Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular
6 de agosto de 2020
Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.
Este ensayo de coroides es altamente reproducible y pertinente para la investigación de la angiogénesis coroidea y la degeneración macular relacionada con la edad, DMAE, y puede complementar los estudios in vivo del comportamiento microvascular. Este ensayo se puede utilizar para seleccionar compuestos como posibles tratamientos para la DMAE neovascular o para evaluar las vías implicadas en la neovascularización coroidea utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente. Para comenzar, agregue cinco mililitros de penicilina, estreptomicina y 10 y cinco mililitros de suplementos disponibles comercialmente hasta 500 mililitros de medio clásico completo con suero, luego alícuotas 50 mililitros del medio, descongele el extracto de membrana basal o BME durante la noche en un refrigerador a dos a ocho grados centígrados.
Ponga una alícuota de medio clásico completo sobre hielo. Limpie el microscopio de disección, las pinzas y las tijeras con etanol al 70%. Preparar placas de cultivo celular y colocar una en el microscopio de disección y la otra en hielo.
A continuación, añade 10 mililitros de medium clásico completo a cada plato. Mantenga los ojos en medio clásico completo en hielo antes de la disección. Retire el tejido conectivo y el nervio óptico y luego use una microtijera para cortar circunferencialmente 0,5 milímetros detrás del limbo corneal.
Retirar la córnea del complejo iris, vítreo y hasta el cristalino. Hacer una incisión de un milímetro perpendicular al borde cortado hacia el nervio óptico y cortar una banda circunferencial de un milímetro de ancho, luego separar las regiones central y periférica del complejo. Use fórceps para pelar la retina del complejo esclerótico coroideo del EPR.
Mantenga la banda periférica de la coroides en un medio clásico completo sobre hielo. Aísla el otro ojo y repite el proceso para cortar una segunda banda. Corta la banda circular en cinco o seis piezas cuadradas aproximadamente iguales.
Agregue 30 microlitros de BME descongelado en el centro de cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forme una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes. Coloque el pañuelo en el centro del BME.
No aplanar la planta de coroides X. Deje que el tejido se expanda dentro del BME. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos para que el gel se solidifique, luego agrega 500 microlitros de medio clásico completo en cada pocillo.
Cambia el medio clásico cada dos días. La brotación de la coroides se puede observar después de tres días con un microscopio. Abra la imagen de brote de coroides con la imagen J y verifique la imagen, el tipo y ocho bits con escala de grises.
A continuación, optimice el contraste seleccionando la imagen, ajuste, el contraste de brillo y ajustándolo. Utilice la función de varita mágica para delinear y eliminar el tejido coroideo que está presente en el centro de los brotes. Elimina el fondo de la imagen con las herramientas de selección gratuitas.
A continuación, vaya a la imagen, ajuste el umbral y use la función de umbral para definir los brotes microvasculares en el fondo en la periferia. Haga clic en F2 y aparecerá un resumen. Haga clic en Guardar para guardar una imagen del área seleccionada en la misma carpeta que la imagen original para futuras referencias.
Después de medir un grupo de muestras, copie los datos registrados para su análisis. Este protocolo se utilizó para examinar y cuantificar la brotación de la coroides en ratones C 57, seis J negros desde el día tres hasta el día seis. En un caso representativo, el área de brotación coroidea fue de 0,38, 1,47, 5,62 y 10,09 milímetros cuadrados a los días tres, cuatro, cinco y seis, respectivamente.
Los efectos de la pérdida de FFAR4 sobre la brotación vascular coroidea se evaluaron utilizando el ensayo de brotación coroidea en ratones FFAR4 cuatro knockout y FFAR4 de tipo salvaje. El área de germinación en los ratones knockout de FFAR4 aumentó el crecimiento vascular coroideo en comparación con el tipo salvaje de FFAR4 al sexto día. Además, el tratamiento con un agonista micromolar de FFAR4 redujo el área de brotación coroidea en comparación con los ratones no tratados al sexto día.
Este ensayo permite evaluar de forma reproducible el potencial antiangiogénico de los compuestos farmacológicos y la variación del papel de una vía específica en la neovascularización coroidea utilizando tejido de ratón modificado genéticamente.
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Resumen
Este protocolo presenta un ensayo de brotamiento coroideo como un modelo ex vivo para estudiar la proliferación microvascular, específicamente en relación con la angiogénesis coroidea y la degeneración macular relacionada con la edad de tipo neovascular (DMAE). El ensayo permite la evaluación de las vías implicadas en la proliferación de microvasos coroideos y la valoración de tratamientos farmacológicos utilizando tejidos de ratón tanto de tipo silvestre como modificados genéticamente.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Angiogénesis coroidal
- Degeneración macular relacionada con la edad (AMD)
- Comportamiento microvascular
Antecedentes
- Importancia de la angiogénesis coroidea en las enfermedades oculares
- Modelos ex vivo que complementan los estudios in vivo
- Modelos de ratones modificados genéticamente para obtener conocimientos más profundos
Métodos Utilizados
- Ensayo de brotamiento coroideo
- Uso de tejidos de ratón de cepas silvestres y modificadas genéticamente
- Microscopía para observar el brotamiento coroideo
Resultados principales
- El ensayo permite mediciones reproducibles del brotamiento coroideo durante varios días
- La pérdida de FFAR4 en ratones knockout incrementó el crecimiento vascular coroideo en comparación con el tipo salvaje
- El tratamiento con agonista de FFAR4 redujo el área de brotamiento coroideo en ratones knockout
Conclusiones
- El estudio demuestra la eficacia del ensayo para evaluar el potencial antiangiogénico de compuestos farmacológicos
- Destaca el papel de vías de señalización específicas en la neovascularización coroidea
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de brotamiento coroideo *ex vivo* proporciona un modelo reproducible para evaluar la proliferación microvascular coroidea, directamente relevante para el descubrimiento de fármacos contra la degeneración macular asociada a la edad de tipo neovascular (DMAE). Permite la desvinculación mecanicista de las vías angiogénicas mediante tejidos de ratón silvestres y modificados genéticamente, apoyando la validación de dianas y la identificación de compuestos prometedores en las líneas de investigación oftalmológica. El ensayo conecta la biología del descubrimiento con la evaluación preclínica al cuantificar la dinámica de brotamiento en un sistema de explante tisular fisiológicamente relevante.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición del brotamiento coroideo en respuesta a la modulación genética o farmacológica de vías angiogénicas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas como FFAR4 en un contexto tisular multicelular que incluye endotelio, macrófagos, pericitos y epitelio pigmentario de la retina (RPE).
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar los efectos dependientes de la dosis de compuestos sobre el brotamiento microvascular a lo largo del tiempo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en imágenes del área de brotación que reflejan la formación de redes microvasculares bajo condiciones controladas.
- Valor operativo: Utiliza un protocolo estandarizado de siembra de explantes en matriz de BME con factores de crecimiento reducidos y horarios definidos de cambio de medio, para garantizar la reproducibilidad entre experimentos.
- Escalabilidad: Compatible con el formato de placas de 24 pocillos y con análisis semiautomatizado mediante ImageJ, adecuado para cribado de compuestos en medio a alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la arquitectura nativa coroidea-RPE-escleral, preservando las interacciones célula-célula fundamentales para modelar la angiogénesis fisiopatológica.
- Valor operativo: Permite la comparación directa de tejidos de tipo salvaje y tejidos con genes eliminados (por ejemplo, FFAR4) para aislar las contribuciones genéticas a los fenotipos de brotamiento.
- Valor predictivo: Permite evaluar los efectos de agonistas/antagonistas sobre el brotamiento, proporcionando evidencia preclínica de la modulación de vías.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la continuidad del descubrimiento en oftalmología, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente para estrategias antiangiogénicas en la DMAE.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre reguladores angiogénicos mediante la cuantificación de cambios en la formación de brotes en respuesta a la inhibición o activación de vías.
- Selección: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles de brotamiento que permiten ordenar por rango los efectos de compuestos en un formato basado en tejidos.
- Análisis: Ofrece mediciones temporales basadas en áreas (por ejemplo, del día 3 al día 6) que facilitan el análisis cinético de las respuestas microvasculares.
- Investigación Traducional: Utiliza explantes relevantes para la enfermedad para modelar la neovascularización coroidea, facilitando la extrapolación a modelos in vivo de DMAE.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable para evaluar múltiples compuestos o modelos genéticos en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con resultados cuantificables de brotamiento en un contexto de tejido nativo.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de aislamiento de tejidos, siembra en matriz de matriz extracelular (BME), cambio de medio e imágenes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia temprana, basada en tejidos, de actividad antiangiogénica antes de las pruebas in vivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en datos de respuesta a la dosis y validación genética.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos murinos y aislamiento de explantes bajo condiciones estériles.
- Depende del acceso a extracto de membrana basal con reducción de factores de crecimiento (BME) y microscopía de contraste de fase.
- Necesita protocolos estandarizados de análisis de imágenes (por ejemplo, macro de ImageJ) para una cuantificación consistente del brotamiento.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en el tamaño del explante y la viabilidad del tejido al interpretar las métricas de brotamiento.
- Limitado a tejido murino; las diferencias entre especies pueden afectar la traslación a la biología coroidea humana.
