Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones
1 de mayo de 2021
Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento y la amplificación de las bacterias conjuntivales anaerobias aeróbicas y facultativas del ratón usando una hisopo ocular única y un paso de enriquecimiento basado en la cultura con la identificación posterior por métodos basados microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.
Este método identifica los microorganismos conjuntivales oculares viables, que es desafiando debido al ambiente hostil de los ojos. Puede ayudar a responder si existe un microbioma ocular y cómo cambia la presencia bacteriana en la enfermedad ocular. En contraste con la secuenciación de ADN, que identifica microorganismos viables e inviables, este método identifica solo microorganismos viables, lo que resulta en una comprensión más clara de la comunidad comensal ocular.
Los estudios sugieren que las enfermedades oculares difíciles de diagnosticar tales como ojo seco no autoinmune y autoinmune tengan presencia bacteriana ocular única. Este método se podía utilizar para diagnosticar enfermedades de ojo con las firmas microbianas distintivas. Comience por autoclave de la cantidad adecuada de bateo de algodón y palillos de dientes para el número de ratones a ser hisopados, a continuación, pellizcar 1/2 un centímetro de largo pedazo de algodón de bateo y burlarse tirando de los bordes para formar una sola capa porosa plana que se detiene justo antes de que el bateo se deshace.
Gire el bateo alrededor de uno de los extremos afilados del palillo de dientes sosteniendo ligeramente la pieza estirada en la punta del palillo de dientes a medida que se tuerce. El hisopo de ojo terminado tendrá una capa muy delgada de algodón estirada sobre la punta que se extiende aproximadamente 1/2 a un centímetro de distancia de la punta. Inserte los hisopos en un pequeño casto, haga un hisopo lateral hacia abajo y luego cúbralos y autoclave.
Limpie el área de trabajo con un desinfectante para minimizar la contaminación y alícuota 0.5 mililitros de infusión estéril de corazón cerebral, o medios BHI en tubos de microcentrifugación estériles etiquetados de 1.5 mililitros. Tapar los tubos en un rack y poner el rack en hielo. Configure el flujo de trabajo de izquierda a derecha comenzando con la estación de anestesia del ratón, que contiene la jaula con los ratones experimentales, la jaula estéril vacía, la anestesia a temperatura ambiente, la aguja calibre 25 y una jeringa de un mililitro.
A continuación, prepare una estación de hisopado ocular que contenga el IMC alícuota en el hielo, hisopos oculares esterilizados, gotas lubricantes para los ojos, recipientes de riesgo biológico, toallas de papel limpias y aerosol de isopropanol al 70%. Finalmente, configure la estación de chapado con placas de agar sangre a temperatura ambiente, una pipeta de 10 microlitr, 10 puntas desechables estériles de microlitro y un contenedor de residuos de riesgo biológico. Asegúrese de que el ratón está correctamente anestesiado apretando una almohadilla del pie trasero.
Sólo proceder si no hay movimiento. Asigne una mano para manejar ratones anestesiados y las otras manos para manejar el hisopo del ojo y la cultura. Retire el ratón de la jaula y colóelo encima de la superficie de trabajo colocada de lado con el ojo izquierdo expuesto.
Rocíe las manos enguantadas con isopropanol y séquelas con una toalla de papel. Descapspeje el tubo de micro centrífuga BHI etiquetado con la mano de manejo de medios dedicada y coloque los dos de nuevo en el rack. Sumerja la punta recubierta de algodón del hisopo ocular en el IMC, luego retire el hisopo del tubo mientras arremolina la punta dos veces contra el tubo interno para eliminar el exceso de líquido y eliminarlo.
Con la mano de manejo del ratón, sostenga suavemente el ratón por el desaliño del cuello. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo. Deprima ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo en un movimiento de lavado de ventanas entre el párpado inferior y el ojo 10 veces, manteniendo una presión constante.
Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo perpendicular a donde se insertó. Coloque el lado de algodón hisopo hacia abajo, directamente en un tubo de micro centrífuga etiquetado con medios BHI. Aplique una gota para los ojos en el ojo hisopado.
Si lo desea, adquiera hisopos de piel o piel para muestras de control, esterilizando los guantes adecuadamente entre cada hisopo. Cuando haya terminado, devuelva el ratón a la jaula. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos sobre hielo, luego esterilice las manos enguantadas y retire el hisopo mientras mezcla la punta en el medio durante 10 rotaciones.
Retire el hisopo arremolinando la punta contra la pared interna del tubo durante cinco rotaciones y deséchelo en un recipiente de riesgo biológico. Repita el proceso para cada ratón. Enriquezca la muestra incubando el tubo estáticamente durante una hora a 37 grados Centígrados.
Durante la incubación, etiquete una placa de TSA a temperatura ambiente por hisopo de ojo de ratón o controle el hisopo y divídalo por la mitad. Retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelas en hielo. Brevemente vórtice las muestras a mezclar, luego alícuota 10 microlitros de la muestra en la placa TSA e incline la placa para formar una tira.
Repita esto dos veces. En el otro lado de la línea divisoria de placas, cree 10 puntos con 10 microlitros de muestra cada uno. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 18 horas, dos días y cuatro días en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen.
Cuente las colonias en las tiras. Tenga en cuenta la morfología y calcule las unidades formantes de colonias por hisopo para aislados morfológicamente similares. Mira los puntos donde los organismos únicos no son capturados en las tiras.
Para facilitar la visualización, plateamos las bacterias densamente en las placas central y derecha. Típicamente, observamos muchas menos bacterias en las placas de hisopos oculares. Tenga en cuenta que en ocasiones, los hisopos oculares pueden no producir bacterias recuperables.
Una placa representativa de la hisopo del ojo con aislantes morfológicamente diversos de un ratón negro C57 seis se muestra aquí. Para cada aislante distinto, las colonias fueron contadas en la tira y la abundancia relativa fue calculada y trazada. Para la caracterización microbiológica, las bacterias se seleccionaron de placas individuales de hisopo de ojo de ratón para producir una placa maestra de TSA.
Cuando apareció el crecimiento, se realizaron pruebas adicionales para caracterizar o identificar los microbios. La placa maestra fue utilizada para proporcionar bastante inóculo para ampliar los aislantes respectivos. Para identificar aislantes, una placa de TSA fue rayada e incubada durante la noche, y el ms de MALDI-TOF fue realizado.
Los ejemplos de aislantes mostrados aquí fueron identificados como estreptococo acidominimus y viridans de Aerococcus. Niveles perceptiblemente diversos de organismos commensales fueron recuperados de los ratones negros masculinos y femeninos C57 seis. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagula estafilococos negativos y E.coli se aislaron de C57 negro seis ratones N.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el mejor resultado se logrará recubriendo el hisopo finamente y tomando tiempo durante el paso del hisopo ocular. Si el acceso a MALDI-TOF MS es limitado, entonces los aislados pueden ser identificados por pruebas microbiológicas y bioquímicas.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para aislar y amplificar bacterias comensales aeróbicas y anaeróbicas facultativas de la conjuntiva de ratón. Emplea un paso único de hisopado ocular y enriquecimiento basado en cultivo, seguido de la identificación mediante métodos microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Oftalmología
- Bacterias comensales
Antecedentes
- La identificación de microorganismos viables en la conjuntiva ocular es difícil debido al entorno hostil del ojo.
- Este método se centra en microorganismos viables, lo que proporciona una comprensión más clara de la comunidad microbiana comensal ocular.
- Podrían existir firmas bacterianas únicas asociadas con enfermedades oculares de difícil diagnóstico.
- El método contrasta con la secuenciación de ADN, que detecta tanto microorganismos viables como no viables.
Objetivo del estudio
- Determinar la existencia de un microbioma ocular.
- Investigar cómo cambia la presencia bacteriana en las enfermedades oculares.
- Desarrollar un método diagnóstico para enfermedades oculares basado en firmas microbianas.
Métodos Utilizados
- Esterilización en autoclave de algodón cardado y palillos para hisopar ratones.
- Hisopado del área conjuntival de ratones con algodón cardado preparado.
- Enriquecimiento basado en cultivo de bacterias aisladas.
- Identificación de bacterias mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.
Resultados Principales
- Se identificaron con éxito microorganismos viables a partir de muestras conjuntivales de ratón.
- El método proporcionó información sobre la comunidad microbiana comensal ocular.
- Se sugirieron posibles vínculos entre la presencia bacteriana y enfermedades oculares.
- Este enfoque podría mejorar el diagnóstico de enfermedades oculares con firmas microbianas distintivas.
Conclusiones
- El protocolo aísla y detecta eficazmente microorganismos oculares viables.
- Ofrece una comprensión más clara del microbioma ocular en comparación con los métodos tradicionales.
- Este método podría ser fundamental para diagnosticar enfermedades oculares basándose en perfiles microbianos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar bacterias comensales oculares viables permite la validación de objetivos en modelos preclínicos de enfermedades oculares al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad con el fin de monitorear cambios microbianos. Este método apoya la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir microorganismos vivos de muertos, mejorando la confianza predictiva en el descubrimiento de biomarcadores. Posiciona el perfilado microbiológico como una herramienta traslacional para reducir riesgos en hipótesis terapéuticas dentro de las líneas de desarrollo en oftalmología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de microorganismos conjuntivales viables en diferentes condiciones de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona un método basado en cultivo para definir la diversidad de microorganismos comensales en ratones, apoyando la desestimación biológica de dianas oculares.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al vincular firmas microbianas con estados patológicos, mejorando la confianza en las dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para procesos posteriores mediante el enriquecimiento de géneros aeróbicos y anaeróbicos facultativos a partir de muestras oculares.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante una técnica basada en hisopos con pasos controlados de enriquecimiento y siembra.
- Escalabilidad: Destaca el potencial de reutilización de la plataforma para monitorear cambios microbianos en diferentes grupos experimentales y modelos de enfermedades.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad al vincular la presencia única de bacterias con enfermedades oculares de difícil diagnóstico, como el ojo seco autoinmune y no autoinmune.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el monitoreo longitudinal de la microbiota ocular.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya decisiones basadas en firmas microbianas, alineándose con estrategias de alineación de biomarcadores traslacionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento hasta la validación preclínica, apoyando la identificación de compuestos activos mediante el perfilado microbiano.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de microorganismos viables para clarificar la participación de vías en la inmunidad de la superficie ocular.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante enriquecimiento basado en cultivo y resultados cuantitativos como unidades formadoras de colonias por hisopo.
- Análisis: Destaca mediciones como la morfología, la abundancia relativa y la identificación mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que ayudan a los equipos a comparar condiciones entre grupos.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al permitir el monitoreo de cambios microbianos en modelos de enfermedad, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para el perfilado microbiológico en diversos modelos de enfermedades oculares, y no como una técnica de uso único.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en estudios del microbioma ocular.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de bacterias viables a partir de muestras oculares de baja abundancia.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en etapas avanzadas en programas de oftalmología.
- Impacto en el portafolio: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en firmas microbianas asociadas a fenotipos de enfermedades.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos obligatorios en técnicas microbiológicas, manejo de cultivos anaeróbicos y operación de espectrometría MALDI-TOF.
- Los requisitos de instrumentación e infraestructura analítica incluyen autoclave, incubadora, equipos para siembra en placas y espectrometría de masas para identificación.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la preparación de hisopos, los tiempos de enriquecimiento y la uniformidad en la siembra entre diferentes usuarios.
- Consideraciones para la adaptación en distintos sistemas modelo, incluyendo posibles ajustes según especies diferentes o la accesibilidad de la superficie ocular.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: baja recuperación de bacterias, fallos ocasionales en el aislamiento de cepas y dependencia de una técnica adecuada de hisopado.
