiscencia con un tiempo de integración de 0,3 segundos. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta dos horas cuando sea necesario.Este protocolo se probó en dos transportadores de nucleótidos de azúcar, SLC35A2 y SLC35A3, que son proteínas de membrana de tipo tres residentes en Golgi con los extremos N y C frente al citoplasma. Había ocho opciones de marcaje posibles, y las proteínas de fusión resultantes podían unirse de ocho maneras posibles. Aquí se muestran las unidades de luminiscencia relativa medias o los valores de RLU correspondientes a todas las combinaciones probadas y de control.Los valores de RLU obtenidos para tres de las combinaciones fueron significativamente más altos que los obtenidos para la combinación de control correspondiente. Para obtener los valores de razón para las combinaciones de interés, los valores de RLU se dividieron por los valores de RLU obtenidos para los respectivos controles. Las proporciones entre 10 y 1000 son altamente indicativas de interacciones específicas.Había dos combinaciones de este tipo que apoyaban la idea de que SLC35A2 y SLC35A3 interactúan. Para confirmar estos datos, los SLC35A2 o SLC35A3 marcados con HA se coexpresaron con la combinación que dio como resultado la luminiscencia relativa más alta. Se utilizaron cantidades variables de los plásmidos y variantes codificantes de NST marcadas con HA para la cotransfección, lo que resultó en una disminución estadísticamente significativa dependiente de la dosis en los valores de RLU.Lo más importante es abordar su propio interés por las proteínas de todas las formas posibles y analizar todas las combinaciones posibles, ya que algunas orientaciones de etiquetado pueden producir resultados falsos negativos. Una vez que se ha seleccionado la combinación de mejor rendimiento, se puede monitorear la dinámica de la interacción correspondiente para, por ejemplo, identificar agentes o condiciones que interrumpan su complejo de interés con el tiempo.

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Investigación

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Biología

Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble GloTM ensayo luciferasa de Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Un procedimiento eficaz para evaluar la propensión de oligomerización dominios transmembrana de un solo paso (TTM) se describe. Proteínas quiméricas que consiste en la DTM fundido a toxR se expresan en una cepa de E. coli reportero. TMD inducida por oligomerización causas dimerización de toxR, activación de la transcripción y la producción de la proteína reportera,-galactosidasa.

Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR

Hemos desarrollado un ensayo de fusión celular que cuantifica SNARE mediada por los acontecimientos de fusión de membrana por la expresión activa de β-galactosidasa.

Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática

Este video muestra el ensayo de complementación de luciferasa dividida para detectar interacciones proteína-proteína. En este ensayo, las proteínas de interés se marcan con fragmentos pequeños y grandes de la enzima luciferasa. Cuando las proteínas interactúan, los fragmentos grandes y pequeños se combinan para formar un complejo enzimático activo, que en presencia de un sustrato específico, libera una luminiscencia brillante que se puede medir.

Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

La localización precisa de los residentes de Golgi es esencial para la comprensión de las funciones celulares de lo Golgi. Sin embargo, la microscopía óptica convencional es incapaz de resolver la estructura sub-Golgi. Aquí describimos el protocolo para un método de súper-resolución microscopia convencional basado determinar cuantitativamente la localización sub-Golgi de una proteína.

Localización cuantitativa de una proteína de Golgi por su masa centro de fluorescencia de imagen

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.

Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)

Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Aprende a detectar interacciones entre proteínas de membrana tipo III del Golgi en células HEK293 vivas mediante el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Este método sensible permite identificar complejos heterólogos sin efectos nocivos por sobreexpresión.

Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida (Video) | JoVE Journal

Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

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