Name: Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende el ensayo ex vivo de brotes de coroides para estudiar la angiogénesis microvascular ocular y la degeneración macular asociada a la edad. Este método permite evaluar compuestos farmacológicos antiangiogénicos.

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El trabajo fue apoyado por Grants de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship y Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en boston Children's Hospital (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparación
<ol><li>Añadir 5 ml de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) y 5 ml y 10 ml de suplementos disponibles comercialmente a 500 ml de medio clásico completo con suero. Aliquot 50 mL del medio inicialmente. NOTA: No devuelva ningún medio a la población para evitar la contaminación.</li>
	<li>Ponga una alícuota de medio clásico completo sobre hielo.</li>
	<li>Use 70% de etanol para limpiar el microscopio de disección, los fórceps y las tijeras.</li>
	<li>Preparar dos platos de cultivo celular (10 cm), uno en el microscopio de disección, otro sobre hielo; poner 10 ml de medio clásico completo en cada plato.</li>
</ol>2. Pasos experimentales (Figura 1)
<ol><li>Sacrificar ratones C57BL/6J alrededor del postnatal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de ketamina y 7,5 -10 mg/kg de xiazina inyectada intraperitonealmente. Mantenga los ojos en medio clásico completo sobre hielo antes de la disección.</li>
	<li>Retire el tejido conectivo (músculo y tejido graso) y el nervio óptico en el ojo.</li>
	<li>Utilice una micro-tijera para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior al limbo corneal. Retire el complejo de córnea/iris, el vítreo y la lente.</li>
	<li>Haga una incisión de 1 mm perpendicular al borde de corte hacia el nervio óptico y corte una banda circunferencial de 1 mm de ancho. Separe las regiones central y periférica del complejo. Use fórceps para despegar la retina del complejo RPE/coroide/sclera.</li>
	<li>Mantener la banda coroidea periférica en medio clásico completo sobre hielo; aislar el otro ojo y repetir el proceso para cortar una segunda banda.</li>
	<li>Cortar la banda circular en piezas cuadradas iguales a 6o (1 mm x 1 mm). NOTA: Nunca toque ningún borde.</li>
	<li>Descongelar el extracto de membrana basal (BME) por instrucción de fabricación. Añadir 30 l/pozo de BME en el centro de cada pocómo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forma una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes. NOTA: Descongele el BME durante la noche en un refrigerador. BME debe estar en el hielo en cualquier momento después de descongelar.</li>
	<li>Coloque el tejido en el centro de la BME. NOTA: No aplanar el explano coroides; generalmente, deje que el tejido se expanda dentro de la BME. La orientación del tejido (lado escleral hacia arriba o hacia abajo) no afecta el resultado experimental.</li>
	<li>Incubar la placa a 37oC durante 10 min para dejar que el gel se solidifique.</li>
	<li>Añadir 500 l del medio/pozo clásico completo.</li>
	<li>Cambie el medio clásico cada dos días (500 l). La brotación de coroide se puede observar después de 3 días con un microscopio. NOTA: Para el tratamiento del factor de crecimiento, muera de hambre el tejido durante 4 h. Diluir un compuesto de ensayo en medio reducido por factor de crecimiento (1:200 impulso en lugar de 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-Método de cuantificación computarizada Choroid17 (Figura 2)
NOTA: Se utilizó un método computarizado para medir el área cubierta por los buques en crecimiento. Se necesita un plugin de macro para el software ImageJ antes de la cuantificación (consulte Información complementaria para obtener más detalles).
<ol><li>Abra la imagen de brotación de coroides con ImageJ y marque "Imagen | Tipo| 8 bits" con escala de grises.</li>
	<li>Vaya a"| de imagen Ajustar | Brillo/Contraste (Ctrl/shift/C)" y optimizar el contraste.</li>
	<li>Utilice la función de varita mágica para perfilar y eliminar de la imagen el tejido coroides que está presente en el centro de los brotes (utilizando la tecla de método abreviado "F1") (Figura 2A,B). NOTA: Establezca la tasa de tolerancia de la varita mágica en 20-30%.</li>
	<li>Elimine el fondo de la imagen con las herramientas de selección gratuitas (Figura 2C). Vaya a"| de imagen Ajustar | Umbral (Ctrl/shift/T)". Utilice la función de umbral para definir los brotes microvasculares en el fondo y la periferia (Figura 2D).</li>
	<li>Haga clic en "F2" y aparecerá un resumen. Guarde una imagen del área seleccionada haciendo clic en "Guardar". Guarde en la misma carpeta que la imagen original para futuras referencias.</li>
	<li>Después de medir un grupo de muestras, copie el registro para el análisis de datos. NOTA: También es posible medir el área (m2) por"Analizar | Establezca Escala" utilizando imágenes con barras de escala.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen revelaciones financieras. El método informatizado está disponible de forma gratuita para las instituciones académicas a través de los autores.

El ensayo coral de brotes ayuda a la investigación en NEOvascular AMD9,10,18,19,20. Los explantes de coroide se pueden aislar de ratones, así como ratas y humanos17,21. El explanto coroides incluye ECs, macrófagos y pericitos17. En este ensayo la interacción entre las CE coroida...

La desregulación de la angiogénesis coroidal se asocia con la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD)1. La coroides es un lecho microvascular presente debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Se ha demostrado que la reducción del flujo sanguíneo en la coroides se asocia con la progresión de AMD2. La intrincada relación entre el endotelio vascular, RPE, macrófagos, pericitos y otras células es responsable de la homeostasis del tejido3,4,5. Por lo tanto, un ensayo reproducible que modela el microambiente coroideo es fundamental para el estudio de la DMAE neovascular.
Los ensayos de angiogénesis ex vivo y los cultivos celulares endoteliales in vitro pueden complementar los estudios del comportamiento microvascular in vivo, para la prueba de nuevos fármacos y para estudios de patogénesis. Células endoteliales tales como células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), cerebro animal primario aislado o EC de la retina se utilizan a menudo en estudios in vitro para la investigación de la angiogénesis ocular6,7,8. Los HDH, en particular, se han utilizado ampliamente como modelo de neovascularización coroidal in vitro (CNV)9 mediante la evaluación de la proliferación endotelial, la migración, la formación tubular y la fuga vascular para evaluar las intervenciones6,10. Sin embargo, las CE en el cultivo son limitadas como modelo de CNV debido a la falta de interacciones con otros tipos de células que se encuentran en la coroides y porque la mayoría de las CE utilizadas en estos ensayos no se originan en la coroides. Las ECs coroideales de ratón son difíciles de aislar y mantener en el cultivo.
El ensayo de anillo aórtico es ampliamente utilizado como un modelo de proliferación macro vascular. Los brotes vasculares de explantes aórticos incluyen ECs, pericitos y macrófagos11. El ensayo de anillo aórtico modela bien de angiogénesis de vasos grandes12,13,14. Sin embargo, tiene limitaciones como modelo de neovascularización coroidal ya que los anillos aórticos son un tejido macrovascular que carece del entorno microvascular coroidal característico, y los brotes de grandes vasos pueden diferir de los brotes de redes capilares implicadas en la patología microvascular. Recientemente un grupo publicó un ensayo de retina ex vivo15,16. Aunque, es adecuado para la enfermedad neovascular de la retina, no es tan apropiado para la neovascularización coroidal como se ve en la DMAE.
El ensayo coral de brotación utilizando RPE de ratón, tejido coroides y explantado escleral fue desarrollado para modelar mejor el CNV. El tejido se puede aislar fácilmente de los ojos de ratón (u otras especies)17. Este ensayo permite una evaluación reproducible del potencial pro y anti-angiogénico de los compuestos farmacológicos y la evaluación del papel de vías específicas en la neovascularización coroidacional utilizando tejido de ratones modificados genéticamente y controles18. Este ensayo coral de brotación ha sido referenciado en muchas publicaciones posteriores9,10,18,19,20. Aquí se demuestra el método implicado en el uso de este ensayo.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (xilacina)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de membrana basal (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr> Medio <tr><td>clásico completo con suero y CultureBoost</td><td>Sistemas celulares</td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico 200 Proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>uso para el 70% </td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos (24 pocillos)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Ketamina)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

La angiogénesis coroidal patológica, una característica destacada de la degeneración macular relacionada con la edad, conduce a un deterioro de la visión y ceguera. Los ensayos de proliferación de células endoteliales (EC) que utilizan células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMEC) o EC de retina primaria aisladas se utilizan ampliamente en modelos in vitro para estudiar la angiogénesis retiniana. Sin embargo, aislar las células endoteliales de la retina murina pura es técnicamente difícil y las CE de la retina pueden tener diferentes respuestas de proliferación que las células endoteliales coroidales y diferentes interacciones celulares/células. Se desarrolló un ensayo de brotación coroidacional ex vivo altamente reproducible como modelo de proliferación microvascular coroidal. Este modelo incluye la interacción entre la vasculatura coroides (EC, macrófagos, pericitos) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los explantes de RPE/coroide/escleral de ratón se aíslan e incuban en el extracto de membrana basal (BME) con factor de crecimiento reducido (BME) (día 0). El medio se cambia cada dos días y la brotación coroides se cuantifica en el día 6. Las imágenes de la explanta de coroides individuales se toman con un microscopio de fase invertida y el área de brotación se cuantifica utilizando un macro plug-in semiautomático para el software ImageJ desarrollado en este laboratorio. Este ensayo de brotación coroidal ex vivo reproducible se puede utilizar para evaluar compuestos para el tratamiento potencial y para la investigación de enfermedades microvasculares para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos coroidacionales utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Comparación del crecimiento de brotes de coroides por día
Diseccionamos la coroides con esclerótica, incrustada en BME y la cultivamos durante 6 días(Figura 1). El coroides que brota en ratones C57BL/6J desde el día 3 hasta el día 6 fueron examinados con un microscopio y cuantificados con SWIFT-Choroid un método de cuantificación semiautomático en ImageJ. En un caso representativo, la zona de brotación coroidal (los vasos que se extienden desde el...

Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Este ensayo de coroides es altamente reproducible y pertinente para la investigación de la angiogénesis coroidea y la degeneración macular relacionada con la edad, DMAE, y puede complementar los estudios in vivo del comportamiento microvascular. Este ensayo se puede utilizar para seleccionar compuestos como posibles tratamientos para la DMAE neovascular o para evaluar las vías implicadas en la neovascularización coroidea utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente. Para comenzar, agregue cinco mililitros de penicilina, estreptomicina y 10 y cinco mililitros de suplementos disponibles comercialmente hasta 500 mililitros de medio clásico completo con suero, luego alícuotas 50 mililitros del medio, descongele el extracto de membrana basal o BME durante la noche en un refrigerador a dos a ocho grados centígrados.Ponga una alícuota de medio clásico completo sobre hielo. Limpie el microscopio de disección, las pinzas y las tijeras con etanol al 70%. Preparar placas de cultivo celular y colocar una en el microscopio de disección y la otra en hielo.A continuación, añade 10 mililitros de medium clásico completo a cada plato. Mantenga los ojos en medio clásico compl

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La córnea es la única que carece de los tejidos vasculares. Sin embargo, el fuerte crecimiento de los vasos sanguíneos y la supervivencia puede ser inducida en la córnea por potentes factores angiogénicos. Por lo tanto, la córnea puede dar con nosotros en una herramienta valiosa para los estudios de angiogénesis. Este protocolo muestra cómo realizar el modelo de ratón de ensayo de córnea bolsillo y la forma de evaluar la angiogénesis inducida por factores angiogénicos utilizando este modelo.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

Este video muestra un ensayo modificado basado en perlas de microportadores que incorpora pericitos para estudiar la germinación endotelial durante las primeras etapas de la angiogénesis. El ensayo proporciona un modelo experimental in vitro para comprender los mecanismos moleculares de la angiogénesis y el efecto de las terapias antiangiogenéticas.

Ensayo de germinación de perlas para la evaluación de la angiogénesis en etapa temprana: un modelo in vitro basado en perlas para estudiar la germinación endotelial en presencia de pericitos

Este video demuestra el desarrollo de un modelo ex vivo de brote coroideo para estudiar la angiogénesis microvascular ocular. El ensayo consiste en cultivar explantes de ojo de ratón que contienen el tejido coroideo unido a la esclerótica y el epitelio pigmentario de la retina en condiciones específicas que promueven la germinación microvascular coroidea.

Ensayo de brotación de coroides para el estudio de la proliferación microvascular ocular ex vivo

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

Angiogénesis implica interacciones multicelulares y multisistémicas que necesitan ser investigadas en un entorno fisiológicamente relevante. El objetivo de este estudio es demostrar la capacidad del modelo de cultivo de mesenterio en rata para realizar comparaciones time-lapse de redes microvasculares intactas durante la angiogénesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Este trabajo presenta un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en los hemangioblastomas (HBs) y su papel en HBs. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta forma común de angiogénesis es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

Este método describe el cultivo de células endoteliales derivadas de iPSC como 40 microvas 3D perfundidas en una plataforma microfluídica estandarizada. Esta plataforma permite el estudio de la brotación angiogénica impulsada por gradientes en 3D, incluyendo anastomosis y estabilización de los brotes angiogénicos de una manera escalable y de alto rendimiento.

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

La angiogénesis germinal, fundamental para el desarrollo y la enfermedad, implica procesos moleculares y mecánicos complejos. Presentamos un modelo ex vivo 2.5D versátil que analiza la germinación celular de las arterias carótidas porcinas, revelando la angiogénesis dependiente de la rigidez y la mecánica distintiva de las células líder-seguidoras. Este modelo ayuda a avanzar en las estrategias de ingeniería de tejidos y los enfoques de terapia contra el cáncer.

Modelo 2.5D para la caracterización mecánica ex vivo de la angiogénesis germinal en tejido vivo

Aprende el ensayo ex vivo de brotes de coroides para estudiar la angiogénesis microvascular ocular y la degeneración macular asociada a la edad. Este método permite evaluar compuestos farmacológicos antiangiogénicos.

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

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